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背景和目的:肝脏代表人类glucuronidation的主要网站之一。许多治疗药物基质UDP-glucuronosyltransferases (UGT)通常不活跃的葡糖苷酸的形成。肝glucuronidation经历重大变化在胎儿和新生儿发展要求年龄调整药物治疗。监管的个人UGT基因在肝脏发育尚未定义。
对象和方法:13的表情UGT基因和glucuronidation活动分析了16个儿科肝脏样本(7-24岁个月),两个胎儿样本,和12个成人肝脏样本(25 - 75岁)使用双逆转录-聚合酶链反应,免疫印迹,特定的催化UGT活性测定。
结果:未发现UGT成绩单,在胎儿肝脏在妊娠20周。相反,UGT1A1, UGT1A3、UGT1A4 UGT1A6, UGT1A9, UGT2B4, UGT2B7, UGT2B10, UGT2B15成绩单在场没有变化所有28个肝样品经过6个月的年龄。显著降低UGT1A9和UGT2B4 mRNA的表达被确认在儿科肝脏。岁儿童肝glucuronidation活动24里面几个月被发现为布洛芬(采样)低于成年人,阿米替林(16倍),4 -叔-butylphenol(40倍),雌激素酮(15倍)和丁丙诺啡(12)。
结论:早期阶段的特点是外观的UGT基因转录和后面的阶段的特点是upregulation UGT表达式,证明了在人类肝发展。微分调节UGT1A9和UGT2B4表达超出两年的年龄和能够影响儿童肝glucuronidation常见的治疗药物。肝UGT活动的发展意义重大,对儿科药物治疗和预防药物不良影响。
- UGT1A
- UGT2B
- 个体发育
- 药物代谢
- 药物毒性
- 肝
- UGT, UDP-glucuronosyltransferase
- DRT-PCR,双逆转录-聚合酶链反应
来自Altmetric.com的统计
肝脏是人体新陈代谢的主要网站之一glucuronidation。UDP-glucuronosyltransferases (UGT)催化生化反应将疏水性膳食成分设计,环境污染物和治疗药物为亲水性β-D-glucopyranosiduronic酸(葡糖苷酸),通常是生物活性,可以促进肾发生胆道消除。1glucuronidation目标底物的范围是相当大的,跨越不同的化学类、胺类、酚类、羧酸、阿片类药物、类固醇。2Glucuronidation数以百计的药物和其他化合物一直在评估导致意识到,Glucuronidation代表人类的主要解毒途径之一。
到目前为止,15个人ugt已确定。2基于序列同源性分为两个家庭:UGT1 UGT2。3在人类肝脏,5UGT1A基因(UGT1A1、UGT1A3 UGT1A4、UGT1A6 UGT1A9)4 -6和五个UGT2B基因(UGT2B4、UGT2B7 UGT2B10、UGT2B11 UGT2B15)2,7 -9表达和定义肝glucuronidation能力。剩下的五个UGT基因表达在肝外网站。2,10日,11这些基因的表达和功能的产品影响药物代谢的治疗管理的目的。
肝glucuronidation研究主要使用成人肝脏样本。10日,12 -17然而,相当大的差异,肝glucuronidation发生在开发过程中从胎儿到成人肝脏。许多发育研究表明glucuronidation活动对胆红素和其他化合物在胎儿肝脏和达到成人水平低新生儿生命的前六个月之内。18岁22基于免疫印迹分析,预测胎儿肝脏的ugt数量是低。23然而,数据的表达个人的发展UGT1A和UGT2B基因在生命的前24个月并不可用。的例子氯霉素等抗生素制剂的毒性代谢通过接合表明同种型的详细知识具体发展UGT表达式在成年之前是必需的,而且会影响儿童医学药物治疗。24日,25
在这项研究中,我们分析了表达式的13UGT基因在胎儿肝脏和肝glucuronidation活动,儿童肝6到24个月的年龄,以及成人肝脏。证据是提供的外观UGT表达式后,胎儿期和微分upregulation个人UGT基因表达在六个月后,未完成的24个月大的时候。
材料和方法
病人
