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背景:肠毒素(肠出血性大肠杆菌)和致肠病的(EPEC)大肠杆菌上皮细胞粘附的特点是亲密的依恋,依恋和消除(A / E)损伤的形成。这个事件是介导的intimin绑定到另一个细菌的蛋白质,行动(转移intimin受体),出口的细菌和整合到宿主细胞的质膜。重要的是,EPEC (O127:代替)和肠出血性大肠杆菌O157: H7表达抗原不同intimin类型称为intiminα和γ,分别。肠出血性大肠杆菌O157: H7它生活人类肠道外植体虽然粘附仅限于派尔集合淋巴结滤泡相关上皮的补丁。这种表型也观察到与EPEC O127:编辑工程表达肠出血性大肠杆菌intiminγ。
目的:探讨intimin对殖民的影响人类的肠道大肠杆菌O157: H7和intimin类型在人类组织取向。
方法:人类肠体外器官培养与野生型和突变株O157: H7是就业。
结果:引入的缺失突变运算单元基因编码intiminγ导致肠出血性大肠杆菌O157: H7)应变(ICC170)失败移植人类肠道外植体。然而,殖民的派尔集合淋巴结补丁和A / E病变形成恢复与intiminγ表达式从质粒(ICC170 (pICC55))。相比之下,补充的突变intiminα导致应变(ICC170 (pCVD438))能够殖民和生产/ E病变淋巴集结和其他小肠外植体。
结论:Intimin对于人类肠道粘膜殖民化是必要的大肠杆菌O157: H7。Intimin类型的殖民影响网站行动类型独立机制;intiminγ似乎限制殖民统治人类的滤泡相关上皮。
- intimin
- 肠出血大肠杆菌
- 体外器官培养
- 肠
- 肠出血性大肠杆菌
- 肠出血大肠杆菌
- EPEC、致肠病的大肠杆菌
- A / E、附加和消除
- 行动,转移intimin受体
- IVOC,体外器官培养
- 李,肠上皮细胞的抹杀
- VTEC, verocytotoxigenic大肠杆菌
- STEC,产志贺毒素大肠杆菌
- 仙灵,滤泡相关上皮
- Esp, EPEC分泌蛋白
- FAS,肌动蛋白荧光染色
- SEM扫描电镜
- PCR,聚合酶链反应
来自Altmetric.com的统计
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Verocytotoxin(或志贺毒素)生产大肠杆菌(VTEC或STEC)是一个重要的例子,一个新兴的群微生物病原体与食物中毒有关。1例如,某些VTEC大肠杆菌O157: H7,人类会引起出血性结肠炎和溶血性尿毒综合征,称为肠出血大肠杆菌(肠出血性大肠杆菌)。
肠出血性大肠杆菌,与致肠病的共同之处大肠杆菌(EPEC),可以形成特有的附加和消除(A / E)病变在哺乳动物细胞生长在文化2和动物。3虽然肠出血性大肠杆菌O157: H7被认为殖民人类大肠道粘膜,1肠出血性大肠杆菌和A / E协会病变形成人体组织并没有证明直到最近4当我们显示,使用体外器官培养(IVOC)儿科肠粘膜,肠出血性大肠杆菌具有明显的趋向性的滤泡相关上皮(身上)的回肠派尔集合淋巴结补丁导致/ E病变。相比之下,没有粘连明显黏膜表面的近端或远端小肠或结肠。4这个观察与粘附模式由EPEC展出,其中包括整个小肠粘膜结肠殖民。4
第一个基因与A / E的EPEC活动运算单元基因编码intimin,外膜粘附分子亲密的细菌对真核宿主细胞所必需的。5的运算单元基因中也发现了肠出血性大肠杆菌O1576和其他肠出血性大肠杆菌血清型,7和已被证明是需要的殖民O157: H7的动物模型。8日,9
