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摘要
背景和目的:最近，新的生长抑素受体(sstr)亚型特异性配体类似物已被开发用于表达不同sstr的神经内分泌肿瘤的医学治疗(sstr1-5)。目前，sstr亚型的个体表达模式主要基于原位杂交和转录水平的聚合酶链反应等方法。因此，我们生成了针对sstr1、2A、3和5的亚型特异性抗体，并通过免疫组织化学在翻译水平上分析了它们在33个胃泌素瘤、36个胰岛素瘤和35个与类癌综合征相关的肿瘤中的存在、细胞定位、分布和表达模式。
方法:以正常胰腺为参照器官和肿瘤组织进行Western blotting实验;在细胞水平上，用免疫组化方法在组织石蜡切片中定位SSTRS。
结果:在western blot分析中，抗体在胰腺和神经内分泌肿瘤提取物的正确分子范围内识别了各自的受体。利用免疫组织化学和免疫荧光技术，抗体特异性地检测正常胰腺胰岛细胞中的受体。肿瘤的免疫组化显示，所有被研究的sstr亚型在不同肿瘤类型中均高表达。单个sstr亚型的频率和表达模式不仅在不同肿瘤类型之间，而且在每个患者中也有很大差异。
结论:我们得出结论，亚型特异性抗体免疫组化可用于临床常规工作，在治疗前分析每个患者的sstr表达模式，并通过给予亚型特异性生长抑素类似物来促进良好的定向个体化药物治疗。
- 内分泌肿瘤
- 生长激素抑制素受体
- octreotide闪烁扫描法
- 胰腺
- 肠
- 免疫组织化学
- 党卫军,生长激素抑制素
- Sstr，生长抑素受体
- PBS，磷酸盐缓冲盐水
数据来自Altmetric.com
神经内分泌胃肠-胰腺肿瘤的特征是产生和分泌具有生物活性的多肽和胺，可引起不同的临床综合征，包括消化性溃疡(胃泌素瘤)、威胁生命的低血糖发作(胰岛素瘤)或严重腹泻和潮红(类癌综合征的肿瘤)，或者功能不活跃。1，2由于许多患者在诊断时表现为转移性疾病，他们接受药物治疗以控制症状和抑制肿瘤生长。在这方面，生长抑素(SS)类似物，如奥曲肽，第一个临床使用的类似物，在这些患者的诊断和临床管理中具有特别重要的意义。2 -4奥曲肽和其他类似物给药的分子原理是基于SS受体(sstr)，通过放射自显像术和奥曲肽显像术在神经内分泌肿瘤中检测到SS受体。5，6事实上，至少有五个不同的人类sstr子类——即sstr1到5——已经被克隆和鉴定。7 -10这些受体在不同的SS类似物的分子结构、组织分布、细胞内信号转导和药理学特征上显示出明显的差异。10日,11所有受体亚型结合生长抑素-14 (SS-14)具有高亲和力，但它们对SS类似物的亲和力差异很大。奥曲肽、lanreotide和RC-160具有相似的结合特征，对sstr2和sstr5具有高亲和力，但对sstr3具有低亲和力，对sstr1和sstr4没有亲和力。10由于肿瘤中sstr2的缺失伴随着奥曲肽的肿瘤反应缺失，12，13结论奥曲肽主要通过sstr2介导其作用。10日,14通过SS类似物结合sstr导致抑制这些肿瘤的激素过度分泌和细胞增殖。3.10日,15
尽管神经内分泌肿瘤中sstr的表达与治疗期间奥曲肽对激素释放和肿瘤生长的抑制作用呈正相关，16只有一些患者对长效SS类似物的治疗有反应。在这方面，开发和应用对其受体亚型具有高亲和力的新型sstr亚型特异性类似物可能对未来治疗sstr阳性肿瘤具有重要意义。13然而，这种选择需要在治疗前确定每个患者的sstr状态。目前，sstr亚型的受体状态和个体表达模式是通过原位杂交或聚合酶链式反应在转录水平上检测的。尽管sstr1和sstr2已在单个肿瘤中被免疫组织学检测到，17 -19目前尚无关于神经内分泌肿瘤中个体SSTRS受体状态和表达模式的系统数据。特别是，虽然最近的研究提出高剂量SS类似物可能通过与sstr3结合而诱导细胞凋亡，但尚无关于sstr3的数据。20.21