肝组织获得了来自16个儿科患者接受肝移植对肝外胆道闭锁,年龄在6日到24日个月。这些患者的血清学证据病毒性肝炎(表1),成人肝组织获得12例(25 - 75岁)接受hemihepatectomy或为肝细胞癌肝移植。没有成人患者慢性或急性病毒性肝炎时取样。遗传肝病(haemochromatosis,威尔逊氏病,α1抗胰蛋白酶缺乏症)以及自身免疫性肝病(自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎)被排除在外,seroimmunological和生化测试。26所有样本组织学上自由的肿瘤,立即在液态氮冷冻后手术切除标本,并存储在−80°C到分析。所有样品都是免费的组织学坏死的证据。组织采购协议是汉诺威医学院伦理委员会的批准。
人胎肝RNA的两个样品(男,20周的妊娠;女性,怀孕20周)从Strategene购买(美国加州LaJolla)。
隔离和纯度的组织RNA,互补脱氧核糖核酸的合成,微粒体蛋白
组织RNA
立即组织被摧毁在液氮和细胞溶解在酸性苯酚/ guanidinium-isothiocyanate解决方案(Tripure,勃林格曼海姆,德国)RNA隔离,如前所述。5
互补脱氧核糖核酸的合成
互补的DNA合成详细如前所述。5与基因组DNA污染是排除通过逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),使用引物对人类β-actin跨外显子4 /β-actin基因的内含子/外显子5结。PCR与cDNA导致产品202个基点,但污染与基因组DNA模板将导致312个基点PCR产物。5
隔离的微粒体蛋白
大约200毫克的组织被摧毁在液态氮,resuspended 1毫升的50 mM Tris-HCl (pH值7.4),MgCl 10毫米2,单一化Potter-Elvehjam组织磨床,加工如前所述。4存储在−80°C。
UGT酶活性测定,使用重组UGT蛋白和组织微粒体蛋白
人类肝微粒体的催化活性测定
18基板用于描述肝微粒体UGT活动在甲醇水溶性。基板都是购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国),如图4所示。催化活动25μg成人或儿童肝蛋白质在重复化验,如前所述。9日,11延迟的UGT活动微粒体蛋白控制使用皮套裤0.25 - -2%和0.25 - -1%在30分钟的孵化反应alamethicin 37°C之前UGT活动分析(数据没有显示)。60分钟后UGT测定反应蛋白质沉淀下来了,上层清液的lyophilised,之前和resuspended甲醇通过薄层液相色谱分离n丁醇/丙酮/酸/水(35:35:10:20%)。的生产14C-labelled葡糖苷酸检测到放射自显影法。确定具体的催化活动,14C-labelled葡糖苷酸是量化使用富士胶片bas - 1000 phosphoimager (Raytest GmbH, Straubenhardt,德国)和蒂娜2.0软件(Raytest GmbH, Straubenhardt,德国)和表达为pmol葡糖苷酸形成/分钟/毫克的微粒体或重组蛋白。控制,放射自显影法很难复制另外分析了gs - 710校准成像密度计使用数量一个软件包(美国加州BioRad实验室、大力神)。
双UGT1A逆转录-聚合酶链反应和UGT2B记录
UGT1A和UGT2B成绩单在肝组织总RNA PCR扩增分析执行作为一个双rt - PCR (DRT-PCR) coamplificationβ-actin cDNA控制,如下面。
UGT1A DRT-PCR