intimin编码运算单元基因的一部分致病性岛EPEC和肠出血性大肠杆菌感染称为肠上皮细胞的轨迹抹杀(李)。10日,11除了intimin,李还编码III型分泌系统(由弗兰克尔和他的同事们了12)一个intimin受体(行动/ EspE),13日,14和三个分泌蛋白质载荷适配器、EspB和EspD所需宿主细胞内的信号转导和A / E病变的形成。12日,15载荷适配器是一种结构蛋白和一个主要组件的大型丝状细胞器的短暂地表示在细菌表面和与宿主细胞相互作用的早期阶段/ E病变的形成。16日,17载荷适配器丝可能导致细菌粘附但更大的意义在于,它们似乎移位器的一个组件,因此EspB易位的至关重要16和行动13进入宿主细胞。值得注意的是,有大量的肠出血性大肠杆菌和EPEC李编码基因产物之间的分歧,直接与主机交互(即intimin、行动和esp),11李,EPEC是必要的和足够的/ E病变的形成18而肠出血性大肠杆菌李是必需的,但还不够。19
至少五个不同intimin类型,指定的α,β,γ、δ、ε,迄今为止已确定。20.21与一个特定的重要的是,intiminα有关EPEC的进化分支称为EPEC 1, intiminβ相关联的EPEC和肠出血性大肠杆菌属于各自的克隆,而intiminγ是专门与肠出血性大肠杆菌O157及其相关应变EPEC O55: H7。22研究不同intimins EPEC和肠出血性大肠杆菌表明受体结合活动是局部的C端280个氨基酸(Int280)。23一些团体报道,intimin可以直接绑定到未受感染的宿主细胞23 -25和行动。13日,14日,24绑定到宿主细胞而不是行动取决于Int280的羧基端二硫化物桥。24然而,当表达了EPEC的表面上,这两种绑定intimin活动所需的亲密细菌粘附和A / E病变的形成。
最近的结果表明,不同intimin类型可能会扮演一个角色在决定殖民化的模式和组织趋向性的主机。其中包括intimin交换研究在小猪26用人类肠道外植体,我们最近的调查显示,尽管EPEC表达intiminα殖民淋巴集结以及近端和远端小肠组织,4限制模式的组织取向对派尔集合淋巴结补丁之后的表达intiminγEPEC肠出血性大肠杆菌感染的背景。27本研究的目的是测试的重要性在人类肠道粘膜的殖民intimin O157: H7和调查的影响intimin在组织取向在肠出血性大肠杆菌表达的背景。
方法
细菌菌株和质粒
肠出血性大肠杆菌O157: H7,菌株85 - 170表达intiminγ,是一个自发Stx肠出血性大肠杆菌84 - 289的负导数原本孤立的从食品处理器加拿大养老院。28CVD206是EPEC O127:代替窝藏缺失突变的运算单元基因编码intiminα。29日细菌粘附的研究之前,亚文化在脑心浸液肉汤和耗氧孵化一夜之间没有风潮在37°C。在适当的时候,氯霉素是添加到最后一个30μg /毫升的浓度。在这项研究中使用的质粒是表1中列出。
建设一个运算单元缺失突变体的肠出血性大肠杆菌菌株85 - 170
为了引入一个缺失突变运算单元基因,我们利用两个独一无二的Nru我在pCVD444限制性位点6这是位于基因的编码区(图1)。消化和凝胶净化后,质粒是自我的结扎,导致质粒中包含一个1873个基点删除吗运算单元基因(图1)。使用聚合酶链反应(PCR)引物EAE1F TCTATT (5”CCCGGGAATGAAAACAGATTGTGTTCTTTTGC 3 ';定位在16 001至037个基点的李地区肠出血性大肠杆菌O157: H7)和EAE2R (5 ' AGAACATTCCCGGGTACATTTCAGCAGATATTTTTCCC 3 ',定位在19 759 - 19李地区的722个基点(加入AF071034)),包含一个5 'Sma我的网站(下划线),删除运算单元基因和DNA侧翼恢复1885个基点的片段。这个片段是凝胶纯化和结扎成Sma我消化自杀向量,pCVD442。的重组pCVD442被用来electroporate肠出血性大肠杆菌O157: H7运算单元积极应变85 - 170。氨苄青霉素抗性殖民地被孤立和镀到10%蔗糖L-agar盘子,一夜之间长大30°C,选择双交叉隔离。氨苄青霉素敏感克隆包含运算单元删除被确定使用引物PCR扩增EAE1F EAE2R。1885个基点的PCR产物,预期的运算单元删除克隆,获得超过50%的蔗糖耐药和氨苄青霉素敏感的殖民地。其余的殖民地产生了3758个基点的PCR产物片段类似于野生型菌株。