我们开发了一组sstr亚型特异性抗体，通过免疫组化方法识别神经内分泌肿瘤中单个sstr蛋白的存在、细胞定位、分布和肿瘤特异性表达模式。这种在临床常规工作中对应激反应进行的免疫组化分析可能是对患有这些肿瘤的患者进行个人诊断和治疗选择的基础。
方法
病人、肿瘤和组织准备
研究了33例胃泌素瘤患者、36例胰岛素瘤患者和35例类癌综合征患者的神经内分泌肿瘤(详情见表1)。根据经典临床症状(胃泌素瘤:消化性溃疡;胰岛瘤:低血糖;类癌肿瘤:严重腹泻和/或发红)、实验室检查结果和免疫组织病理学检查(Grimelius染色、嗜铬粒蛋白A、神经元特异性烯醇化酶、突触素、血清素、胃泌素、SS、血管活性肠肽、胰高血糖素、胰岛素和胰腺多肽的免疫组织化学检查)。此外，一些患者接受SS受体显影[111In-DTPA-D-Phe1octreotide。
肿瘤样本来自于1983年至1998年间在德国马尔堡菲利普斯大学普通外科进行的肿瘤手术切除。肿瘤组织分别从肿瘤中心切除，以排除正常组织的污染。肿瘤边缘外的正常组织被分离出来并证实组织学正常。切除后，将组织固定在Bouin固定液中进行免疫组化或立即冷冻在液氮中进行western blot分析。表1总结了患者病史(诊断、肿瘤位置、奥曲管扫描)的相关数据。在一些病例中，患者接受了奥曲肽治疗，但本研究中调查的组织都是在治疗前获得的。
多肽合成，免疫程序，抗血清生成
如前所述，合成了以下多肽22(Gramsch Laboratories, Schwabhausen, Germany)参考已发表的人类SS序列7 -9: sstr1 (377-391)， sstr2A (355-369)， sstr3(381-395)，和sstr5(350-364)。经高效液相色谱纯化后，这些肽通过氨基末端添加的半胱氨酸和琥珀酰亚基4-[n -马来酰亚甲基]环己烷-1-羧酸酯连接物与锁眼帽帽血色素(Sigma Chemical Co, St Louis, Missouri, USA)偶联。兔(Zikahybrid)用完全弗氏佐剂乳化的肽缀合物按1:1 (vol/vol)进行皮下免疫。他们每四周接受一次强化注射，并在每次强化注射后14天出血。用酶联免疫吸附法检测抗体滴度。在产生的抗体中，识别sstr1的抗体4819(377-391)、针对sstr2A的抗体6291(355-369)、针对sstr3的抗体4823(381-395)和针对sstr5的抗体6006(350-364)的抗体滴度最高。这些抗体已在sstr转染的HEK-293细胞、免疫印迹分析和免疫组化中使用并详细描述。22日-24
组织蛋白制备及蛋白印迹法
用含10 mM Tris HCl、pH 7.4、250 mM蔗糖、1 mM EDTA、1% Triton X-100、2 μg/ml leupeptin、2 μg/ml pepstatin和1 mM苯甲基磺酰氟的Tris HCl缓冲液提取胰腺和肿瘤组织中的蛋白质。western blot分析，25 μg总蛋白(Lowry法测定)用8%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离。分离的蛋白质转移到疏水聚偏氟乙烯基膜上，并与各种抗血清一起稀释(也用于免疫组化)(见下文)。用碱性磷酸酶偶联山羊抗兔IgG(稀释1:30 000;Sigma)使用硝基蓝四氮唑和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸作为显色剂(Sigma)。抗体与相应的肽免疫原预孵育后，免疫反应被特异性阻断。通过适当的对照，排除与第二种山羊抗兔抗体的任何交叉反应。25，26