的UGT1A轨迹预测9蛋白质称为UGT1A1 UGT1A3-1A10的存在。UGT1A2、UGT1A11 UGT1A12缺乏一个不间断开放阅读框,因此被视为伪基因。DRT-PCR检测所有九个UGT1A成绩单预测的人类UGT1A轨迹进行使用9个外显子1特定的引物和两个反义引物位于外显子2 - 5或3 '末端的共同部分内的第一个外显子。已经报道,在其他地方,外显子特定引物导致生成不同分子大小的rt - pcr产品:UGT1A1, 644个基点;UGT1A3, 483个基点;UGT1A4, 572个基点;UGT1A5, 659个基点;UGT1A6, 562个基点;UGT1A7, 754个基点;UGT1A8, 514个基点;UGT1A9, 392个基点;和UGT1A10, 478个基点。 Coamplification of UGT1A first exon and β-actin sequences was performed using three cycling protocols: UGT1A1 and UGT1A6, 94°C (one minute), 59°C (one minute), 72°C (one minute); UGT1A3, UGT1A4, UGT1A5, 94°C (one minute), 56°C (one minute), 72°C (one minute); and UGT1A7, UGT1A8, UGT1A9, UGT1A10, 94°C (one minute), 64°C (one minute), 72°C (one minute). Each protocol was preceded by a three minute incubation of the reaction mixture at 94°C and followed by a seven minute elongation at 72°C. The specificity and kinetics of this assay have previously been documented in detail.5实验是在重复执行和控制没有cDNA、引物,或高温聚合酶包括在内。
UGT2B DRT-PCR
特定的引物对生成的放大UGT2B4, UGT2B7, UGT2B10, UGT2B15序列,分别最近报道的地方。9交叉反应性是排除使用序列比对和PCGene(美国加州牛津分子,坎贝尔)软件,以及一个计算机化的数据库搜索使用Blastn软件(基因库)。UGT2B cDNA coamplified与92年开始卷β-actin cDNAμl包含10毫米氯化钾,20毫米Tris-HCl (pH值8.8),10毫米硫酸铵,2毫米硫酸镁,特里同x - 100 1%,每个核苷酸0.2毫米,2μM UGT2B底漆和通风(外)DNA聚合酶(美国马萨诸塞州内,贝弗利)。热后从94°C三分钟,6个周期94°C的30秒,30秒57°C, 72°C 30秒都运行在珀金埃尔默GeneAmp PCR 2400系统。同一β-actin引物用于UGT1A DRT-PCR被添加到0.4μM和骑自行车是恢复总共32周期。特异性的检测由PCR决定使用所有四个引物对每个克隆UGT2B4 UGT2B7 UGT2B10, UGT2B15模板cDNA排除交叉反应性。PCR产品产生的预期的大小:UGT2B4, 281个基点;UGT2B7, 407个基点;UGT2B10, 388个基点;UGT2B15, 330个基点。确认检测特定UGT1A和UGT2B互补使用这种分析,PCR产品部分测序产品文档特定基因的身份。
量化的UGT转录水平进行相对的表达在同一DRT-PCRβ-actin放大反应如前所详细概述。5产品量化使用gs - 710校准成像密度计和数量一个软件包(美国加州BioRad实验室、大力神)。转录水平是相对任意单位计算公式:(平均峰面积与UGT /平均峰面积β-actin)×100。5统计分析与学生的表现t检验和方差分析(GraphPad GraphPad棱镜,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。
免疫印迹分析
从肝微粒体蛋白(20μg)组织样本为90秒加载缓冲煮(2%钠十二烷基硫酸盐,62.5更易与l Tris-HCl (pH值6.8),10%的甘油,和0.001%溴酚蓝)和β-mercaptoethanol解决10%钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳前electrotransfer硝化纤维膜上。总量的控制,5μg示例Spodoptera frugiperdaUGT1A1和UGT2B7 (Sf9)细胞溶解产物表达重组蛋白以及Sf9细胞表达重组UGT蛋白没有被包括在内。Immunodetection出版协议后执行。27UGT1A1、UGT1A6 UGT2B7蛋白质检测使用一个单一的UGT1A1和兔兔反人类的反人类的UGT2B7抗体购自NatuTec /绅士(德国法兰克福)1:1500的稀释。
