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肝脏疾病
与酒精性肝病相关的抗磷脂抗体可特异性识别氧化磷脂
免费的
  1. R罗拉，
  2. D Vay，
  3. E Mottaran，
  4. M Parodi，
  5. M Vidali，
  6. M Sartori，
  7. C Rigamonti，
  8. G Bellomo，
  9. E Albano
  1. 东皮埃蒙特" Amedeo Avodagro "大学医学科学系和医学门诊部，Via Solaroli 17, 28100, Novara, Italy
  1. E Albano教授，东皮埃蒙特" Amedeo Avogadro "大学医学系，Via Solaroli 17, 28100 Novara，意大利。{在}med.unipmn.it阿尔巴诺

摘要

背景循环抗磷脂抗体(aPL)常在酒精性肝病(ALD)患者中检测到，但其形成原因知之甚少。

目标我们评估了乙醇介导的氧化损伤是否可能促进ALD中aPL的发展。

患者与方法抗β IgG2糖蛋白1 (β2用ELISA法检测了重度饮酒者(有ALD或没有ALD)和健康受试者的-GP1)、心磷脂和人血清白蛋白(HSA)与氧化花生四烯酸(HSA- app)或丙二醛(HSA- mda)的复合物。

结果ALD患者循环IgG识别心磷脂水平明显高于对照组。然而，ALD血清的抗心磷脂反应性仅以氧化心磷脂为抗原而非氧化保护心磷脂为抗原才明显。在ALD患者中，抗氧化心磷脂IgG的个体值与抗HSA-MDA和HSA-APP抗体滴度相关(r=0.68, 0.72;P <0.0001)作为氧化应激的标志物。ALD患者抗磷脂结合蛋白β抗体水平也有所增加2-GP1，以及个体对氧化心磷脂和β的反应性2-GP1高度相关(r= 0.85;p < 0.0001)。β中IgG与氧化心磷脂、HSA-MDA和HSA-APP的结合也显著升高2-GP1比β阳性2-GP1阴性血清。然而，预吸附β2-GP1阳性血清β2-GP1包被的ELISA板对氧化心磷脂的反应性降低80%，对HSA-APP或HSA-MDA的反应性不受影响。

结论乙醇诱导的氧化损伤与氧化心磷脂和β之间的抗体靶向复合物的发展有关2gp1中。这些抗体可能解释了在严重ALD患者中观察到的高aPL滴度。

  • 氧化应激
  • 脂质过氧化作用
  • β2糖蛋白1
  • 乙醇
  • 自身抗体

  • 本文中使用的缩写

    “肾上腺脑白质退化症”
    酒精性肝病
    aPL
    antiphospholipid抗体
    β2gp1中
    β2糖蛋白1
    DPPD
    diphenylphenylendiamine
    丙肝病毒
    丙型肝炎病毒
    保险公司
    人血清白蛋白
    HSA-MDA
    丙二醛与人血清白蛋白加合
    HSA-APP
    人血清白蛋白和花生四烯酸氧化产物之间的加合物
    HSA-LPP
    人血清白蛋白和亚油酸氧化产物之间的加合物
    MDA
    丙二醛
    od
    光密度
    美国公共电视台
    磷酸盐缓冲盐水

    • http://dx.doi.org/10.1136/gut.49.6.852

    数据来自Altmetric.com

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      抗磷脂抗体(aPL)属于一组异质的自身抗体，对带负电荷的磷脂具有明显的特异性。1，2这些抗体的存在是原发性抗磷脂综合征或休斯综合征的特征，包括复发性血管血栓形成、胎儿丢失和血小板减少。3.aPL和抗磷脂综合征通常与风湿性和自身免疫性疾病有关，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和系统性硬化症。1 - 4然而，aPL也存在于慢性感染(梅毒、疟疾、人类免疫缺陷病毒1)、淋巴增生性疾病和镰状细胞性贫血患者中。1 - 4

