条文本
PDF
文摘
背景:虽然腺瘤癌途径在大肠癌中描述得很详细,小肠的致癌作用机制尚不清楚。
目的:本研究的目的是研究候选基因的遗传途径小肠的腺癌。
对象和方法:共21 non-familial non-ampullary腺癌的小肠进行分析。DNA提取从福尔马林固定石蜡嵌入组织使用标准技术。复制错误(r) BAT26的地位是由放大。突变集群区域(MCR)腺瘤息肉病杆菌(APC)基因的筛选使用聚合酶链反应单链构象多态性和直接测序。免疫组织化学进行福尔马林固定石蜡嵌入组织使用单克隆抗体hMLH1 hMSH2β-catenin、钙和p53。
结果:14男七女患者平均年龄为64岁(范围21 - 85)提出与十二指肠腺癌(10),空肠(7)和回肠(4)。一个癌症(5%)被发现r +,和所有肿瘤染色阳性hMLH1 hMSH2。未发现突变MCR的APC基因。β-Catenin显示增加的核表达的膜染色在10癌症(48%)。缺失或减少膜钙粘蛋白的表达在八个癌症(38%)被发现。强烈的p53染色细胞核中发现了五个癌症(24%)。
结论:我们没有检测MCR的APC基因的突变,这表明腺癌的小肠可能遵循不同的基因通路结肠直肠癌。钙粘蛋白的异常表达和β-catenin很普遍,反映了早期APC的替代品在这个途径的突变可能会发现在小肠的腺癌。
- 小肠
- 腺癌
- 复制错误
- 腺瘤息肉病杆菌
- β-catenin
- 钙粘蛋白
- p53
- FAP,家族性腺瘤息肉病
- HNPCC,遗传即结直肠癌
- APC基因,腺瘤息肉病杆菌基因
- r,复制错误
- MMR,错配修复
- MCR,突变集群区域
- PCR,聚合酶链反应
- SSCP、单链构象多态性
来自Altmetric.com的统计
小肠是罕见的癌症,只占胃肠道恶性肿瘤的1%,1这是尽管小肠包含大约90%的胃肠道粘膜表面。2结直肠癌的发病率是小肠癌的50倍,3然而,两种癌症的组织病理学特征是相似的。癌症源自腺瘤息肉4和一个癌症患者增加患其他癌症的风险。5
腺癌与良性肿瘤的肿瘤是最常见的小肠的组织学类型的癌症,但与其他主要恶性肿瘤患者可能存在,包括淋巴瘤和平滑肌肉瘤。家族性腺瘤息肉病(FAP)和克罗恩病是公认的小肠癌的风险因素,4,6尽管在十二指肠腺癌集群,6克罗恩病的风险增加主要是局部的回肠末端。其他危险因素包括Peutz-Jeghers综合症,腹腔疾病,遗传即结直肠癌(HNPCC)。7,8有人建议,小肠粘膜的快速周转,相对缺乏的细菌,并减少运输时间2,9癌症的发病率都原因小肠小于的大肠。其他建议包括小肠内的碱性pH值、小肠的液体性质的内容,和一个发达地方IgA免疫系统介导的。10
腺癌的诊断小肠经常延迟是由于患者有非特异性症状,和随后的困难,这在执行生产相关的调查。11这无疑有助于预后不良,尽管手术和辅助化疗和放疗。大约50%的低分化腺癌的小肠,和大多数渗透通过肠道壁。1
侵入性结直肠癌的组织学进展是称为“adenoma-carcinoma序列”,伴随着一系列的描述基因变化12日,13涉及到激活的癌基因和肿瘤抑制基因失活。尽管小肠的癌症的患病率较低与结直肠癌相比,两种癌症的相似性表明他们可以共享许多致癌作用的基因变化。如果两个癌症基因变化的类型或不同频率的这些变化,那么它可能会提出,小肠对遗传事件发生在结肠直肠癌。此外,如果任何潜在机制差异可以被识别,这可能在未来临床应用。
目前,已经有很少的研究(通常用小数字)癌症的分子遗传学的小肠。本研究的目的是调查以下候选基因或蛋白表达在小肠的腺癌的遗传途径:错配修复基因hMLH1 hMSH2,腺瘤息肉病杆菌(APC)的基因,β-catenin,钙和p53。
HNPCC,它的特点是微卫星不稳定性(或复制错误,r +)是由遗传突变的DNA错配修复(MMR)基因。14到目前为止,灭活突变5错配修复基因中描述:hMSH2, hMLH1, hPMS1, hPMS2, GTBP (hMSH6)。15 -22尽管小肠的腺癌是常见的25倍比正常人群HNPCC家族,23r +零星的腺癌的发病率的小肠是未知的。