显示施工示意图表示运算单元删除的肠出血大肠杆菌(肠出血性大肠杆菌)85 - 170。Nru我质粒的酶消化pCVD444用于介绍中删除运算单元基因编码intiminγ。re-ligation和聚合酶链反应扩增后,包含的删除形式的DNA片段运算单元自杀基因克隆在矢量pCVD442和删除被等位基因交换引入肠出血性大肠杆菌感染,如实验过程。内的数字代表核苷酸结构运算单元基因。上游(3 '末端的基因行动和c)和下游(escD)运算单元也表示。(规模)。
检测intimin表达蛋白免疫印迹和荧光肌动蛋白染色(FAS)
intimin衍生品的表达式是由西方的污点。intimin immunodetection的完整的细胞提取物、固定L-broth文化被稀释1:10 0在杜尔贝科的修改鹰的媒介和孵化了三个小时在37°C。一个相当于一个光密度600 (OD600年0.5)加载到7.5%钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳,如前所述。电泳多肽被转移到硝酸纤维素和immunodetection intimin执行使用一个通用兔子intimin抗血清,提出针对intimin守恒的地区(Int387 - 666),稀释1:50 0如前所述。20.30.FAS测试,来检测/ E HEp-2细胞病变形成感染,如前所述。2
组织样本
得到人体组织充分了解父母的同意和当地伦理委员会批准,在常规调查潜在的肠道疾病的患者。粘膜活检的近端小肠粘膜(第四部分十二指肠)、回肠末端,派尔集合淋巴结补丁,和横结肠使用掌握在例行内镜活检钳(奥林巴斯PCF儿科内窥镜)。派尔集合淋巴结补丁能够识别并有选择地在内镜检查,技术更容易通过视频内镜的应用。中位数年龄和年龄范围的病人如表2所示。内镜活检都是从区域显示没有明显的病理或其他异常,和所有肠道组织学正常报道是在这项研究中使用的材料。
体外器官培养
进行体外器官培养(IVOC)如前所述八小时。31日每个菌株研究在人类IVOC至少三次使用组织从不同的孩子。一个未经变质处理的标本是包含在每个实验文化排除体内细菌殖民化的可能性。孵化后细菌或适当的控制解决方案,IVOC标本被彻底清洗三次删除任何non-adherent细菌,然后准备扫描电子显微镜(SEM),如前所述。31日样本与2.5%戊二醛固定0.1磷酸盐缓冲剂,你找找在1%水四氧化锇,和脱水2 2 dimethoxy-propane。标本被转移到绝对乙醇,严重点干使用液态二氧化碳的Emitech K850装置,安装在铝存根,溅射涂gold-palladium使用极化子E5100溅射涂布机,并查看在5300年JEOL SEM的加速电压30千伏。
结果
建设一个运算单元缺失突变体的肠出血性大肠杆菌菌株85 - 170
在以前的研究中我们已经表明EPEC表达intiminα殖民的任何地区IVOC小肠粘膜而肠出血性大肠杆菌表达intiminγ显示限制取向对人类淋巴集结粘膜。本研究的目的是确定的结果感染肠出血性大肠杆菌感染的人类肠道的不同区域运算单元零变异(应变ICC170)和ICC170补充运算单元编码要么intiminγ或intiminα。
为此,我们引入了运算单元删除肠出血性大肠杆菌的突变菌株85 - 170(见方法和图1),ICC170产生压力。删除的确认是通过PCR(见方法;数据未显示)。的运算单元突变与pCVD438 ICC170补充在反式,编码intimin EPECα。29日此外,ICC170补充,控制,与pCVD438/01编码一种生物活性的intiminα半胱氨酸在937位置的Ser取代,32或pICC55 pCVD438微分包含的受体结合域intiminγ在克隆intiminα骨干。27日,33表达不同的intimins决心通过免疫印迹分析的完整的细胞溶解产物准备ICC170衍生品使用普遍广泛多克隆intimin抗血清,与所有不同的活性intimin类型30.(图2)。溶菌产物的重组菌株,但不是从ICC170反应同样与抗血清(图2和数据未显示)。