      aPL的分子靶点尚未被详细描述。aPL通常通过其与固相结合心磷脂反应的能力来识别，但也可以识别其他阴离子磷脂，即磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺。1，2麦克尼尔及其同事的研究5Galli和他的同事6表明aPL与磷脂的结合主要是由β2糖蛋白1 (β2-GP1)或载脂蛋白H，一种血浆50 kDa糖蛋白，易于与磷脂以及其他带负电荷的物质结合。4β发生构象变化2-GP1与磷脂相互作用后，使该蛋白对aPL具有抗原性。7事实上,β2-GP1也可以被aPL识别在磷脂缺乏时，附着在辐照聚苯乙烯或硝化纤维膜，富有负电荷。8然而，与凝血酶原、蛋白C和蛋白S的磷脂复合物也可能是aPL的靶点，这可能有助于aPL的抗凝血特性。4最近,Horkko等有报道称，原发性抗磷脂综合征女性aPL可识别心磷脂氧化过程中产生的表位。9他们还认为抗原决定因素可能是由β反应引起的2-GP1与心磷脂不饱和脂肪酸过氧化分解产生的产物。9，10

      最近的研究表明，aPL可以在慢性肝病患者中检测到，特别是酒精性肝病(ALD)和丙型肝炎。16高aPL滴度在酒精性肝炎或肝硬化患者中常见，这些患者中aPL的存在似乎反映了疾病进展，与疾病严重程度显著相关。12然而，aPL也可在无肝损害的酗酒者中检测到。12，17，18此外，aPL通常与静脉和动脉血栓形成有关4慢性肝病患者aPL的存在似乎与血栓性并发症无关。16

      临床和实验证据表明，乙醇中毒可促进自由基的形成和氧化性肝损伤。19特别是，脂质过氧化产物和蛋白质羰基水平的增加可以在肝脏活检或从ALD患者获得的血清中得到证明。19号此外，在酒精代谢过程中羟乙基自由基的形成也可以在酗酒患者中被记录下来。24

      这项工作的目的是评估ALD患者aPL的发展是否反映了乙醇介导的氧化损伤。

      患者与方法

      患者和对照受试者招募

      我们纳入了36例患者(27名男性，9名女性;平均年龄51岁(31-73岁)，伴有或不伴有肝炎(ALD)的酒精性肝硬化。诊断基于临床、生态学和实验室标准。12例患者肝活检显示小结节性肝硬化的典型特征。3例肝细胞球囊变性伴Mallory体和炎症浸润。根据Maddrey's DF指数或Child Turcotte分类评估肝损伤的临床严重程度25，26ALD组72%的患者有中度或重度肝损伤(DF值高于60)，58%属于儿童B组或c组。15个重度饮酒者(11男，4女;平均年龄44岁(25-66岁)，肝脏血检正常，无肝脏疾病的临床或生态学证据。在过去的12个月里，所有酗酒患者估计平均每日乙醇摄入量超过100克(表)1)，也没有人曾同时接触过药物或毒素。通过第二代酶联免疫吸附试验(Abbott Laboratories, Chicago, Illinois, USA)测定，酗酒患者血清乙型肝炎病毒标志物或丙型肝炎病毒(HCV)抗体呈阴性。

      查看该表:
      表1

      参与研究的患者的生物学特征

      一组患者40例(男29例，女11例;平均年龄54岁(32-76岁)，患有HCV或乙型肝炎病毒慢性肝炎或肝硬化，没有酗酒。在该组中，62%的患者是禁欲的，其余的患者报告酒精摄入量在10到50克乙醇/天之间。这些患者的肝损伤严重程度与酒精性肝损伤患者相当。使用常规实验室程序检测所有患者的天门冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、γ谷氨酰转移酶、胆红素和凝血酶原时间。所研究患者的生物学特征见表1．

      健康对照从献血者或大学工作人员中招募，包括42名受试者(28名男性，14名女性;平均年龄47岁(33-66岁)。在对照组中，女性酒精摄入量低于20克/天，男性为40-60克/天。在血液测试时，所有受试者都至少戒酒48小时。所有受试者都知情同意分析，研究计划根据大学伦理委员会的指导方针进行。在一夜禁食后采集血液样本(5毫升)，并使用血清进行ELISA检测。

      抗磷脂抗体测定

      IgG与β反应2-GP1和心磷脂分别用IMMCO Diagnostics Inc. (Buffalo, New York, USA)和IMTEC Immunodiagnostika GmbH (Berlin, Germany)的商业ELISA试剂盒检测。抗心磷脂和抗-β的阈值2-GP1抗体之前在同一人群的健康对照的代表性样本中测定。