负责FAP, APC基因获得删除突变在零星的结肠直肠癌的80%。12与FAP的遗传突变,突变的60%的结直肠癌集群在周边地区密码子突变集群地区1200 - 1600 (MCR)。24这导致APC蛋白的功能超出了MCR迷路。的差别这包括对这些β-catenin水平和活动,25日,2692 kDa蛋白质是重要的APC和钙粘蛋白的功能活动。APC突变的选择优势可能丧失β-catenin活动的监管(然后在细胞核中积累),这是由功能获得突变的发现与野生型的结肠直肠癌的β-catenin基因APC。27日,28钙粘蛋白编码120 kDa的跨膜糖蛋白,主要向zonula本土化和粘合连接处并且作为细胞粘附的上皮细胞的主要中介。APC直接竞争与钙粘蛋白绑定β-catenin因此失活的基因可能是一个钙粘蛋白介导粘附的间接监管。这些基因的改变可能会导致异常上皮的建筑发展,导致初始结直肠癌腺瘤的发展。29日
p53核oncosuppressor蛋白是参与维持基因组的完整性。p53基因的突变一般发生在一个广泛的人类癌症和导致p53的表达增加。的选择性影响p53突变的频率主要是细胞程序性死亡或凋亡。30.p53突变通常发生在结肠直肠癌的腺瘤癌序列,可能迟到事件。31日
材料和方法
材料
福尔马林固定石蜡嵌入式档案组织可以从共有21 non-familial non-ampullary小肠的主要腺癌(表1)(牛津约翰拉德克利夫医院;加的夫威尔士大学医院;格洛斯特郡皇家医院,格洛斯特;南安普顿总医院,南安普顿)。十二个男9女患者平均年龄为64岁(范围21 - 85)提出与十二指肠腺癌(n = 10, 48%),空肠(n = 7, 33%),和回肠(n = 4, 19%)。六个十二指肠癌症没有切除,因此只有活检材料可供研究。剩下的15个癌症,有三个阶段T4、T3 11阶段,和一个阶段T2癌症。三个五个癌症与淋巴结切除淋巴结腺癌存款。15癌症中度或高度分化的,有六个是低分化。
DNA提取
DNA提取15μm石蜡部分使用一个标准的核子DNA提取工具包(sl - 8502核子QC, Didsbury,曼彻斯特,英国)。短暂,石蜡的部分添加到二甲苯在37°C 20分钟,用酒精和水之前补液。然后蛋白酶K的解决方案是添加了55°C三个小时。氯仿萃取后,基因组DNA与乙醇沉淀。
复制错误的决心(r)的地位
为了确定这些癌症的r状态,我们放大BAT-26,单个poly (a),以前是高度敏感的和特定的微卫星不稳定,32使用荧光标记引物和类似的聚合酶链反应(PCR)先前描述的条件。PCR产品装载377棱镜音序器(ABI,沃灵顿,英国柴郡,)。基因检测结果分析用软件(版本2.0.2)。pcr和分析都是重复至少一式两份。任何肿瘤呈现使用BAT-25模棱两可的结果进一步调查。
APC基因的突变筛查
使用引物描述以前APC基因的外显子15练习,33专门从基因组DNA MCR被放大。所有反应包含大约100 ng的模板DNA总量的50μl最终反应的浓度1×PCR缓冲(10毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸液pH值8.3,50 mM氯化钾,0.1% Triton, MgCl 3毫米2核苷酸),200毫米,0.2毫米的底漆,1 U的聚合酶。放大使用协议的执行95°C五分钟,35周期为一分钟95°C, 60°C一分钟(55°C外显子15 e和15我),72°C一分钟,最后72°C 10分钟。在贫穷的放大的情况下,在引物侧面外显子15被用来执行一个嵌套PCR之前使用特定引物对感兴趣的区域。
单链构象多态性(SSCP)分析
SSCP是如前所述。24non-denaturing 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行和PCR产品视觉效果与银染色使用标准的方法。
直接测序MCR的APC基因
的核苷酸序列PCR SSCP分析产品显示异常电泳淌度测定纯化PCR产物直接测序与dRhodamine thermocycle测序反应测序工具在377棱镜音序器(ABI)。从我们的实验中获得的序列进行复制和与样品与已知的野生型基因型。
免疫组织化学
