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摘要
背景:克罗恩病术后内镜复发频繁且不可预测。在结肠炎的实验模型中，异常的肠道生产前(白介素(IL)-1β，肿瘤坏死因子α (TNF-α))和抗(IL-10)炎症细胞因子与严重的结局相关。
患者和方法:我们评估手术时测定的回肠TNF-α、IL-1β或IL-10 mRNA水平是否可以预测内镜复发，以及回肠IL-10水平是否与特定的IL-10启动子等位基因相关。对行克罗恩病右回肠结肠切除术的患者进行术中回肠活检。采用竞争性聚合酶链反应定量检测黏膜TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA水平。用接收器工作曲线确定截止值。il - 10。使用IL-10启动子区域的多态二核苷酸重复分析G启动子单倍型。
结果:术后3个月，53%的患者内镜复发，47%的患者无疾病。内镜下复发的风险与回肠IL-10 mRNA浓度相关(r2= 0.81)。内镜下复发在IL-10分泌水平低的患者比分泌水平高的患者(80%)更频繁v40%) (p = 0.02)。至少具有G7-8或G10-13这两种等位基因中的一种的患者，回肠IL-10 mRNA分别升高(p=0.006)和降低(p=0.029)。IL-10的分布。G微卫星基因型在有或没有内镜复发的患者中相似。
结论:回肠IL-10 mRNA浓度较低是克罗恩病内镜复发的良好标志，但IL-10的分布不明显。G单倍型不能预测疾病的术后进展。
- 白介素10
- 克罗恩氏病
- 内窥镜复发
- CD,克罗恩病
- 呃,内窥镜复发
- TNF-α，肿瘤坏死因子α
- ,白介素
- TNBS，三硝基苯磺酸
- 聚合酶链式反应
- ROC曲线，受试者工作特征曲线
来自Altmetric.com的统计
克罗恩病(CD)是一种来源不明的慢性炎症性疾病。它的特点是多次复发，可能是内窥镜或临床。大约70%的乳糜泻患者最终需要手术，33-82%的患者可能随后复发，需要进一步的手术。1在回结肠切除术后，该病通常复发于回结肠吻合口(neoileum)的回肠侧并向近端延伸。Rutgeerts对89例回肠切除和回结肠吻合术后1年的患者进行了一系列研究等发现内镜回肠复发率(ER)为73%。2到目前为止，没有一个单一的测试、预测模型或疾病特征可以预测复发。
以前在乳糜泻中已经证实了粘膜免疫调节紊乱，这可能是肠道炎症和组织损伤诱导和持续的一个重要组成部分。3.在最近的一项研究中，Schreiber等肠道肿瘤坏死因子α (TNF-α)和白细胞介素-1β的分泌增加固有层在类固醇诱导缓解的患者中，细胞可能预测复发。4到目前为止，尚未证实这些细胞因子是否是术后早期复发的指标。与这些促炎细胞因子相比，许多观察表明IL-10是一种主要的抗炎介质，具有抗纤维化活性，可能调节疾病表达。在体内，小鼠体内IL-10基因的破坏导致结肠炎的发生5；相反，IL-10基因转移可阻止三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎的发生6注射IL-10可恢复对TNBS诱导的结肠炎中被废除的细菌产物的耐受性。7
本研究的目的是确定手术时回肠中TNF-α、IL-1β或IL-10 mRNA浓度是否可以预测乳糜泻中的ER。由于人体中IL-10的产生受基因控制，我们还研究了乳糜泻患者中IL-10的肠道产生是否与特定的IL-10启动子等位基因相关。
患者和方法
病人
这些研究得到了当地伦理委员会的批准，所有受试者都知情同意。乳糜泻的诊断是用标准标准建立的。8