      对氧化磷脂免疫反应性的测定

      磷脂包被酶联免疫吸附试验板根据Harris提出的标准化方法制备。1简单地说，将30 μl心磷脂乙醇溶液(50 μg/ml)施于每孔，在空气中4°C蒸发一晚。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次后，加入0.3 ml含3%牛血清白蛋白(BSA)的PBS包膜缓冲液，pH为7.4，在37°C下进一步孵育1小时，以阻断非特异性结合位点。用PBS冲洗涂有涂层的井三次。为避免心磷脂在某些制剂中自氧化，在心磷脂乙醇溶液中加入0.1 mmol/l的二苯基苯二胺(DPPD)，在充氮的密封塑料袋中涂布。制备后立即使用心磷脂涂层板。为了检测，将患者和对照组的血清用包衣缓冲液1:50稀释，并将0.2 ml等分液一份一份地添加到适当的孔中，在37°C下孵育1小时。然后用0.25%的PBS洗涤三次，并进一步与过氧化物酶连接的山羊抗人IgG(稀释1:6000)在37℃下孵育60分钟。抗体结合显示添加0.15 ml的反应混合物含有0.4 mg/mll-苯二胺、0.4 μl/ml过氧化氢(30%)、5.1 mg/ml柠檬酸、6.1 mg/ml无水钠2HPO4， pH 5.0。15 min后，加入50 μl的2 N H即可停止反应2所以4使用Bio-Rad微孔板阅读器(Bio-Rad Laboratories Inc.， Hercules, California, USA)在490 nm处测量吸光度。在不含磷脂的乙醇包被板中测试得到的每个血清样品，在重复孔中从非特异性背景中减去平均光密度(od)。

      磷脂氧化评估

      通过测定共轭二烯吸光度来监测酶联免疫吸附试验板涂层条件下磷脂过氧化反应的发生。简单地说，将0.5 mg/ml心磷脂溶液置于玻璃试管中，在4°C的空气中孵卵过夜，使其从溶剂中蒸发。然后将心磷脂溶解在2 ml己烷中，立即用Beckman DU650紫外可见分光光度计在234 nm处测量共轭二烯吸光度。以新鲜制备的正己烷心磷脂溶液为参考。

      用脂质过氧化产物制备蛋白质加合物

      人血清白蛋白(HSA)与丙二醛(MDA)在37℃条件下反应2h, 1 mg/ml HSA与50 mmol/l MDA，丙二醛-双二甲基缩醛酸水解得到。未结合的乙醛在4°C对PBS进行过夜透析，pH为7.4。根据Cominacini及其同事的说法，通过测量399/471nm exc/em波长对下的荧光强度来评估MDA加合物的存在。27根据Palinski及其同事的研究，花生四烯酸(HSA- app)和亚油酸(HSA- lpp)通过热自氧化生成与脂肪酸氧化反应产物络合的HSA。28简单地说，将10mg花生四烯酸或亚油酸转移到一个开放的玻璃小瓶中，并在37°C中保存72小时。将黄褐色的反应产物溶于50 μl甲醇中，在含10 μM EDTA、pH 7.4的1ml PBS中涡流悬浮。将含有3毫克氧化脂肪酸的等份添加到1毫克HSA中，在20°C下孵育过夜。修改后的HSA在4°C对PBS进行透析，pH为7.4。

      脂质过氧化抗原抗体测定

      聚苯乙烯微孔板ELISA (Immunolon IV;Nunc, Fisher Scientific，圣路易斯，密苏里州，美国)用0.05 mg/ml与丙二醛、花生四烯酸氧化产物(HSA- app)缀合的HSA在37℃下涂敷4小时，或与0.1 M碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)中溶解的未修饰蛋白。孵育后，将溶液取出，用0.3 ml含3% BSA的包覆缓冲液在PBS中替换，pH为7.4。进一步在37°C下孵育1小时，以阻断非特异性结合位点。用含0.25% Triton X-100的PBS冲洗涂层井三次。将患者血清用包膜缓冲液1:50稀释，每份0.20 ml加入相应孔中，37℃孵育1小时。用PBS-0.25% Triton X-100冲洗3次后，通过过氧化物酶连接的山羊抗人IgG(如上所述)显示IgG结合。结果通过在含有未修饰的HSA的孔中减去每个血清样品的分光光度读数来表示。

