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背景而失去p53功能是一个重要的致癌介入人类肿瘤发生,p53的突变通常被视为迟到事件metaplasia-dysplasia-adenocarcinoma巴雷特食管的序列。最近的报告的一系列基因(p63 p73等)表现出密切的同源性p53提高这些p53的可能性,异常序列中的家庭成员可能施加的影响。
目的后最近的言论描述ΔNp63 p63和主要对碘氧基苯甲醚的一代的一个承认p63亚型的抗血清,但不是p53,我们的目标是一个比较研究p63蛋白和p53蛋白的表达形态定义良好的切片系列的所有阶段的代表metaplasia-dysplasia-carcinoma巴雷特食管的序列。
方法一系列60代表正常食管活检病例通过入侵腺癌是染色,使用免疫组织化学,p63和p53的抗体。所有来自患者内镜活检和组织病理学证实诊断的传统/古典巴雷特食管。
结果有确切的和合p53、p63表达更高级形式的瘤,优质发育不良,和浸润性癌,而p63但不是p53,发现增生性间的一些non-neoplastic食管组织,在non-neoplastic化生鳞状上皮和腺上皮。
结论在肿瘤巴雷特食管有upregulation p63和p53在p63亚型可能上皮生物学中一个重要的角色在non-metaplastic和化生的食管粘膜。虽然异常p53函数代表一个无可争辩的肿瘤转化的关键元素,其他密切相关基因及其蛋白质在生理和病理生理学的食管粘膜。
- p53
- p63
- 免疫组织化学
- 巴雷特食管
- 发育不良
- 腺癌
来自Altmetric.com的统计
相当大的数据的地方p53肿瘤抑制基因的突变失活致癌途径中的一个关键元素,导致癌症在人类和其它脊椎动物。1 - 3除了过多的观测数据,现在有令人信服的实验证据表明p53的损失函数(通过任何手段)在人类细胞致癌的关键步骤之一。4多了解p53肿瘤抑制基因的功能作为转录因子在homo-tetrameric复杂调节下游靶基因的表达在一系列细胞激活后压力包括DNA损伤。p53目标基因的产物出现在多样化的过程,促进适应性反应:包括(但不限于)凋亡和增长被捕。5 - 7看起来失去p53功能,是否通过病毒癌基因蛋白失活或等位基因丢失由于突变,禁用细胞内稳态,突变细胞获得相当大的野生型选择优势。因此,结合其他分子事件,肿瘤表型可以发生。3,4许多研究表明p53经常可以观察到的异常在人类癌症和包括产生在巴雷特食管腺癌。8 - 10
现在也承认,巴雷特食管或柱状排列食管(CLO)是一种慢性gastro-oesophageal返流性疾病的产物11和癌症复杂它演示了最迅速增加的发病率在西方世界。12有促进理解的分子事件,支撑metaplastic-dysplasia-carcinoma CLO的序列。13,14研究表明等位基因缺失17 p, p53基因位点位于该地区,并在p53基因突变本身是经常发生在食管腺癌。10,15 - 17日一般来说,p53基因突变似乎metaplasia-dysplasia-carcinoma迟到事件序列,通常只有在优质发育异常而不是显而易见的低品位发育不良或相邻non-dysplastic化生黏膜。10,16当然,p53蛋白进行靶向治疗是一个一致的特性CLO的优质发育不良和腺癌。8 - 10p53基因突变和p53蛋白进行靶向治疗似乎是特定于CLO更高级的性腺瘤,没有证据表明这些与临床、病理或暂存CLO腺癌或生存的因素。18,19