免疫组织化学和免疫荧光
对来自原发肿瘤或肿瘤转移时来自肝转移的组织标本进行免疫组化。组织在Bouin固定液中固定20小时，脱水，石蜡包埋。如前所述，用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)技术对切片(5 μm)进行免疫染色25 -27:切片用二甲苯脱蜡，在分级的乙醇中再水化，并在10mm柠檬酸(pH 6.0)中在600 W下微波20分钟。用3%牛血清白蛋白阻断非特异性结合位点30分钟后，切片用各自的抗血清(sstr抗体4819、6291、4823和6006，各稀释1:500;用于肿瘤鉴定的嗜铬粒蛋白A、神经元特异性烯醇化酶、突触素、胃泌素、SS、胰高血糖素、胰岛素和胰腺多肽抗体购自Dako(德国汉堡)，稀释后为1:100 - 1:400;抗血清素和血管活性肠肽抗体从Sorin (Düsseldorf，德国)购买，稀释1:10 000 - 1:10 000)，在4℃过夜，然后与生物素化抗兔IgG (Dako)以1:200的稀释率孵育30分钟。然后用预先形成的生物素-过氧化物酶/链霉亲和素(Dako)复合物孵育30分钟，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释(最终浓度:生物素-过氧化物酶0.7 μg/ml;链霉亲和素5 μg/ml)。在0.7 mM盐酸二氨基联苯胺/0.002% H中孵育切片，可见抗原抗体结合位点2O20.05 M Tris HCl (pH 7.6)。PBS被用作抗血清的稀释剂和漂洗溶液。或者，用免疫荧光显微镜检测受体，方法是将切片与相同的sstr抗体在4℃孵育过夜，然后用1:200稀释的Cy3标记的抗兔IgG (Dianova, Hamburg, Germany)孵育。免疫染色在配有适当滤镜的蔡司Axioplan显微镜中进行。
虽然所有组织切片处理相同(固定时间、免疫组化方案和抗体稀释)，但在sstr表达上有显著差异。当未观察到sstr免疫染色时，肿瘤被归类为阴性，即使在高倍目标值下，尽管神经内分泌肿瘤标记物的免疫染色是明确的(见上文)。
特异性控制
对于获得的免疫反应性，通过运行以下对照来排除免疫组化方案中的非特异性25，26(i)在免疫组化方案中省略单个步骤，(ii)添加聚赖氨酸(Mr15 000;2毫克/毫升;Sigma)到第一抗体，(iii)在免疫组化方案的各个步骤之间使用高摩尔(0.5 M) PBS作为漂洗溶液。用同源和异源抗原肽(6.25 ~ 100 μg/ml)预吸附所有抗血清，检测抗体的特异性。25，26同种抗原在6.25 μg/ml浓度下预吸附抗血清完全阻断胰腺组织和肿瘤的免疫染色，而异源抗原在100 μg/ml浓度下预吸附抗血清对免疫染色无影响。
统计评估
数据用χ进行分析2测试独立性。p<0.01时认为差异显著。
结果
人类神经内分泌肿瘤经组织病理学检查确定为胃泌素瘤、胰岛素瘤和类癌肿瘤。虽然其中一些肿瘤不是单细胞类型的，但各自的诊断是根据肿瘤的经典临床症状和实验室结果做出的。