      IMMUNOCOMPETITION实验

      ALD患者血清抗-β阳性2-GP1抗体用包被缓冲液1:50稀释，每孔放置300 μl等份于β包被的微量滴定板中2-GP1 (IMTEC Immunodiagnostika GmbH, Berlin, Germany)或HSA。4℃孵育过夜后，将150 μl等份分别加入氧化心磷脂、HSA-MDA、HSA-APP或HSA-LPP包被的ELISA板中，按上述方法检测抗体结合。

      数据分析和统计计算

      数据以均值(SD)表示。使用Instat-3统计软件(GraphPad software Inc, San Diego, California, USA)进行统计分析，当分析超过两个组时，采用单因素方差分析和Bonferroni校正进行多重比较。皮尔森的r数值用于相关性估计。通过Komolgorov-Smirnov检验初步验证各组的分布正态性。显著性在5%水平。

      材料

      花生四烯酸，亚油酸，l-苯二胺、心磷脂和不含脂肪酸的人血清白蛋白(分数V)来自Sigma化学公司(美国密苏里州圣路易斯)。DPPD和丙二醛双二甲缩醛由Fluka Chemie AG (Buchs，瑞士)提供。

      结果

      基于与心磷脂包被酶联免疫吸附试验板结合的商用aPL检测试剂盒的使用显示，36例(55%)伴有或不伴有酒精性肝炎(ALD)的酒精性肝硬化患者中，有20例(55%)的抗心磷脂IgG水平高于阈值(15 GPL单位/ml)，而一名健康对照组的抗心磷脂IgG阳性。ALD患者的IgG对心磷脂的平均反应活性为22.7 (14)U/ml(范围11.8 - 71.1)，显著高于对照组(11.8 (1.3)U/ml;范围10.9 - -17.6)。

      研究表明，心磷脂的不饱和脂肪酸成分暴露在空气中时会迅速自氧化。9在234 nm处测定共轭二烯吸光度，作为脂质过氧化的指标，结果显示，在4°C下孵育过夜，通常用于酶联免疫吸附试验板包裹磷脂，1明显增加吸光度(od234海里0.276)的心磷脂样品与新鲜制备的溶液(od234海里0.110)。然而，心磷脂的自氧化被完全阻止(od234海里在100 μmol/l抗氧化剂DPPD存在的氮气气氛中孵育0.112)。当使用被氧化保护心磷脂或被允许在空气中自氧化的心磷脂包被的ELISA板重新测试血清的抗磷脂反应性时，观察到显著的差异。如图所示1， ALD血清中IgG与氧化保护心磷脂的结合(od490海里0.274(0.184))显著低于氧化心磷脂(od490海里0.491(0.340))。对照组血清中任何一种心磷脂的反应性都没有变化(od490海里0.205 (0.103)v0.187 (0.111)1)．当用氧化心磷脂进行测试时，36个ALD血清中有21个(58%)显示IgG结合高于平均od值的对照组的阈值490海里值+2 SD(0.408)。然而，当用抗氧化心磷脂进行测试时，36种ALD血清中只有8种(19%)仍显示出反应性增加(截断值0.387)(图7)1)．此外，ALD和对照组血清对氧化保护心磷脂的反应性无统计学差异。这不是由于DPPD干扰抗体反应，因为添加抗氧化剂到已经氧化的心磷脂制剂不影响IgG结合(未显示)。在一组15名没有临床或生化证据表明肝损伤的重度饮酒者(0.153(0.09))或40名与酒精滥用无关的肝硬化患者(0.284(0.10))中，对氧化心磷脂的反应性没有明显增加。

      Immune reactivity against native or oxidised cardiolipin (CL) of sera from 36 patients with alcoholic cirrhosis with or without alcoholic hepatitis (ALD) and from 42 healthy control subjects. IgG binding to ELISA plates coated with CL allowed to auto-oxidise in air or oxidation protected CL was evaluated, as reported in the patients and methods section. The horizontal bars represent median values in each group. Values in each group were normally distributed, as evaluated by the Komolgorov-Smirnov test.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
      图1