在第一项研究中，研究了36例CD患者的回肠TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA的生成(男性16例，女性20例;平均年龄29岁)，首次行回结肠切除术和回结肠吻合术。所有患者都因疾病并发症而接受手术，即症状性狭窄、瘘管、梗阻或疾病活动。无患者接受免疫抑制治疗。如果患者正在接受类固醇治疗，则在术前四周逐渐减少并停止治疗。在手术过程中，系统地进行回肠镜检查和活检，以评估宏观和组织学的完整性，并定量细胞因子mRNA在吻合口上方30cm回肠黏膜的产生。8例活检取材于宏观非炎症回肠黏膜。一些标本被固定在福尔马林中检查，其余的立即在液氮中冷冻。手术后三个月内不允许使用任何药物(即类固醇、水杨酸盐、抗生素、免疫抑制药物)，除抗腹泻药和抗痉挛药外。3个月时内镜评估复发情况，根据Rutgeerts评分标准进行i1-i4分等(表1)。9
在第二项研究中，在另外43名乳糜泻患者中测定了回肠IL-10 mRNA的产生和IL-10启动子单倍型(18名男性，25名女性;平均年龄31岁)。在内窥镜下取非炎症回肠黏膜活检。从两项研究中所有患者的血液样本中提取DNA (n=79, 34男，45女;平均年龄30岁)，研究IL-10启动子的微卫星G等位基因频率。
逆转录竞争聚合酶链反应定量回肠细胞因子mRNA
活检组织在Trizol (Bioprobe, Montreuil, France)中通过机械分散均质，并如前所述提取总RNA。10在37°C下，用20 - 50单位的DNase I RNase-free (Boehringer, Mannheim, Germany)处理30分钟后，使用Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶(Gibco-BRL, Cergy Pontoise, France)、5 μM oligo-dT16和四种dNTP各2.5 mM (Pharmacia, Orsay, France)，在1 U/μl的人胎盘核糖核酸酶抑制剂(Promega, Lyon, France)存在下，以20 μl的最终反应体积反转录为互补DNA (cDNA)。样品在42°C孵育60分钟，然后在95°C加热5分钟，在−20°C保存直到使用。竞争聚合酶链反应(PCR)分析是由邹和他的同事描述的11做了一些调整。用β-actin (5 ' -GGGTCAGAAGGATTCCTATG-3 ';5 ' -ggtctcaaacatga tctggg-3 ')， il-10 (5 ' -aaatttggttctaggccggg-3 ';5 ' -gagtacaggggcatgatatc-3 ')， tnf -α (5 ' -acaagcctgt agcccatgtt-3 ';5 ' -AAAGTAGACCTGCCCAGACT-3 ')和IL-1β (5 ' -GGATATGGAGCAACAAGTGG-3 ';5 ' -ATGTACCA GTTGGGGAACTG-3”)。20 μl的反应混合物由有义引物和反义引物(各0.1 μg/μl)、1 U Taq聚合酶(Perkin Elmer, Courtaboeuf, France)、4种dNTP各50 μM、1×PCR缓冲液(Perkin Elmer)添加2.5 mM MgCl组成2，两个竞争对手之一pQA1和pQB2的等级浓度。3.扩增进行了40个循环，包括在94℃变性1分钟，引物在55℃退火1分钟IL-10和β-actin或58℃退火1分钟IL-1β和TNF-α，引物在72℃延伸1.5分钟，使用GeneAmp PCR系统9700 (Perkin Elmer)。扩增完成后，在含溴化乙锭的3%琼脂糖溶液中，在100 V条件下电泳1小时，分离竞争对手DNA和靶cDNA。使用图像分析仪(bioproffil, Marne-la-Vallée, France)比较竞争对手和目标cDNA产生的PCR产物的数量。细胞因子测定结果与同一样品中β-actin cDNA的数量成正比。
il - 10。G微卫星基因分型