免疫印迹分析完整的细胞溶解产物准备从肠出血大肠杆菌(肠出血性大肠杆菌)85 - 170年和ICC170衍生品使用普遍广泛多克隆intimin抗血清。30.溶菌产物从野生型(巷1)和ICC170 (pCVD438)(巷3)压力反应与intimin抗血清,但不是从ICC170(巷2)。
互动与HEp-2 ICC170重组菌株的细胞和人类肠道IVOC
在重组前ICC170菌株进行了测试在人类肠道IVOC模型,压力调解的能力/ E病灶形成HEp-2细胞研究。ICC170 (pCVD438)和ICC170 (pICC55)坚持一个FAS积极反应,产生的细胞单层膜和父母一样85 - 170株,而ICC170和ICC170 (pCVD438/01)未能诱导重组宿主细胞的细胞骨架(数据没有显示)。结果表明,ICC170表达两intiminα和intiminγ可以调解/ E病变形成人类上皮细胞培养。
在先前的研究中,我们已经表明,EPEC诱导A / E病变的能力对人类肠道IVOC取决于表面生物活性intimin的表情31日这intimin表示的类型确定不同地区的肠道取向。27确定的重要性intimin在殖民化和组织特异性肠出血性大肠杆菌的背景,我们调查了ICC170重组菌株的调解能力/ E病变粘膜表面形成,使用内窥镜和组织学正常的儿科组织。
圆顶黏膜表面覆盖个人派尔集合淋巴结内淋巴囊补丁可以很容易被扫描电镜(图3)。因此细菌粘附技术工程师可以从其他网站被歧视。我们重复实验报告4又演示了一个受限制的模式组织趋向性O157: H7菌株85 - 170仙派尔集合淋巴结的补丁。的运算单元缺失突变株ICC170没有坚持身上而粘附的intiminγ补充应变ICC170 (pICC55),与父85 - 170株,限于技术工程师(图3 b;表2)。扫描电镜结果/ E的典型病变的形成。相比之下,intiminα补充应变ICC170 (pCVD438)坚持技术工程师派尔集合淋巴结补丁以及近端和远端小肠粘膜(图3汉英分别)。但是,与E2348/69表达intiminα,4,31日粘附的ICC170 (pCVD438)(图3)和CVD206 (pCVD438)(数据未显示)十二指肠和回肠末端并不总是与A / E病变(表2)。相比之下,与之前的报道相一致,31日,32ICC170 (pCVD438/01)(图3 g),类似于ICC170本身,没有坚持肠道IVOCs(表2)。这些结果表明,intimin EPEC,对殖民统治人类的粘膜肠出血性大肠杆菌至关重要,表达intiminα在肠出血性大肠杆菌允许应变殖民扩展到包括人类小肠。
(一)内淋巴囊淋巴集结的回肠末端(箭头);酒吧= 100μm。(B) ICC170 (pICC55)坚持滤泡相关上皮(身上)和显示附加和消除(A / E)病变的形成;酒吧= 5μm。(汉英)ICC170 (pCVD438) / E病变形成淋巴集结的仙灵,十二指肠和回肠,分别;酒吧= 5μm, 1μm,分别和1μm。(F) ICC170 (pCVD438)附着力没有/ E的十二指肠损伤的形成;酒吧= 1μm。(G)缺乏粘附ICC170回肠(pCVD438/01);酒吧= 10μm。
讨论
/ E病灶形成的遗传基础是有据可查的。1,10日,12日,15然而,相对很少有人知道最初的肠出血性大肠杆菌感染的肠道阶段涉及肠道的殖民化。唯一的肠出血性大肠杆菌粘附因子已被证实能扮演一个角色在动物模型体内肠道殖民化是94 - 97 kDa intimin粘附分子。8日,9intimin在人类疾病的重要性已被证明对EPEC感染研究的志愿者运算单元突变体与野生型亲本菌株相比明显减弱34和感染人类的肠道IVOC,运算单元突变体是无法移植组织。31日intimin的重要性还支持人类疾病的存在一个高的血清intimin抗体滴定度个人感染肠出血性大肠杆菌35在母亲的初乳在巴西EPEC感染流行。36在这项研究中我们介绍了一个运算单元删除突变成肠出血性大肠杆菌菌株85 - 170(生产应变ICC170)。的运算单元突变呈现殖民任何地区的应变能力的人类肠道IVOC粘膜。这个结果增加了另一层的证据intimin肠出血性大肠杆菌感染人类的贡献。