      36例酒精性肝硬化伴或不伴酒精性肝炎(ALD)患者和42例健康对照受试者血清对天然或氧化心磷脂(CL)的免疫反应性。如患者和方法部分所述，评估了IgG与被CL包被的ELISA板的结合情况，CL包被允许在空气或氧化保护CL中自氧化。水平柱表示每组的中值。各组的值均呈正态分布，采用Komolgorov-Smirnov检验。

      已知脂质过氧化过程中产生的脂质氢过氧化物和醛与蛋白质相互作用形成具有免疫原性的加合物。28我们观察到ALD患者经丙二醛(HSA- mda)或花生四烯酸(HSA- app)氧化产物反应修饰后，循环抗HSA的IgG水平增强(od490海里分别为0.79(0.27)和0.47 (0.25)，v健康对照组为0.45(0.14)和0.11 (0.08);p < 0.001)。抗氧化心磷脂的个体抗体水平与抗HSA-APP或HSA-MDA的IgG水平相关(r=0.67, 0.60;p < 0.0001)。此外，在ALD患者中，抗氧化心磷脂抗体阳性的受试者抗脂质过氧化产物的抗体水平明显高于阴性组(图2)2)，表明对磷脂的免疫反应与乙醇诱导的氧化损伤之间存在关系。另一方面，重度饮酒者抗HSA-MDA和HSA-APP的IgG滴度无明显升高(od490海里0.450(0.140)和0.039(0.030))或非酒精性肝硬化(od490海里分别为0.590(0.220)和0.196(0.151)。

      Reactivity with antigens derived from the reaction of proteins with lipid peroxidation products of sera from patients with alcoholic liver disease positive (Ox-CL+) or negative (Ox-CL−) for the presence of antibodies against oxidised cardiolipin. Human serum albumin (HSA) modified by the reaction with either malondialdehyde (HSA-MDA) or products from arachidonic acid peroxidation (HSA-APP) were used as antigens, as reported in the patients and methods section. Results are mean (SD) ELISA values. **p<0.01, ***p<0.0001 versus Ox-CL− subjects.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
      图2

      与抗原的反应性来源于蛋白质与酒精性肝病阳性患者血清脂质过氧化产物的反应(Ox-CL+)或负(Ox-CL−)检查是否存在抗氧化心磷脂的抗体。经丙二醛(HSA- mda)或花生四烯酸过氧化产物(HSA- app)反应修饰的人血清白蛋白(HSA)被用作抗原，如患者和方法部分所述。结果为平均(SD) ELISA值。**p<0.01， ***p<0.0001−科目。

      抗磷脂抗体也可以通过其识别由β形成的复合物的能力来检测2-GP1和磷脂4为了避免与心磷脂氧化状态相关的混杂因素，通过测定抗-β重新评估与ALD相关的抗磷脂反应性2gp1中抗体。IgG对β的反应性2-GP1 (46.1 (29.5) U/ml(13-150范围))明显高于对照组(22.5 (5.8)U/ml(10-32范围)，36例ALD患者中有23例(64%)抗-β阳性2gp1中免疫球蛋白。β2-GP1阳性ALD血清中识别氧化心磷脂的IgG滴度显著高于β (p<0.001)2-GP1阴性血清(图3.)，尽管两组之间的总循环IgG水平无显著差异(15.89 (7.37)g/l)v13.26 (3.01) g/l)。此外，强正相关(r= 0.85;P <0.0001)2-GP1 IgG与抗氧化心磷脂抗体进行比较。因此，我们推测ALD血清中检测到的aPL可能识别氧化修饰的心磷脂与β复合物2gp1中。的确，ALD血清的预吸附同时显示抗心磷脂和抗β2-GP1在β包被板上的反应性2-GP1使IgG与氧化心磷脂的结合减少约80%(图4)．ALD患者β阳性2-GP1对HSA-MDA和HSA-AAP的反应活性也显著高于β (p<0.005)2-GP1阴性受试者(图3.)．排除针对MDA或APP衍生表位的抗体可能通过识别β之间的复合物来解释抗磷脂反应性的可能性2-GP1和磷脂氧化产物，进行进一步实验。如图所示4，在β包被的酶联免疫吸附板上预吸附2-GP1几乎取消了aPL阳性血清对氧化心磷脂的识别，但不影响IgG与HSA-APP或HSA-MDA的结合。同样，ALD血清在氧化心磷脂涂层板上的预吸附也不影响HSA与亚油酸(HSA- lpp)自氧化产物反应形成的抗原的识别，亚油酸是心磷脂的主要不饱和脂肪酸(od490海里0.280 (0.09)vod490海里0.272(非预吸附血清0.120)。然而，在相同的实验中，HSA-LPP的预吸附量降低(od490海里0.049(0.07))的ALD血清与同一抗原的结合率为82%。因此，对来自脂质过氧化产物的抗原的抗体不能解释ALD患者血清中检测到的对氧化磷脂的反应性。

