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作品简介:巴雷特食管上皮细胞(是)是临床上重要的由于相关的炎症和恶性并发症不均匀分布在整个环节。随着免疫调节环境可能影响疾病表现,我们分析了在整个被粘膜炎症和细胞因子反应。然后,我们调查是否炎症梯度组织转化的细胞亚型的分布有关,上皮细胞接触refluxate的组件,或squamocolumnar细胞相互作用。
方法:连续50例长段是患者招募。内窥镜的节段性程度和组织病理学炎症分级,并表达白介素(IL) 1β,引发,IL - 4和IL - 10 ELISA测定后器官培养有或没有添加酸或胆汁盐。粘蛋白染色和il - 10进行了免疫组织化学。squamocolumnar相互作用在细胞因子表达的影响进行了分析使用cocultures鳞状(OE-21)和(TE7)癌细胞系。
结果:有一个组织病理学炎症梯度。炎症是最大的新squamocolumnar结≥2倍增加促炎引发和IL-1β表达式。近端促炎反应不能被解释为化生的亚型的分布。跳动的暴露是酸和胆汁,并列的是鳞状上皮细胞在文化、增加IL-1β的表达式。相比之下,炎症是最小的远侧地显著增加抗炎il - 10表达和4/6的癌症发生远侧地。
结论:特定细胞因子反应可能导致炎症和恶性并发症的本地化。
- 巴雷特食管
- 炎症
- 细胞因子
- gastro-oesophageal回流
- 美,gastro-oesophageal结
- GORD gastro-oesophageal返流性疾病
- ,巴雷特食管上皮细胞
- PPI,质子泵抑制剂
- TLSOR,瞬态下食管括约肌松弛
- ,白介素
- rt - pcr、逆转录-聚合酶链反应
来自Altmetric.com的统计
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巴雷特食管上皮细胞(是)很重要,因为潜在的溃疡、狭窄和癌症的发生。1,2并发症发生在相对少见,但他们可能会导致大量病人的发病率和死亡率。3 -5有趣的是,并发症并非均匀分布在整个柱状排列。例如,巴雷特的相关限制通常mid-oesophageal与远端消化性狭窄相比,6和食管腺癌位于远侧地。7,8在我们自己的回顾性系列中,癌症是位于远端部分是段长度(平均6.5±0.41厘米)在18/21(86%)的患者(未发表的数据)。此外,肿瘤的gastro-oesophageal结(美)食管腺癌的两倍(> 2厘米从美)。9日,10有人建议,偏爱癌症发生在远端巴雷特的部分可以解释为什么段长度和癌之间的关系并不像预期的那样强大。11日,12
炎症和肿瘤并发症的aetiopathogenesis是知之甚少。一个因素可能是上皮细胞暴露于特定组件的程度和模式的胃与十二指肠的refluxate。13 -15接触refluxate的模式不统一沿着食道粘膜曝光时间取决于因素如refluxate的体积和长度的瞬态下食管括约肌的松弛(TLOSR)。因此它已经证明了双重pH研究暴露在回流中少近端与远端食管。16
的高重复曝光远端食管refluxate可能重要的关于致癌作用。17日,18例如,有证据表明,间歇性暴露的是酸和胆汁盐,正如发生在多个TLOSRs,可能导致hyperproliferative上皮细胞反应。19 -21虽然还没有证明,这些发现表明,完整的酸(胆汁)使用高剂量抑制质子泵抑制剂(ppi)可能是重要的,以减少在这些病人发展为癌症。22
细胞因子在细胞水平上,特定的环境可能是重要的在并发症的发病机理。23日,24 -26此外,我们最近证明了细胞因子的环境是不同的与食管炎和uninflamed相比正常食管鳞状上皮。27日,28在炎症的概要文件的特点是相对增加th2型细胞因子白介素4 (IL)和IL - 10,而食管炎的促炎的性质。这些研究进行使用活检是线段的中点。然而,考虑到倾向于狭窄发生向近端和异质性的细胞和分子水平,29 -31日我们假设可能区域细胞因子表达的变化。
因此,本研究旨在测试假设proximal-distal炎症反应的变化可能与炎症的分布和恶性并发症。首先,我们比较了程度的炎症和细胞因子的产生的近端与远端部分。其次,我们有检查是否proximal-distal炎症概要文件之间的差异可以解释为主要的化生的亚型,refluxate暴露的程度,或者细胞鳞状上皮和柱状细胞之间的相互作用在新squamocolumnar结。
方法
病人和组织收集