结果
微分表达式UGT1A UGT2B成绩单的胎儿,孩子,成人肝脏
13个人的表达UGT在胎儿基因被具体分析DRT-PCR,孩子,和成人肝脏(图1)。在胎儿肝脏,没有测试UGT1A或UGT2B记录被检测到。这个结果是在协议与先前的研究结果证明在胎儿肝脏的UGT蛋白质减少。23因此证明表达的数据UGT1A1,UGT1A3,UGT1A4,UGT1A6,UGT1A9,UGT2B4,UGT2B7,UGT2B10,UGT2B15基因在人类肝脏不是监管在妊娠20周。与儿童和成人肝脏样本进行比较表明九13的表达UGT基因在所有的文章中检测到胎儿样本。的表达UGT1A和UGT2B基因代表典型的人类肝脏的曲目因此怀孕20周后出现,在产后六个月。
表达13 UGT1A UGT2B记录特定双逆转录-聚合酶链反应检测到外显子。溴化乙锭染色的凝胶显示代表胎儿肝脏的例子(20周的妊娠,男),孩子在九个月(男性),肝脏和成人肝脏的一个例子(45年,男)。新创的监管四UGT2B UGT1A基因位点和基因之间明显的胎儿和儿童肝脏样本。儿童和成人之间的微分upregulation肝脏UGT成绩单是可见的。
孩子和成人肝rna的定量差异分析UGT表达式(图2)。六个月后的年龄差异转录水平没有发现UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT2B7, UGT2B10或UGT2B15信使rna。然而,UGT1A9 mRNA的表达显著增加在一个依赖时代时尚与转录水平较低年龄组十三至十八6 - 12个月个月(p < 0.001)。UGT2B4信使rna也表示在一个依赖时代时尚水平较低6到24个月和转录水平明显高于成年人(p < 0.001)。这些发现表明一个依赖微分upregulation人类时代UGT1A9和UGT2B4基因在肝glucuronidation的发展。新创的证据UGT基因表达没有检测到超出6个月的年龄。
UGT1A9 UGT2B4 mRNA的差别显著差异对这些孩子的肝脏。图形表示的mRNA水平的量化分析双逆转录-聚合酶链反应和计算相对于β-actin的存在。5统计分析显示重要的微分调节UGT1A9和UGT2B4 mRNA 6 - 18个月的儿童时代。这个发现表明UGT同种型表达式,在人类肝脏的独立发展。* * * p < 0.001。
免疫印迹分析UGT1A1、UGT1A6 UGT2B7蛋白质
我们的表达分析表明,没有个人UGT转录表达的差异,只有表达水平差异成人和儿科人口样本。由于最近的可用性的单一的抗血清UGT1A1,针对UGT1A6 UGT2B7,具体个人UGT蛋白质的检测已经成为可能。与我们的研究结果在mRNA和蛋白表达水平,UGT1A1, UGT1A6, UGT2B7蛋白质被免疫印迹检测(图3)。从mRNA分析预测DRT-PCR(无花果1,2)没有观察到蛋白质表达水平的差异对于UGT1A1, UGT1A6或UGT2B7使用7个样品的儿童和成人肝脏。在图3中所示的免疫印迹,利用anti-UGT1A6特定的血清,呈现两个非特定的乐队高于55 kDa乐队也存在使用Sf9细胞提取物不表达UGT蛋白质。这些乐队的性质还不清楚,但他们似乎是独立于特定的乐队发现55 kDa。
表达UGT1A1、UGT1A6 UGT2B7蛋白在肝发展。免疫印迹分析演示的具体检测UGT1A1, UGT1A6, UGT2B7蛋白质在七个孩子和成人肝脏样本。演示了在双UGT1A1逆转录-聚合酶链反应分析,UGT1A6,和UGT2B7转录表达(与图2),未发现显著差异蛋白质含量,确认记录分析。所有样本被发现表达immunodetectable UGT蛋白质表明高质量的样品。Neg控制(Sf9),Spodoptera frugiperda细胞不表达UGT蛋白质用于负控制实验;Pos控制、积极控制使用相应的重组UGT的抗体。