      Reactivity with oxidised cardiolipin or with antigens derived from the reaction of proteins with lipid peroxidation products of sera from patients with alcoholic liver disease positive (β2-GP1+; n=23) or negative (β2-GP1−; n=13) for the presence of antibodies against β2-glycoprotein 1. ELISA plates coated with oxidation protected (CL) or oxidised (Ox-CL) cardiolipin, or with malondialdehyde (HSA-MDA) or products from arachidonic acid peroxidation (HSA-APP) were used to evaluate IgG binding. Results are mean (SD) ELISA values. **p<0.005, ***p<0.001 versus β2-GP1 negative subjects; †††p<0.001 versus native cardiolipin.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
      图3

      与氧化心磷脂或与蛋白质与酒精性肝病患者血清脂质过氧化产物反应产生的抗原的反应性(β2gp1中+；N =23)或负(β2gp1中−；N =13)对β抗体的存在2糖蛋白1。用氧化保护(CL)或氧化(Ox-CL)心磷脂或丙二醛(HSA-MDA)或花生四烯酸过氧化产物(HSA-APP)包被的ELISA板评价IgG结合。结果为平均(SD) ELISA值。**p<0.005， ***p<0.001相对于β2-GP1阴性受试者;†††p<0.001与天然心磷脂。

      Reactivity with oxidised cardiolipin or human serum albumin (HSA) complexed with lipid peroxidation products following preabsorption with the β2 glycoprotein 1 (β2-GP1) of sera from alcoholic patients. Fifteen sera from patients with alcoholic liver disease displaying high titres of IgG against both cardiolipin and β2-GP1 were incubated overnight at 4°C on irradiated ELISA plates coated with β2-GP1 and tested for IgG binding to oxidised cardiolipin (Ox-CL) or HSA modified by reaction with malondialdehyde (HSA-MDA) or products of arachidonic acid peroxidation (HSA-APP). Results are mean (SD) ELISA values obtained with native sera or β2-GP1 preabsorbed sera. *p<0.0001 versus non-pre-absorbed sera.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
      图4

      与氧化心磷脂或人血清白蛋白(HSA)的反应性与β预吸收后的脂质过氧化产物络合2糖蛋白1 (β2-GP1)。15份酒精性肝病患者血清显示抗心磷脂和β IgG滴度高2-GP1在4°C下孵育过夜，孵育于含β的辐照酶标板上2-GP1并检测IgG与氧化心磷脂(Ox-CL)或经丙二醛(HSA- mda)或花生四烯酸过氧化产物(HSA- app)反应修饰的HSA结合。结果为天然血清或β的平均(SD) ELISA值2-GP1预吸收血清。*p<0.0001与未预吸收血清。

      先前的研究表明，抗磷脂免疫反应在酒精性肝炎或肝硬化患者中普遍存在11，12，14在非禁欲受试者或严重肝损伤的肝硬化(儿童B级和C级)中尤其高。14我们观察到个体对氧化心磷脂的反应性呈正相关(r= 0.65;p<0.0001)与Maddrey的DF值。此外，与中度或轻度肝损伤患者(Maddrey’s DF指数<90)相比，伴有重度肝损伤(Maddrey’s DF指数>90)的ALD患者循环抗氧化心磷脂IgG水平显著(p<0.0002)高5)．当同样的患者按照child - turcote分类分组时，也观察到有统计学意义的差异(p<0.01)5)．这表明抗氧化磷脂抗体的存在实际上可能解释了与严重ALD相关的高aPL滴度。