使用Wizard kit (Promega)进行DNA提取。IL-10基因分型。G微卫星使用6-羧基荧光素标记的引物序列(6-FAM 5 ' -GTCCTTCCCCAGGTAGAGC AACACTCC-3 ';5 ' -CTCCCAAAGAAGCCTTAGTAGTGTTG-3 ')与前面描述的最终反应混合。样品在95°C初始熔化时间为7分钟后，在GeneAmp PCR体系9700中分别在94°C, 65°C, 72°C, 30轮1分钟，72°C，最终延伸时间为5分钟。PCR产物的1 μl样品与甲酰胺、负载缓冲液E和0.5 μl ROX-500标准尺寸(PE Applied Biosystems)混合，加热到95°C 5分钟，然后立即在冰上冷却。在含有6%丙烯酰胺和6 M尿素的测序凝胶上用377XL DNA测序仪(Perkin Elmer)分析片段大小。
统计方法
采用Pearson检验检验回肠IL-10 mRNA浓度与ER风险之间的相关性。为了将患者分为低IL-10生产者和高IL-10生产者，使用受试者工作特征(ROC)曲线确定IL-10 mRNA切断值。用χ χ法比较低产子与高产子的复发风险2测试。
为了评估每个等位基因的IL-10 mRNA的生成，我们使用Kruskall-Wallis单因素方差分析(单因素方差分析)比较了具有该等位基因的患者与其他所有等位基因患者的IL-10 mRNA浓度。
结果
回肠TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA水平对CD复发的预后价值
36例患者中19例(53%)ER大于i1, 17例(47%)无ER征象。年龄、性别、吸烟习惯、病程、疾病部位和手术指征在两组间无差异(表2)。尽管在所有活检标本中β-actin mRNA(14 591(69 587)分子)的组织浓度较高，但TNF-α和IL-1β mRNA仅分别在2/36和5/36样本中检测到。术中回肠TNF-α、IL-1β mRNA表达与3个月后复发风险无相关性。
相比之下，在36例患者的所有活检中均发现IL-10 mRNA表达(平均5.4×104分子/ β-actin分子)，浓度变化较大，从10−21.3×106β-肌动蛋白分子/分子(图1A)。il - 10mrna浓度与ER风险相关(r2b = 0.81)(图1)。使用IL-10 mRNA截断值为1030(通过ROC曲线确定)，11例(31%)患者被归为低IL-10生产者，25例(69%)患者被归为高IL-10生产者(图1A)。低含量生产者中82%(9/11)发生ER，而高含量生产者中40%(10/25)发生ER (p=0.02)(图1C)。低回肠IL-10 mRNA浓度对ER的特异性为88%，阳性预测值为82%。TNF-α和IL-1β mRNA在IL-10低产生者(分别为1和2例)和高产生者(分别为1和3例)中检测到的频率相似。
(A)从36例克罗恩病手术患者的非炎症回肠黏膜中，每β-肌动蛋白分子中有回肠白细胞介素(IL)-10 mRNA分子。(B)回肠IL-10 mRNA与内镜复发风险(ER)的相关性。(C)低IL-10产生组ER的频率高于高IL-10产生组，定义为IL-10 mRNA分子/ β-肌动蛋白分子的截断值为1030 ((a)中的折线)。
il - 10的相关性。G微卫星基因型与自发性IL-10 mRNA产生和术后内镜复发
探讨IL-10之间可能的相关性。G等位基因和IL-10 mRNA的回肠浓度，我们对另外43例乳糜泻患者未炎症回肠中的IL-10 mRNA进行了量化。考虑到这些患者和第一项研究中的36例患者，79例患者回肠IL-10 mRNA水平随IL-10水平的变化而变化。G等位基因。如图2所示，14%具有G7或G8等位基因的患者回肠IL-10 mRNA产量最高，而57%具有G10或G13等位基因的患者回肠IL-10 mRNA产量最低。只有G8等位基因(16888v504;p = 0.0098)(图2)。然而，与所有其他等位基因组合的平均值相比，至少具有两种G7-8中的一种的患者回肠IL-10 mRNA的浓度显著不同(中位数6893)v504;p=0.006)或G10-13(中位数249v2711;p=0.029)等位基因(图2B)。在36例复发或未复发的患者中，G7-8和G10-13等位基因的频率相似(表3)。