为了分析这些肿瘤中sstr亚型的存在、细胞定位和肿瘤特异性表达模式，我们提出了一组针对sstr1、2A、3和5的亚型特异性抗血清，并将其用于western blotting分析和免疫组化。在正常胰腺组织的western blot分析中，针对sstr1的抗体4819和针对sstr5的抗体6006分别鉴定出了分子量为~ 60和~ 65 kDa的免疫反应蛋白(图1)。针对sstr2A的抗体6291鉴定出了分子量为~ 80 kDa的免疫反应蛋白。同样，抗体4823鉴定出分子质量为~ 80 ~ 45kda的sstr3。此外，所有sstr抗体在胃泌素瘤、胰岛素瘤和类癌肿瘤中都能识别分子大小相同的免疫反应蛋白(图1)。
Western blot分析了同一患者正常胰腺(通道1)和胰腺胰岛素瘤(通道2)中生长抑素受体(sstr)亚型sstr1 (A)， sstr2A (B)， sstr3 (C)和sstr5 (D)。注意肿瘤组织的免疫反应性应激与作为参考器官的胰腺的免疫反应性应激相吻合。
在正常胰腺组织中，作为阳性对照，用亚型选择性sstr抗体进行的免疫组织化学和免疫荧光研究显示，每种sstr亚型的细胞分布具有独特的模式，在胰岛细胞中具有强烈的免疫反应性。虽然在胰岛细胞的细胞质和部分细胞膜上检测到sstr1、3和5的免疫反应性，但清晰的sstr2A免疫染色主要定位在细胞的质膜上(图2,3)。含有相应抗原的抗体预吸收完全阻断了胰腺组织中的免疫染色(图2)。
用免疫组织化学方法定位正常人胰腺中的生长抑素受体(sstr)亚型。所有受体亚型((A) sstr1;(C) sstr2A;(E) sstr3;(G) sstr5)明显定位于胰岛细胞。注意，胰岛(箭头)的免疫染色被抗体((B) sstr1;(D) sstr2A;(F) sstr3;(H) sstr5)。(比例尺:A、C、E、G=20 μm; B, D, F, and H=30 μm.)
使用免疫荧光定位正常胰腺中的生长抑素受体(sstr)亚型。注意所有的sstr子类型((A) sstr1;(B) sstr2A;(C) sstr3;(D) sstr4)明显定位于胰岛细胞。(比例尺A-D =20 μm。)
神经内分泌肿瘤的免疫组化显示，sstr1、2A、3和5都在胃泌素瘤、胰岛素瘤、类癌肿瘤及其各自的肝转移灶中高表达(图4)。尽管在大多数阳性染色的肿瘤中，大多数肿瘤细胞中获得了各种亚型的sstr免疫反应性，但相当一部分肿瘤未显示均匀染色;SSTRS的免疫反应集中在这些肿瘤的细胞群上。在细胞水平上，sstr2A仅定位于肿瘤细胞的质膜上;在细胞质中没有发现sstr2A(图4-6)。相比之下，sstr1、3和5主要在细胞质中显示免疫染色(图4-6)。
生长抑素受体(sstr)亚型在胃泌素瘤、胰岛素瘤和类癌中的免疫组化定位。虽然所有的sstr亚型都在各自的神经内分泌肿瘤中表达，但亚型的个体表达模式在肿瘤类型之间差异很大。(比例尺A-L =30 μm。)
胰岛素瘤中生长抑素受体(sstr)亚型的免疫组化定位显示，sstr1 (A)， sstr3 (C)和sstr5 (D)在被非免疫染色的肿瘤细胞包围的单细胞中被检测到。相反，sstr2A (B)存在于几乎所有的肿瘤细胞中。(比例尺A-D =30 μm。)
胰岛素瘤中生长抑素受体(sstr)亚型的免疫组化亚细胞定位。虽然sstr1 (A)， sstr3 (C)和sstr5 (D)主要定位于肿瘤细胞的细胞质中，但sstr2A (B)的免疫反应性仅在所有肿瘤类型的肿瘤细胞的质膜中检测到。(比例尺A-D =12 μm。)