免疫组织化学进行部分从福尔马林固定石蜡嵌入式肿瘤组织使用标记链霉亲和素的方法。新鲜4μm厚部分在二甲苯脱蜡、水化分级醇。内源性过氧化物酶活性被孵化的15分钟3%过氧化氢在蒸馏水。抗原检索是通过微波在0.01 M柠檬酸缓冲,pH值6,部分与鼠单克隆抗体孵化条件下表2所示。第二个层生物素化的兔子antimouse抗体(施用;Dako、伊利、英国剑桥)申请了一个小时之后,最后一层辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(1:50 0;Dako)一小时。结合抗体被发现使用diaminobenzidine tetrahydrochloride色原体。负控制(使用磷酸缓冲盐而不是初级抗体)执行和积极的控制(包括组织已知相关抗体阳性)包含在每一个实验。
hMLH1组织化学染色和hMSH2肿瘤细胞被评估为现在或缺席。β-Catenin膜染色是得分34按照阳性肿瘤细胞的比例如下:不到10%,同质10 - 90%(与改变呈现、细胞质或核),异构10 - 90%,超过90%。钙粘蛋白膜染色是得分semiquantatively按照阳性肿瘤细胞的比例如下:0%,1 - 25%,26 - 50%,超过50%。p53免疫染色,肿瘤分semiquantatively按照阳性肿瘤细胞的比例如下:不到10%,10 - 25%,26 - 50%和50%以上。
结果
r状态
21例(5%)的癌症被发现r +。这是一个58岁的男性接受了切除中度分化的T4 Nx回肠的腺癌。
APC基因的突变筛查
尽管整个MCR的筛查,未发现突变的APC基因在这个研究。然而,我们发现两个多态性。这些沉默的变化在密码子1201 (TCG柠檬酸→Ser→Ser)和1220年(ACA→ACG,用力推→刺)。多态性在杂合子被发现和先前没有被描述。
免疫组织化学
hMLH1和hMSH2
所有癌症表达hMLH1 hMSH2蛋白在肿瘤细胞核(图1)。
所有癌症表达hMLH1 (A)和hMSH2 (B)在肿瘤细胞核。只有一个的21个小肠癌症relication错误是积极的,这可能是由于“增益函数”突变hMLH1和hMSH2,或另一个错配修复基因的突变如GTBP。
β-catenin
β-catenin染色被发现在细胞间正常小肠黏膜的边界。观察异常(减少)的表达β-catenin 17的21例(81%)肿瘤(图2)。减少膜染色是这些癌症的所有17个,增加细胞质和核染色观察14(67%)和10(48%)癌症,分别。完全失去膜染色与核染色是只有一个癌症。尽管所有癌症与核的表达β-catenin降低了膜染色,这不是统计学意义(费舍尔的确切价值,p = 0.055)。
β-Catenin染色发现沿着正常小肠黏膜细胞间的边界和四个癌症(A)。观察β-Catenin的异常表达在17个21(81%)的癌症与降低膜起动和增加核染色观察10例(48%)肿瘤(B)。
钙粘蛋白
均匀膜染色的钙粘蛋白是细胞间边界的局部正常小肠黏膜。那些显示,超过25%的膜染色的癌症肿瘤细胞被认为是钙粘蛋白阳性表达。减少膜钙粘蛋白的表达(< 25%的肿瘤细胞)被发现在八个癌症(38%)(图3)细胞表面染色的损失两种癌症。胞质染色,在缺乏膜染色的情况下,被认为是消极的,因为膜本地化上皮功能至关重要。尽管低分化癌更有可能减少了膜染色(4 6低分化癌与四15适度/分化良好的肿瘤),这不是统计学意义(费舍尔的确切价值,p = 0.1)。
均匀膜染色的钙粘蛋白被发现在细胞间的边界在正常小肠黏膜和13个癌症(A)。减少膜表达(< 25%的肿瘤细胞)被发现在八个癌症(38%)(B)。
p53
p53免疫组织化学显示强肿瘤细胞核染色。癌症被认为是p53阳性超表达如果有超过10%的肿瘤细胞的染色。超表达检测到p53蛋白的核五21例(24%)肿瘤(图4)。
野生型p53免疫组织化学检测存在水平低于阈值(a)。超表达检测到p53蛋白在细胞核的五21例(24%)肿瘤(B)。
讨论
我们已经筛选小组21 non-familial non-ampullary小肠腺癌为r状态,APC突变MCR, hMLH1组织化学染色,hMSH2β-catenin、钙和p53。
只有一个(5%)的癌症被发现r +。这不是不同的小样本大小(允许)15%的微卫星不稳定性在零星的结肠直肠癌的发病率或先前描述的零星的小肠癌发病率13%。35以前的工作报告了微卫星不稳定性在五11(45%)小肠的腺癌36但作为小肠的腺癌是常见的25倍HNPCC家族,23和一个积极的结直肠癌家族史的患者并不排除在外,选择性偏差可能会占这么高的价值。