(A) 79例患者回肠白细胞介素(IL)- 10mrna的中位数(方框内的横条)根据其IL-10的不同。G等位基因，绘制在回肠IL-10 mRNA的递减值。与所有其他患者(开框)相比，至少有一个等位基因拷贝的患者(阴影框)的IL-10合成差异仅在G8等位基因中显著(**p<0.001)。(B)与所有其他等位基因组合的平均值(开框)相比，至少具有G7-8等位基因(**p<0.001)或G10-13等位基因(阴影框)中的一种的患者回肠IL-10 mRNA浓度显著不同(*p<0.05)。
讨论
许多尝试已经确定乳糜泻切除术后复发的预测因素。患者和疾病相关因素，如吸烟习惯，12肠道受累部位和疾病形式13一直显示。在我们的研究中，年龄、性别、吸烟习惯、疾病持续时间和部位、手术指征并不能预测复发。然而，竞争PCR定量回肠IL-10 mRNA浓度反映复发风险增加。这些结果首次表明，手术时回肠IL-10 mRNA浓度的测定可能定义需要更强化的术后护理的复发风险更高的患者。
与Schreiber的研究相反等表明TNF-α和IL-1β分泌增加可能预示类固醇诱导缓解患者的临床复发，4在我们的研究中，TNF-α和IL-1β mRNA水平不能预测术后复发。这种差异至少可以部分解释为复发的定义(内镜下)v临床)和被研究患者的不同疾病阶段。我们先前已经证明，不同的细胞和分子介质参与了发生在新膜的早期病变3.在类固醇诱导缓解后患者所见的既定病变中。4不同的介质可预测术后早期肠道复发或已确定病变患者的临床复发，这一事实表明，不同的机制涉及疾病的这两个不同阶段。另一种解释可能是用于量化细胞因子的方法不同。以下两等考察了隔离能力固有层体外刺激后，通过ELISA检测单个核细胞产生TNF-α和IL-1β，而我们直接在未受刺激的健康回肠黏膜活检上，在体内量化这些细胞因子的mRNA。在这种情况下，TNF-α和IL-1β可能检测不到。由于IL-10下调TNF-α和IL-1β的分泌，14确定它是否受到刺激会很有趣固有层单核细胞在低IL-10产生组比在高IL-10产生组产生更多的促炎细胞因子。
许多因素参与了IL-10生产的控制。对同卵、异卵双胞胎和非亲缘个体自发产生IL-10差异的分析表明，IL-10的产生能力有一个主要的遗传成分。15个体之间产生IL-10能力的显著差异(通过脂多糖激活的全血培养)是IL-10 mRNA合成速率不同的结果，这被归因于IL-10基因启动子的多态性。高度多态微卫星标记，即IL-10中的16个等位基因。在IL-10启动子中的G，已经被描述过。16与人类IL-10启动子结构相关的研究表明，在体外刺激外周血白细胞后，含有G7和G14等位基因的单倍型分别与IL-10产生的低或高相关。17IL-10启动子结构是否与肠道IL-10 mRNA在体内的自发生成有关的问题仍有待解决。在本研究中，G14等位基因与较高的肠道IL-10产量无显著相关性。然而，我们发现G7-8等位基因与回肠IL-10 mRNA产量的增加相关最大，而G10-13等位基因的水平最低。这些结果表明，肠道产生IL-10的能力至少部分由遗传成分控制，这些遗传成分与激活的外周血细胞产生IL-10的基因部分不同。由于IL-10基因启动子多态性与复发无关，我们认为它们不是预测术后ER的实用遗传标记。IL-10 mRNA产生率和与ER相关的IL-10基因启动子多态性之间的差异至少可以部分解释为其他遗传影响或环境因素的参与，如营养、18，19感染,20.或菌群21这也可能影响肠道IL-10的产生。
致谢
这项研究得到了加莱Pas de Calais和CHU de Lille给B Meresse的康塞尔北部地区的资助。作者感谢IFR 22、C Bisiaux (EPI 0114, CHU Lille，法国)、C Mouton和M Crépin(高原技术de séquencage, CHU Lille，法国)的技术援助。
参考文献
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