有趣的是，在不同的肿瘤中，sstr亚型之间的细胞水平表达模式和受体表达频率差异很大(表1)。虽然sstr1免疫反应性存在于10个(30%)胃泌素瘤、11个(31%)胰岛素瘤和13个(37%)类癌中，但sstr2A在所有(100%)胃泌素瘤、21个(58%)胰岛素瘤和30个(86%)类癌中表达。在26例(79%)胃泌素瘤、28例(78%)胰岛素瘤和25例(71%)类癌中观察到sstr3染色;在25例(76%)胃泌素瘤、28例(78%)胰岛素瘤和29例(83%)类癌中检测到sstr5免疫反应。然而，除sstr2A外，肿瘤类型或肿瘤位置相关的受体表达频率未见显著差异。sstr亚型在所有起源于胰腺或肠道的肿瘤类型中持续存在。关于sstr2A，胰岛素瘤中的表达频率远低于胃泌素瘤或类癌肿瘤。
本研究纳入的104例患者中，22例接受了奥曲肽显像检查。对比分析显示闪烁显像与sstr2A免疫组化高度相关;只有2例SSTR显像结果与免疫组化结果不一致。
讨论
基于SS受体sstr2和5的表达，与sstr2和sstr5结合的长效SS类似物，如奥曲肽、lanreotide和RC-160，在神经内分泌肿瘤患者的症状管理中变得越来越重要。3.10然而，相当一部分这样的肿瘤对目前的治疗没有反应。13在这方面，特定亚型SS类似物的潜在价值正在进行深入讨论，14特别是由于不同的SSTR亚型似乎参与了不同的抑制激素分泌或细胞增殖和凋亡的途径。10日,20.21虽然sstr mrna的存在已经在各种肿瘤中进行了检查10使用昂贵的方法，如原位杂交，没有在翻译水平上表征神经内分泌肿瘤中单个SSTR亚型表达模式的受体状态的数据。在本研究中，我们提出了针对sstr1、2A、3和5的亚型特异性抗体，并通过免疫组织化学方法系统地分析了它们在胃泌素瘤、胰岛素瘤和类癌中的存在、细胞定位、分布和个体表达模式。
这些抗体对各自的sstr亚型有特异性，没有任何交叉反应。在已知表达各种sstr亚型的正常人类胰腺的western blot分析中，28sstr1抗体4819和sstr5抗体6006分别在~ 60和~ 65 kDa范围内清晰识别出免疫反应蛋白，这与这些亚型的分子质量相对应。10抗体6291在~ 80 kDa特异鉴定出sstr2A。事实上，据报道，sstr2在80 kDa范围内以该蛋白的糖基化形式出现。10日,29类似地，sstr3抗体4823识别出分子量为~ 80 kDa的免疫反应蛋白，此外，分子质量明显为~ 45 kDa，这与糖基化的sstr3相对应10根据各自的cDNA序列推断，8分别。
值得注意的是，所有的sstr抗体也在胃泌素瘤、胰岛素瘤和类癌肿瘤的组织提取物中检测到相应的蛋白质，这些蛋白质与正常人类胰腺中的免疫反应条带完全吻合。这些发现表明，SS受体亚型不仅存在于胰腺中，它们也在神经内分泌肿瘤中高度表达。
为了检验其在Bouin固定石蜡切片中的免疫组化适用性，首先将抗体用于正常人胰腺的免疫染色。他们揭示了胰岛细胞清晰的强染色，正如先前研究预期的那样。28，30.免疫阳性细胞分布模式显示，A、B、D细胞分别被抗血清染色。在对神经内分泌肿瘤患者肿瘤组织的免疫组化研究中，sstr抗体不仅在类癌肿瘤中产生特异性免疫染色，如sstr2A所示17日,31还有胃泌素瘤，胰岛素瘤，以及它们各自的肝转移。虽然大多数肿瘤的免疫反应性是相同的，但相当一部分肿瘤的免疫染色局限于组织的少数细胞群，这表明受体的密度在患者之间差异很大。有趣的是，受体亚型1、3和5的免疫反应性主要集中在细胞质中;sstr2A的免疫反应性仅局限于表达该受体的所有肿瘤类型的细胞膜。这些不同的位置可能是由于合成活性的差异，细胞内靶向机制，或某些受体亚型的内化。在这方面，我们针对sstr1、3和5的抗体可能优先识别内化受体。关于sstr2A，这种受体只在细胞膜上定位可能是因为我们的抗体只检测肿瘤中受体的整体膜形式，也可能是因为这种受体亚型的快速靶向和整合到细胞膜中。因此，受体的细胞质形式将逃避抗体的检测。事实上，后一种解释似乎是相当合理的，因为此前各研究人员对sstr2A的免疫组化分析表明，强烈的sstr免疫反应性主要在肿瘤细胞的质膜上发现。17日,31