微分催化glucuronidation活动在儿童和成人肝微粒体
肝组织肝glucuronidation活动分析微粒体使用18基板包括酚类、香豆素类、黄酮类、以及一些治疗药物如抗抑郁药amitryptyline,去郁敏,镇痛药布洛芬,免疫抑制剂环孢菌素,阿片类丁丙诺啡,以及类固醇激素,如雌激素酮2-hydroxyestrone, 4-hydroxyestrone。这些基质选择因为他们代表通常管理化合物或典型的化学结构中发现医疗治疗。因此选择包括阿片类药物、止痛药,香豆素类、酚类、黄酮。测试基板的数量是有限的可用数量的微粒体蛋白,允许一个完整的分析样本。儿科和成人肝脏肝glucuronidation活动之间的差异相当大,范围从三倍40倍(图4)。在24里面几个月,UGT活动,布洛芬,阿米替林,4 -叔-butylphenol、雌激素酮和丁丙诺啡是24日,16日,40岁,低于15日和十二次成人肝脏。UGT活性分析表明,glucuronidation类固醇激素、抗抑郁药、镇痛药、阿片类药物、黄酮、香豆素类没有在24个月的年龄达到成人的水平。
催化活性差异成人和儿童肝脏。18基板检测分析的图形表示glucuronidation使用儿童和成人肝脏。2-OH-biphenyl 2-hydroxybiphenyl;4-OH-coumarin 4-hydroxycoumarin;2-OH-estrone 2-hydroxyestrone;4-OH-estrone 4-hydroxyestrone。
讨论
人类的药物的一个重要过程,异型生物质分解代谢与葡萄糖醛酸结合催化了UGT总科的成员的蛋白质。除了几个例子包括morphine-6-glucuronide止痛剂的特性,28葡糖苷酸活性的水溶性轭合物致力于消除通过胆汁或尿液从身体。1,2微粒体蛋白不同组织来源的分析表明相当glucuronidation活动是在肝脏局部。10日,12日,29 -31日一些最常见的药物在医学管理针对glucuronidation。这些包括扑热息痛(对乙酰氨基酚),24布洛芬,10日,32吗啡,28阿米替林,10日,32环孢菌素和他克莫司,33以及许多类固醇激素合成endobiotic基质和服用激素治疗。6,7,10日,11日,34的表达UGT基因在人类因此药物疗效的一个重要因素,对药品不良反应的发生产生影响。24日,35领域的最新进展glucuronidation导致15人的克隆UGT亚型和目前正在进行的催化特性描述。2此外,方法开发了专门检测个体,高度同源UGT记录在目标组织。5,6,11虽然在人类个体发展的差异glucuronidation前所述,18岁21分析个人的贡献UGT1A和UGT2B基因是不可用的。24这是需要阐明个人的角色与ugt的glucuronidation肝脏在人类发展的能力。
在这项研究中,我们分析了肝组织6日到24日个月岁儿童相比,胎儿肝脏和成人肝脏。缺席的情况下UGT1A和UGT2B在胎儿肝脏基因表达在20周的妊娠和UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT1A9, UGT2B4, UGT2B7, UGT2B10,成人和儿童肝脏和UGT2B15样本表明,新创的表达UGT基因不发生后6个月的年龄。这是在协议与早期结果表明人类glucuronidation发展20周的产后。18UGT成绩单,然而,分析定量DRT-PCR展示了小说发现UGT1A9 UGT2B4经受年龄依赖量化微分调节延长24个月大的时候(图2)。所有其他的肝UGT并未表现出显著差异研究的年龄群体。个人间变化UGT表达式在样品组低。这一发现可能是由于缺乏药物使用酶诱导的差异和潜在组织抽样之前,事实上,病人手术前禁食至少18个小时。低水平的个人间UGT表达可变性已经被记载在其他研究分析肝和其他胃肠组织。4,10日,36