虽然有越来越多的知识发生过程中p53的作用,包括复杂的克洛,p53领域最近成为进一步复杂化的识别存在的一系列基因p53密切相关。7对人类染色体1 p36轨迹,编码一种蛋白质称为p73,据报道有相当大的p53与哺乳动物同源性。20.包含一个N末端transactivation域与可观的身份p53的DNA结合域,包括绝对保护DNA的关键联系残留物,p73 oligomerisation域还演示了身份和相似性。p73不同于p53在很长一段C终端扩展交替剪接的结果存在于两个亚型,一长一短形式(p73α)和形式(p73β)。最近,第二个位点(人类3 q27-29)已经证明编码被称为p63 p53同系物。21这种蛋白质已经被其他团体和独立地确定各种命名为刃,p40、多样,p73L和尖端。22像p73, p63可以用三个C终端进行交替剪接变体(α、β和γ),2 N终端变异(TA和ΔN),和一个间隙接头的变体12基地(编码四个氨基酸)可能被删除从外显子9。21p73和p63在氨基酸水平相当的同源性以及类似的基因结构,大幅p53的同源区域。p53的基因家族的存在也许并不意外,因为其他重要细胞监管机构存在于基因家族。事实上,元素并行肿瘤抑制途径(如视网膜母细胞瘤通路)和许多其他分子系统显示这一现象,经常与顺向功能冗余。目前是知之甚少的生物学和功能新报告的p53同系物。
我们最近开始p63和主要的特征表达同种型ΔNp63通过生成一个抗血清(那么)承认p63亚型但不是p53和高度相关的p53同系物p73。22免疫印迹分析表明p63α和N端截短形式的p63α(ΔΝp63α)在一系列的细胞系。类似的组织免疫印迹分析揭示了相当大的复杂性与至少四个那么免疫反应性的亚型被确定。immunohistological研究那么免疫反应性被广泛检测,主要与上皮细胞增殖的隔间。这是在协议与其他研究的报道,可能有p63表达式之间的关系和上皮细胞增殖的隔间里,可以看到超表达在肿瘤。23,24那么的可用性试剂允许表达p63在病理检查材料。因此,我们第一个研究报告中p63亚型的表达研究,在研究p53蛋白的同时,在形态定义良好的系列代表metaplasia-dysplasia-carcinoma序列的不同阶段巴雷特食管。
材料和方法
抗血清和化学品
所有来自英国西格玛化学品和其他试剂有限公司(英国Poole),除非另有说明。
13 C末端鼠尿酮体(NH的残留物2-DMDSRRNKQQRIK)共轭之前KLH免疫兔子使用标准的方法。22结果超免疫血清是指定那么及其描述详细报道。22p53蛋白的表达是评估使用单克隆抗体1 (Dako、威、英国)如前所述。25
患者、组织和免疫组织化学
在这项研究中使用的所有组织样本来自石蜡包埋的回顾性调查档案从患者内镜活检材料和组织病理学诊断的实体化传统/古典克洛格洛斯特郡皇家医院接受治疗。因此所有的病人至少有3厘米段CLO的降低食管。为每个病人组10例选择表1。活检的食管鳞状上皮型和non-neoplastic CLO CLO来自患者在常规监测。与发育不良和癌病例,诊断证实了先前的独立审查专家胃肠病理学家(NAS)。
所有样品都立即缓冲福尔马林固定在10%前24小时处理石蜡使用标准程序。(4μm)石蜡部分被剪掉了,脱蜡、水化使用标准程序。后阻断内源性过氧化物酶活性(过氧化氢(3% v / v)在磷酸缓冲盐(PBS) 20分钟),非特异性结合活动降低了孵化与正常山羊血清(20% v / v在PBS)在室温下20分钟。幻灯片在一夜之间被孵化在4°C与初级抗体(那么)(1:20 00 (v / v)整洁的山羊血清)或preimmune血清(消极的控制;1:1000 (v / v)在整洁的山羊血清)。游离抗体被删除,在PBS 5分钟洗了三次。抗体信号被放大了孵化为一小时在室温下1:10 0 (v / v)解决方案的山羊antirabbit合(Dako、威、英国)准备在整洁的山羊血清。可视化是通过使用兔子StriAvigen过敏的免疫组织化学工具包(美国圣拉蒙Biogenex)根据制造商的指示。疣状后,部分在蒸馏水清洗,轻轻和迈耶的苏木精复染色,脱水,清理,安装在DPX安装介质(BDH,普尔,英国)根据制造商的指示。
免疫组织化学染色部分进行评估,取得了由两个独立histopathologists使用评分系统(多环芳烃和NAS)表所示1。注意任何毛染色模式时,p63和p53表达却只考虑如果存在10%的核显示均匀染色。在所有情况下两个,完全同意关于染色模式。在这两种情况下,共识协议是实现在讨论和审查。
结果