最近,我们使用IVOC证明肠出血性大肠杆菌O157: H7显示了滤泡相关上皮明显取向(身上)的回肠派尔集合淋巴结补丁导致/ E病变,但没有明显的粘附在粘膜表面的近端或远端小肠或结肠。4这个观察与EPEC的能力有效地开拓殖民地的任何地区,结肠黏膜人类小肠粘膜和效率低下。4不同的组织特异性表现出由EPEC和肠出血性大肠杆菌对人类肠道IVOC促使我们调查的贡献intimin类型来组织取向。我们解决这个问题使用同基因的EPEC衍生品表达要么intiminα或intiminγ和IVOC人类肠道的不同地区。我们表明,当一个运算单元EPEC突变CVD20629日补充了运算单元α(应变CVD206 (pCVD348)),它有效地殖民小,但并不大,肠在类似的方式intiminα表达野生型EPEC (E2348/69)。相比之下,补充CVD206 pBE310或pICC55编码intiminγ导致菌株有针对性的仙派尔集合淋巴结补丁,类似于intiminγ表达肠出血性大肠杆菌。27在本文中,我们描述了进一步的工作,ICC170补充了pCVD438编码的EPEC intiminα。使用ICC170 (pCVD438)结合IVOC,我们报道了intimin类型的变化导致从FAE-that殖民传播,典型的父母和ICC170 (pICC55)菌株对绒毛状区域的近端和远端小肠。重要的是,尽管在大多数情况下粘附十二指肠和回肠末端与A / E病变有关,在某些情况下表面粘附的细菌被认为没有证据表明A / E病变的活检。这个观察是第一个例子,粘附在人体粘膜可以分开/ E病变的形成。这一现象的原因是有趣的,目前正在接受调查,尽管它可能仅仅是由于这一事实/ E病灶形成的动态观察到在当前的研究中被推迟的八小时时间IVOC并不足以完全允许损伤发展。这是支持的观察intiminα表达EPEC应变(CVD206 (pCVD438))也显示了类似的现象。此外,附件intimin积极的细菌没有/ E病变的形成表明intimin导致初始事件的粘合剂。虽然缺乏明确的证据支持这个论点目前,intimin有助于组织亲和性和宿主特异性,尽管/ E病变在两端点实例,表明绑定intimin宿主细胞受体在体外和体内感染发生之前intimin-Tir绑定。37
肠出血性大肠杆菌粘附仙派尔集合淋巴结补丁似乎是一个具体的事件,和一些细菌表达丰富的促进绑定到这些地区(例如,长极地菌毛沙门氏菌38并在RDEC-1 AF / R139;菌株不表达这些丰富的显示减少淋巴集结附着力和低毒性)。38岁的40事实上,最近报道的完整基因组序列O157: H7已经确定了几个fimbrial操纵子,包括与同源性长极地菌毛,41这可能因此,除了intimin,有助于淋巴集结附着力。在仙灵特化细胞,称为M (microfold)细胞(纽佐尔和他的同事进行了分析42)已经被描述为目标的细菌细胞粘附,入侵,伤害动物。43这些细胞被认为正常细胞抗原抽样,似乎和细菌病原体的进化机制来使用这条路线的殖民化和/或进入主机。顶端膜蛋白的差异表达(β-1整合蛋白44)和碳水化合物45在动物物种相比,M细胞吸收上皮细胞提供了解释选择性粘附。然而,这些差异在人体组织尚未完全建立46和他们的角色在人类传染病一般来说,和在大肠杆菌特别是O157: H7感染,值得进一步研究。更普遍的是,仙灵对绒毛上皮细胞有不同的特点,这些因素可能是影响细菌的粘附。这些包括glycocalyx的厚度的差异,47杯状细胞数量减少,增加上皮内淋巴细胞的存在,和淋巴滤泡细胞的近距离。未来工作的一个重要挑战是,以确定是否有任何这些因素影响intimin介导组织取向。
确认
我们非常感谢Drs西蒙默奇和迈克·汤姆森内窥镜技能提供内镜活检,尤其是来自淋巴集结地区。联合支持的工作是BBSRC格兰特ADP和女朋友。
引用
脚注
↵__当前地址:微生物学、莫纳什大学、墨尔本,澳大利亚