有趣的是,没有信使核糖核酸或蛋白质含量的差异胆红素接合UGT1A1(无花果2、3),同种型表达在相似的水平6到24个月和成年人。这是在协议与早熟的新生儿胆红素glucuronidation。21免疫印迹分析证实,UGT1A1、UGT1A6 UGT2B7,表现出没有年龄依赖在转录水平的变化也显示没有差异蛋白质水平(图3)。然而,分析肝glucuronidation活动表示6日到24日个月岁成人和儿童之间的巨大差异。Glucuronidation差异特别明显的酚类化合物,以4 - 40倍的差异叔-butylphenol glucuronidation成人和儿童之间的年龄在19到24个月(图4)。图4中的基板测试,表示被选中是因为他们代表主要的医学相关类基质和药物,阿片类药物,非甾体类镇痛药,香豆素类,酚类化合物和黄酮。UGT蛋白表达在人类肝脏,UGT1A9,表达随年龄的增加在这项研究中,可以表现出最高的特定活动时苯酚催化分析比较使用重组UGT蛋白质。2UGT1A9 glucuronidate苯酚已被证明,37蒽醌类、黄酮类、香豆素类、38岁的39胺,9日,40代表glucuronidation活动确定化合物的相当大的差异分析。因此这些数据表明个人的年龄相关的微分表达式UGT成绩单在人类发展可能会影响肝药物glucuronidation水平。这可能包括未知的肝UGT,可以导致微分UGT的活动。扩大对这些发现的临床意义分析包括许多化合物和化学类一般管理药物治疗或摄取作为我们的饮食的一部分。这种分析包括服用柚苷配基在橘子,香兰素,香豆素衍生物4-methylumbelliferone,胺药物amitryptyline去郁敏,免疫抑制剂环孢菌素,镇痛药布洛芬,阿片类丁丙诺啡,类固醇激素。所有这些在3至16倍glucuronidated低水平的儿童肝脏样本。因此我们的研究结果表明,肝glucuronidation在孩子两岁的成年人中没有成熟水平。虽然大多数UGT已经在mRNA和蛋白表达水平的那些成年人,我们的分析基于识别个人UGT微分调节的基因表达提供了新颖的证据个人UGT亚型在人类发展与显著降低肝glucuronidation活动。
到目前为止,所知甚少的监管活动潜在的表达UGT人类的基因。实验数据表明,mRNA的表达水平与细胞UGT蛋白质含量、微粒体UGT活动的调制。11日,36然而,实验也表明,UGT活动可以显著改变膜的因素,包括磷脂含量,41长链脂肪酸和酰基辅酶A。42岁的43这些因素也可能因此造成变更的UGT活动期间肝发展和可以解释观察到的只有细微的差别在成人和儿童肝脏样本之间的蛋白质水平(图3)。个人监管的能力在人类基因产品的编码UGT1A轨迹和UGT2B基因,在这项研究中,已被证实在多个例子。5,10日,11日,36
健康小儿肝脏标本的采购是一项艰巨的任务。在这项研究中,我们分析了组织从儿科患者肝外胆道闭锁,这可能施加影响的结果。虽然这绝对不能排除的,大量的观察导致这些组织我们进行分析:首先,UGT1A表达的模式在所有的儿科组织样本reflected-without变体a典型肝概要文件中发现的所有肝脏样本分析。4 -6,10其次,所有亚型的转录水平除了UGT1A9和UGT2B4成人和儿科组相似,表现出类似个人间波动(图2)。此外,表达UGT1A9记录被发现增加的过程中时间不会预期如果进步肝脏疾病影响UGT表达式。第三,UGT1A1水平、UGT1A6 UGT2B7蛋白表达儿科和成人组之间没有差别,表明微粒体蛋白表达是完整的两组(图3)。第四,实验证据表明不显著改变glucuronidation肝硬化的存在。44 -46类似的考虑也适用于成人组织。这是显微镜下正常但来源于肿瘤(肝癌)患者。然而,类似的样品分析之前,为了描述正常的人类肝脏出版。4,10日,36根据这些考虑,我们认为,提出研究结果确定差异UGT监管和活动发生在人类肝发展的进程。
总之,我们表明,肝的表达UGT1A和UGT2B基因的特点是第一阶段的新创的表情经过20周的妊娠中胎儿肝脏,其次是第二阶段的微分upregulation个人亚型扩展超出了两岁。肝glucuronidation在人类尚未达到成人水平两年类固醇激素,酚类药物,或阿片类药物。这些因素可能会影响儿科药物治疗和有助于识别和预防药物不良影响。
确认
这项工作是由德意志Forschungsgemeinschaft格兰特Str493/3-3 (CPS)。