      Reactivity against oxidised cardiolipin (Ox-CL) in relation to the severity of alcohol liver injury. The clinical severity of hepatic damage was estimated according to Maddrey's DF classification23 (A) or Child-Turcotte classification (B). Patients with DF values less than 90 (n=26) were considered to have mild or moderate hepatic injury and patients with DF values greater than 90 (n=10) represented the group with severe damage. Child A group consisted of 15 patients, while 21 subjects belonged to Child B-C groups. The optical density (od) values in each group were normally distributed, as evaluated by the Komolgorov-Smirnov test. ***p<0.0002 versus DF <90; **p<0.01 versus Child A group.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
      图5

      对氧化心磷脂(Ox-CL)的反应性与酒精性肝损伤的严重程度有关。根据Maddrey's DF分级评估肝损害的临床严重程度23(A)或Child-Turcotte分级(B)。DF值小于90 (n=26)的患者被认为是轻度或中度肝损伤，DF值大于90 (n=10)的患者被认为是重度肝损伤组。Child A组15例，Child B-C组21例。各组光密度(od)值经Komolgorov-Smirnov检验呈正态分布。***p<0.0002 vs DF <90;**p与Child A组比较<0.01。

      讨论

      近年来，一些报告强调了酒精中毒与循环抗磷脂抗体(aPL)之间的关系。11，12，17，18在这些研究中，aPL在ALD患者中的患病率从48%到81%不等。这些值与我们在酒精性肝硬化患者组中观察到的aPL患病率(约55%)一致。然而，在31%肝功能异常但没有肝硬化的酗酒者中也发现了aPL1215-17%的酗酒者没有肝损伤的临床或生化迹象。17，18抗心磷脂抗体也可在HCV患者中检测到，在晚期肝硬化患者中更常见。13 - 15然而，与HCV感染相关的抗心磷脂抗体的流行率远低于ALD患者。14，15本研究和以前的报告都考虑了HCV感染与酒精滥用共存的情况，排除了有HCV感染证据的患者。

      aPL与ALD相关的抗原的性质尚不清楚。这些抗体已通过与固定在ELISA板表面的心磷脂结合而被检测到，但与其他类别的磷脂(即磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油)的免疫反应性也有报道。12Hörkkö的一项优雅的研究等证明了从患有抗磷脂综合征的妇女中选择的血清与心磷脂氧化时产生的新表位结合。9心磷脂的脂肪酸含量主要由亚油酸组成(约90%)，在包膜过程中，当微量酶标板暴露在空气中时，这些脂肪酸容易发生过氧化反应。9我们现在报道，在ALD患者血清中检测到的抗心磷脂抗体与天然心磷脂发生弱反应，当它被保护免受自发自氧化时，而是识别氧化心磷脂中存在的抗原。

      多项证据表明氧化损伤参与了酒精性肝损伤。肝活检或ALD患者的血清中含有较多的脂质过氧化产物(共轭二烯、丙二醛、4-羟基壬烯、F2-异前列腺烷)和蛋白质羰基含量高于非饮酒受试者或与酒精无关的肝病患者的类似标本。19号通过与蛋白质反应，脂质过氧化反应产生的自由基、脂质过氧化氢和醛可以产生各种加合物，其中大多数具有抗原性，并能刺激特定抗体的产生。28，29先前在ALD患者中检测到抗羟乙基自由基和mda蛋白加合物的抗体水平升高。24，30 -我们观察到，针对血清白蛋白和丙二醛(HSA-MDA)或花生四烯酸氧化(HSA-APP)产物加合物的IgG个体水平与抗氧化心磷脂抗体的水平密切相关。此外，在ALD患者中，抗氧化心磷脂抗体阳性组的抗脂质过氧化产物抗体水平明显高于阴性组。相反，在没有肝损伤的重度饮酒者或未显示氧化损伤证据的非酒精性肝硬化患者中，抗氧化心磷脂IgG滴度与健康对照组无显著差异。因此，我们认为与ALD相关的抗磷脂自身免疫的发展可能与乙醇诱导的促氧化条件有关。这一假设与实验观察结果一致，即磷脂的氧化修饰触发了抗磷脂免疫反应的发展。10，33此外,Iuliano等研究表明，在系统性红斑狼疮患者中，aPL阳性的患者尿中脂质过氧化产物F2-异前列腺素比未显示aPL反应的类似患者。34