在这里描述的研究中,我们使用了可用的序列的C末端的老鼠p63α设计肽(NH(刃)2-DMDSRRNKQQRIK)用于免疫兔子的标准方法。22报告表明,类似的小鼠cDNA这个序列是相同的,相同的除了一个保守的替代人类的序列(NH2-DMDARRNKQQRIK)。21,26结果抗血清那么承认刃(鼠p63α)在体外transcription-translation刃cDNA反应,但不承认p73α或小鼠p53在控制实验。22此外,那么不承认重组体人p53蛋白在西方墨迹。N末端p63α截断,指定ΔNp63α,生成的结果替代促进剂的使用,21和其他潜在的剪接变体p63保留C末端,那么承认。22p63蛋白表达,判断通过免疫印迹和免疫组织化学,据报道是非常普遍的在许多人体组织。22重要的是,在我们的研究中,没有发现染色与preimmune血清即使在浓度高于使用用于那么血清。这一发现也观察到在正常啮齿动物组织(未发表的结果),并形成鲜明对比p53的表达模式是很少通过免疫组织化学方法检测在正常轻组织和细胞,即使敏感放大系统工作。27
免疫组织化学结果评估的两个组织病理学观察人士总结表1。两个一般的观察可以本地化和p63在食管组织的分布。那么免疫反应性通常是发现核,特别是在上皮细胞的细胞核(无花果1,2),尽管偶尔细胞质免疫反应性也被观察到。non-neoplastic粘膜,如果观察到,那么免疫反应性限制的增生性基底层食管的复层鳞状上皮细胞和细胞核的细胞立即parabasal层。non-neoplastic巴雷特在这些情况下的粘膜,那么表达,表达尤其intestinalised粘膜。核染色主要在增殖区,但也偶尔观察到表面上皮(无花果1)。
p63(那么)疣状non-neoplastic肠道类型巴雷特的粘膜。最好有核染色的增殖区低方面的墓穴。还有偶尔的积极性在表面上皮细胞核。
p63(那么)引起的巴雷特食管腺癌免疫染色。有核染色渗透腺癌(下图),而上覆non-neoplastic巴雷特的粘膜是负的。在这种情况下有一个非常相似的染色模式,在癌p53。
在肿瘤上皮细胞,染色仍然一般核,它演示了一个增加强度和更广泛的分布。这种分布模式大致平行的网站(s)上皮细胞的增殖活动。没有染色的平滑肌肌层固有层和结缔组织纤维母细胞或内皮。这种扩散相关上皮p63核的分布与先前的研究在人类免疫反应性是一致的22,23和啮齿动物(数据未发表)组织。偶尔,染色的suprabasal角质细胞也被观测到,但这是不一致的,等口腔鳞状上皮的研究已经发现非特异性染色。24因此,我们解释这种模式有一些谨慎。演示的腺上皮细胞的胞质染色CLO也在正常食管腺的柱状上皮和最初有些令人惊讶。然而,细胞质p53的表达现在是有据可查的28,29日和可能p63(和其他p53同系物)偶尔也可以存在于胞质池。
观察核p63表达增加的程度与肿瘤的严重性CLO(表的变化1)。因此在低品位发育不良,只有两个10例显示强大的和广泛的核染色时两个显示焦核染色,更标志着隐窝,而不是从表面上看,在某种程度上类似于的non-neoplastic CLO肠道类型。在优质发育不良,强大的核染色是普遍和更广泛分布(表1)。也出现了类似的染色分布在入侵腺癌(无花果2)虽然没有证据表明p63表达与癌的品位之间的关系。
p53、p63染色比较,强的肿瘤CLO例广泛染色p63平行p53免疫反应性的形象在相同的情况下(表1)。值得注意的是,那么血清p53不承认,即使在严格的生化检测,抗原决定基承认是1(在人类p53的N末端)不存在p63(或p73)。22大多数non-neoplastic CLO粘膜是负p63 p53(表1),尽管某些情况下与p63显示限制核染色的增殖区上皮表面上皮(图的一些表达1)。有趣的是,这是专门在肠道类型CLO粘膜,在其他地方的,没有证据表明肿瘤患者CLO段。这种模式的染色与p53在任何情况下(没有被观察到1)。p63染色的一个重要的技术问题,在正常组织在这些研究中,是没有染色法检测血清preimmune即使在浓度高于使用用于那么血清。
讨论