值得注意的是，不同的SS受体亚型在不同的肿瘤中表现出不同的表达模式，甚至在同一种肿瘤类型中(见表1)。此外，在5名患者中，没有检测到sstr1、3或5的免疫染色;这些患者只表达受体sstr2A。在一个病例中，sstr5单独存在，在另外两个病例(胰岛素瘤)中，肿瘤细胞没有表达任何被研究的sstr亚型。这些发现表明，患者的受体状态有很大差异;一名神经内分泌肿瘤患者可能同时表达多种SSTR亚型，作为个体表达模式，从而表达特殊的受体状态。因此，在治疗前确定每个患者的这种表达模式具有特殊的临床意义。
值得注意的是，sstr的表达频率在不同的sstr亚型之间有显著差异，对于sstr2A，在不同的肿瘤类型之间也有显著差异。虽然sstr2A存在于86%的类癌肿瘤中，甚至存在于100%的胃泌素瘤中，但它只在58%的胰岛素瘤中被检测到。如前所述，50%的胰岛素瘤对奥曲肽治疗无反应，20.32这些患者中sstr2A的缺失可能解释了这种药物主要与受体亚型2结合缺乏任何药理作用。相比之下，超过90%的胃泌素瘤在使用奥曲肽治疗时反应充分，改善了临床症状，13证实了sstr2A在这种肿瘤类型中的高表达率。
用于sstr阳性肿瘤的显像，SS受体显像与[111In-DTPA-D-Phe1在一些病例中使用奥曲肽。免疫组化sstr2A染色与SS受体显像示踪剂摄取之间存在高度相关性，这与之前的研究预期一致。17然而，由于[111In-DTPA-D-Phe1奥曲肽可以与sstr2和5结合，并在较小程度上与sstr3结合，4,6该技术在肿瘤表达的SSTR亚型的测定中被证明是无效的。因此，免疫组织化学分析在确定受体的表达模式方面更合适和更有效，可以取代奥曲肽闪烁术。此外，个体sstr表达模式的免疫组化检测对于肿瘤生物学和神经内分泌肿瘤的生长行为也很重要，因为这些因素似乎依赖于肿瘤的个体sstr状态。10
总之，许多患有神经内分泌肿瘤的患者对奥曲肽治疗没有任何反应。但在奥曲肽显像阴性的患者中，碘化SS本身(SS-14或SS-28)被证明与SS受体特异性结合。33岁的34在这些患者中奥曲肽和SS-14/SS-28配体之间的这种差异结合表明奥曲肽不与所有sstr亚型结合，应该创建新的sstr亚型选择性类似物来治疗表达这种特定亚型sstr的肿瘤患者。事实上，针对各自的sstr亚型的高度特异性类似物最近被开发出来，以实现更有效的药物治疗。35如本研究所示，sstr亚型特异性抗体可用于临床常规工作，在治疗前确定每个患者的个体SS受体状态。由于个体sstr亚型的表达在不同的肿瘤类型中，甚至在每个患者中都不同，因此这些受体的免疫组化测定对于良好指导个人医疗计划具有特殊的临床重要性。未来的研究应分析SS类似物治疗的结果与免疫组织化学测定的各自sstrs密度的关系。
致谢
我们感谢D Bonorden女士(马尔堡菲利普斯大学消化病学系)的专家技术援助和I女士Böddeker(马尔堡菲利普斯大学医学生物计量学和流行病学研究所)的统计计算。本研究得到了马尔堡菲利普斯大学研究池的支持，德国联邦研究院(Deutsche Forschungsgemeinschaft)授予SCHU 924/4-1 (SS)，欧盟委员会授予QRTL-1999-00908 (SS)。