      现在人们普遍认为血浆蛋白β2-GP1或载脂蛋白H在aPL反应性中起关键作用，作为抗体与磷脂结合的辅助因子。3.，4在液相，β2-GP1不被aPL识别，但与磷脂相互作用后发生的构象变化呈现β2-GP1是aPL的抗原性。7我们观察到，ALD患者的血清中有很高比例(64%)显示出β反应性2gp1中。密切相关(r= 0.85;个体抗-β水平之间也存在P <0.0001)2-GP1 IgG和抗氧化心磷脂抗体。有趣的是，只有β2-GP1阳性血清识别氧化心磷脂抗原和预吸附β2-GP1阳性血清中含有β2-GP1附着在ELISA微量滴度板上，减少了80%与氧化心磷脂抗原的抗体结合。这表明与酒精损伤相关的aPL是针对β相互作用形成的表位的2-GP1与氧化磷脂。Horkko等表明一些aPL识别的新表位可能由氧化磷脂分解产物和β2gp1中。9，10如上所述，ALD患者循环中针对脂质过氧化相关表位的抗体水平升高。此外，ALD患者显示β2-GP1反应性血清中识别HSA-MDA或HSA-APP的IgG水平高于β2-GP1阴性受试者。然而，ALD血清预吸附β2-GP1几乎取消了抗体与氧化心磷脂的结合，但不干扰与MDA或氧化花生四烯酸或亚油酸复合物的HSA表位的结合。我们得出结论，针对蛋白加合物与脂质过氧化产物(如MDA或脂质过氧化氢)的抗体不能解释对氧化心磷脂的免疫反应性。我们提出，在ALD患者中检测到的抗磷脂抗体更能识别β之间的复合物2-GP1和氧化心磷脂。

      关于aPL在酒精介导的肝损伤中的可能作用的数据很少。抗磷脂免疫反应可在酒精性肝炎或肝硬化患者中检测到11，12，14特别是非禁欲患者和严重肝损伤的肝硬化患者(儿童B级和C级)。14我们在严重肝损伤的ALD患者中检测到抗氧化心磷脂的IgG值较高。正相关(0.65;p<0.0001)在个体抗氧化心磷脂IgG和Maddrey's DF值之间存在明显差异。这表明aPL与严重ALD相关的高患病率可归因于针对氧化磷脂的抗体的存在。aPL与酒精性肝损害相关的临床意义目前尚不清楚。肝脏疾病患者中aPL的存在与血栓性并发症的风险增加无关。16最近的研究表明，静脉注射同基因凋亡胸腺细胞的小鼠产生抗心磷脂抗体，从而提出了aPL和细胞凋亡死亡之间的可能联系。35一致地，抗磷脂综合征患者的血清通过识别β相互作用产生的表位，特异性地与凋亡的胸腺细胞结合，而不是与活细胞结合2-GP1与质膜心磷脂。36，37有趣的是，凋亡细胞中的质膜抗原也是识别氧化磷脂的单克隆抗体的靶点。38酒精性肝损伤与肝细胞凋亡刺激有关39氧化事件已被提出在触发暴露于乙醇的肝细胞的凋亡变化中发挥作用。40因此，凋亡肝细胞膜中的氧化磷脂可能作为ALD患者中检测到aPL的刺激物和靶点。

      总之，我们的结果表明，在ALD患者中检测到的aPL与乙醇诱导的氧化损伤有严格的关系，并且优先针对与β络合的氧化磷脂2gp1中。这些发现提示氧化机制可能在与酒精性肝损伤相关的aPL发展中发挥作用。

      致谢

      这项工作得到了意大利大学和科学技术研究部(研究项目:细胞过程的氧化还原调控)和国家研究委员会(贡献号96.00073.CT04)的资助。

      本文中使用的缩写

      “肾上腺脑白质退化症”
      酒精性肝病
      aPL
      antiphospholipid抗体
      β2gp1中
      β2糖蛋白1
      DPPD
      diphenylphenylendiamine
      丙肝病毒
      丙型肝炎病毒
      保险公司
      人血清白蛋白
      HSA-MDA
      丙二醛与人血清白蛋白加合
      HSA-APP
      人血清白蛋白和花生四烯酸氧化产物之间的加合物
      HSA-LPP
      人血清白蛋白和亚油酸氧化产物之间的加合物
      MDA
      丙二醛
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      光密度
      美国公共电视台
      磷酸盐缓冲盐水

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