一个广泛的了解p53的生化性质已经开发和显然,p53通路的监管涉及很多级别的控制。6,7,30.这些包括监管p53蛋白稳定,调制的转录后修饰,如磷酸化和乙酰化作用,一系列蛋白质-蛋白质之间的关系和操作p53蛋白的亚细胞定位。细胞的侮辱,可以激活p53途径多样化。包括DNA损伤,引起的各种物理和化学药剂,从热休克和改变2紧张到改变的细胞基质和细胞锚地交互,生长因子和细胞因子调节活动,激活癌基因的影响通过一个论坛相关的通路。p53激活下游的后果仍不完全理解虽然大部分数据是一致的视图,p53是一个转录因子能够激活(在某些情况下压抑)通过绑定到目标基因的活动规范p53响应元素。生理活动引起包括(但并不限于)凋亡和增长被捕。p53通路在细胞类型和组织类型仔细监管具体方式仍然知之甚少。27,31日
发现p53 p73同系物和识别20.和p6321,22可以存在于多种形式大大复杂一个已经很复杂的领域。p53的所有成员家族转录因子与非常相似的DNA结合域能够绑定到p53共识序列和transactivating下游靶基因。然而,有越来越多的证据表明,可能有一个微分能够激活(或抑制)p53响应元素。32,33此外,似乎transdominant否定形式p63,由于替代促进剂的使用引起的N端截短形式的p63缺乏转录激活域。21额外的备用接头形式,一些长C终端扩展,可能和新颖的属性,形成一系列hetero-oligomers无论是不同启动子的转录激活以及蛋白质相互作用,转录后修饰,和相关的监管机制。20.,34最后,不同物种之间的竞争和亚型在启动子可能深刻地改变p53通路的功能性质。支持此观点的想法是p53的之前报道分化相关的活动35-37可能的结果p53微扰的分化和发育角色p63和p73而不是特定的存在p53分化调节特性。这可能是明显的突变型p53超表达改变p63和p73在肿瘤的性质。值得注意的是,在这项研究中,一个绝对和谐的过度p63和p53在更高级的瘤,优质发育不良和入侵CLO的腺癌,观察。这些亲密的互动越来越认可其他的转录因子家族,如helix-loop-helix和Id的家庭38,39化学计量学的修改和亚细胞定位的成员深刻地改变目标基因的表达。
根据这些研究结果,观察到p63是广泛表达于人体组织22的增殖隔间,可论证的正常鳞状上皮和化生的食管腺上皮提出了重要的问题。这可能是因为p63亚型在上皮细胞有重要的生理作用。40,41然而,它必须强调,在这项研究中,p63表达式,non-neoplastic巴雷特的粘膜,也出现在表面上皮,当然不是绝对p63表达和增殖之间的一致性。同样,没有清晰的关系在这项研究中,另一个22p63同种型表达和细胞凋亡之间的关系。
p63在生物系统的重要作用的证据来自p63零老鼠的戏剧性的表型42,43和突变的观察p63可以占常染色体显性外胚层的缺陷。44我们以前观察到的ΔN形式p63缺乏转录激活域,这是主要形式的p63增殖隔间的组织可能表明,这是一个显性负内生p53活动的监管机构,一个内生“anti-p53蛋白质”。另外,p53的准确一致性和p63 CLO更高级形式的肿瘤中表达,优质发育不良和浸润性癌,表明强有力的积极关系的两个基因的蛋白表达这样的肿瘤。了解p53通路的功能及其重要作用的致癌作用需要的所有组件的详细定义p53通路在人类细胞和他们的复杂的相互作用。因此虽然通常是一个好p53表达与肿瘤表型之间的相关性,研究p53的相对失败在恶性CLO等同于临床有用的参数10,18可能是由于不完整的定义性质的各种组件p53通路(包括p63)。
确认
联队和NAS承认金融支持的格洛斯特郡皇家和克兰菲尔德大学医学科学研究所和格洛斯特胃肠病学组。多环芳烃承认欧洲共同体提供的财政支持,卫生部,癌症研究活动,国际癌症研究协会,英国和爱尔兰的病态社会。慷慨的礼物刃cDNA从Drs H Schmale和C班贝克。作者感谢女士真实Cadd教授对她的帮助和PJ华纳博士JAZ养家糊口有用的科学讨论。
引用
略语
- 克罗
- 柱状排列食管
- 美国公共电视台
- 磷酸缓冲盐