一个r +癌症彩色正面hMLH1和hMSH2蛋白质。这可能是由于生殖系错义突变占33%的hMLH1(和更小比例的hMSH2)突变HNPCC家族中,37尽管病人没有暗示HNPCC家族病史。或者,一个“增益函数”突变可能发生不良或突变出现在GTBP等其他MMR基因之一。hMLH1启动子区域的甲基化损失hMLH1蛋白表达最近被描述为r +表型的主要原因在零星的结直肠、子宫内膜癌和胃癌症与微卫星不稳定。38 -46似乎合理因此表明小肠的真正r +零星的腺癌可能有时也有这种表观遗传改变。
我们没有发现任何MCR的APC基因的突变。这是符合Arai和同事47描述只有一个无义突变(腺嘌呤插入在1554 - 1556密码子,常见的突变FAP患者胃与十二指肠的癌症4815)在一个面板小肠的腺癌。其他人已经表明,等位损失5 q (APC基因的区域)在小肠的腺癌是罕见的,35这是在与频繁的等位基因在结肠直肠癌损失。49突变可能会发现如果我们有整个APC基因的筛选,但多达80%的零星的结肠直肠癌删除APC基因突变,12和60%的这些是在MCR。24有两个年轻患者,仅24岁和21年,这些病人可能会有一个新的APC基因的突变。作为生殖系APC突变可能发生在整个的APC基因,可能只有筛选MCR错过了这两个病人的突变。APC基因的突变中描述的其他胃肠道恶性肿瘤(胃和胰腺癌50 -52),尽管这些发现并没有多如在结肠直肠癌。APC的失活可能仍然是一个早期事件在小肠的腺癌,表观遗传变化,如启动子区域的甲基化,可能是负责任的。尽管APC启动子区域的甲基化在结直肠癌短暂学习,53这是一个致癌作用需要进一步研究的领域。缺乏合适的抗体阻止我们学习APC蛋白的表达。
β-catenin和钙粘蛋白基因是潜在的候选人(APC)的另一种选择可能导致错乱的细胞结构的早期通路肠癌致癌作用。5410(48%)的癌症研究中降低了膜的表达β-catenin随之而来的核染色。尽管β-catenin存在于少量在正常结肠上皮细胞的细胞核,这是通过免疫组织化学方法检测水平以下。10癌症β-catenin积累的增加反映了预防β-catenin退化和与突变的存在有关APC蛋白在大肠癌发生时。55在缺乏APC突变检测在这项研究中,有可能增加核本地化可能是由于β-catenin功能获得突变以前已报告在结肠直肠癌的25%。27日,28描述了β-catenin突变与野生型结肠直肠癌APC和结肠直肠癌APC基因突变。在后一种癌症,β-catenin突变必须增强APC突变的影响破坏的控制β-catenin信号通路,54否则没有突变的选择依据。
八个癌症(38%)在本系列中降低了(< 25%的肿瘤细胞)膜钙粘蛋白的表达,这非常类似于结肠直肠癌的发病率报道。56在结肠直肠癌和其他癌症,这可能是由于突变或钙粘蛋白基因启动子的甲基化。57 -60虽然有一个协会的低分化癌与降低膜染色(与结肠直肠癌),这不是统计学意义。
超表达检测到p53蛋白在细胞核五21例(24%)的癌症。时候等检测到p53超表达在八15(53.3%)小肠的腺癌,47而在这些癌症的四个错义突变检测。与结肠直肠癌的先前的研究结果,结果表明p53突变腺癌的小肠中扮演一个重要的角色。
其他基因k - ras基因以前在小肠的腺癌包括学习,类似的点突变的发生率已经报道发现在结肠直肠癌。2,47岁的61年然而,尤尼斯等k - ras基因突变在十二指肠腺癌(四12癌症),但没有发现任何突变腺癌的空肠和回肠(16癌症)。62年
总之,只有我们的一个21例(5%)小肠的腺癌是r +。我们没有检测MCR的APC基因的突变,这表明,小肠的腺癌可能遵循不同的结直肠癌遗传途径,虽然仍然经常涉及改变与β-catenin和钙粘蛋白。这是第一个研究检验β-catenin的作用和钙粘蛋白腺癌小肠。异常表达很普遍,可能反映了早期通路的突变可能会发现在小肠的腺癌。p53是一个相对频繁的查找和过度表达,在结肠直肠癌,反映了其重要作用小肠的致癌作用。这些结果进一步洞察腺癌的遗传通路的小肠和结肠直肠癌展示有趣的区别对APC突变,这也可能反映在其他癌症。