50个患者内镜和组织病理学诊断是(≥3厘米,包含肠上皮化生与杯状细胞)是从校区医院和圣招募英国巴兹和伦敦NHS信托。这项研究是研究伦理委员会批准的吠叫和校区,东伦敦和城市卫生当局。连续招募患者参加了内窥镜检查,包括新诊断的患者以及那些接受癌症监测。当前反流症状的严重程度和任何酸抑制剂药物被记录了下来。使用内窥镜的程度可见食管炎症分级根据修订Savary-Miller分类等级0-IV。32岁的33十二指肠活检作为控制肠道上皮细胞。Quadrantic活检被巴雷特的部分开始2厘米以上任何相关的美,以确保间隙食管裂孔疝(这些活检被称为“远”)。然后进一步活检被每2厘米的段。34活检称为“近”是那些最接近新squamocolumnar结(1 - 2厘米以下Z线根据段长度和不规则的结)。此外,从扁平粘膜活检被2厘米以上新squamocolumnar结。
微观炎症分级
福尔马林固定石蜡包埋苏木精和伊红染色组织分析了由一个顾问histopathologist(它的)不知道内窥镜程度的炎症。被诊断为食管炎使用Ismail-Beigi的标准以及存在的炎症细胞浸润。更新后的悉尼系统(开发用于胃炎)是用来正式评估组织病理学炎症程度在腺体。35炎症是使用视觉模拟量表评分考虑淋巴细胞,中性粒细胞,嗜酸性和渗透(0,轻度1,中度2,标志着3);这种规模已被证明有良好的interobserver协议。36岁,37
应用类型的化生
阿尔新蓝染色是用来确定肠道和胃化生的比例(70幻灯片从35病人)。污渍下面使用为了确定主要亚型的肠上皮化生的每一层段(120幻灯片从20患者长段(> 5厘米)。
阿尔新蓝pH值2.5 /周期性acid-Schiff (AB pH值2.5 / PAS)。38
高碘酸盐borohydride-PAS (PB / KOH / PAS)的反应。40
胃和肠上皮细胞的平均比例的近端和远端部分量化单位面积上的杯状细胞的数量的援助格(至少三个低功率字段至少三个部分每活组织检查)。此外,主要的肠道亚型比较每一层的部分。
免疫组织化学
il - 10(1:30单克隆抗体)免疫组织化学(欧洲有限公司研发系统,阿宾顿,英国)患者进行连续20 non-dysplastic巴雷特食管和所有六个优质发育不良/癌患者根据标准协议。28
机关文化和ELISA
机关文化进行了连续20是病人在氧气丰富的环境,如前所述。41文化199年媒介进行补充热灭活胎牛血清,10% 1μg /毫升的胰岛素,链霉素(500 U /毫升)和青霉素(250 U /毫升)和组织可行性确认后24小时的文化。19日,42组织暴露在酸(0.1 M盐酸)或胆汁酸(钠glycocholate和牛磺胆酸盐、glycocholic酸和脱氧胆酸盐(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)总最终浓度1毫米;pH值7.4),连续或脉冲作为一个小时。19日,21上层清液中细胞因子含量测定为引发ELISA检测,il - 10(研发抗体),IL-1β,和il - 4(研发、Duo-ELISA工具包),根据制造商的指示。细胞因子浓度表示为每活组织检查重量已被证明与组织蛋白质含量相关。43
细胞培养
TE7细胞20.44和OE-21 (subcloned从食管鳞状细胞癌,博士的礼物Janusz养家糊口,伯明翰大学,英国)培养在rpmi - 1640中补充10%胎牛血清,100 U /毫升青霉素,链霉素100μg /毫升,1毫米谷氨酰胺在25厘米3组织培养的菜肴。cocultures OE-21和TE7细胞被播种密度相等到培养皿上由双重验证标签为细胞角蛋白(CK TE7 13, CK19 OE-21)。细胞因子的分析仅限于IL-1β和引发这些上皮细胞表达的。27
竞争性rt - pcr对细胞因子
mRNA的表达IL-1β和引发细胞系被竞争力量化逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),使用标准质粒编码的RNA分子pHCQ1 (M Kagnoff博士的礼物拉霍亚,加利福尼亚,美国),如前所述。34所有了rt - pcr试剂购自生命技术(英国佩斯利)。溴化乙锭染色的乐队是量化使用柯达电泳文档和分析系统120 (eda)软件(伊士曼柯达公司,罗切斯特,纽约,美国)。45
统计分析
数据表示为(SEM)。的χ2测试是用来比较的临床变量对炎症的影响成绩。学生的搭配t测试是用来识别差异化生的亚型在远端与近端部分。方差分析(方差分析)是用于所有其他多个比较,和克鲁斯卡尔沃利斯测试(在炎症评分0 - 3)或Mann-Whitney测试(细胞因子表达)是用于识别特定的差异。所需意义p < 0.05。
结果
病人群的特征
男女比例是4:1,平均年龄是64岁(范围34 - 78),平均四岁女性患者,如预期。46段的平均长度为6.5(0.03)厘米(中位数6.0;3日- 15日)。二十八50(60%)患者接受PPI是有效缓解症状(p < 0.005)。
反流症状的存在(21/50(42%)至少每周心痛)与内镜(p < 0.05),而不是光显微镜,等级的炎症,类似于其他研究。47有最小的内窥镜内炎症或以上巴雷特段的证据在70%的患者(29/50级0和1级6/50)(表1),4级患者炎症包括三个溃疡(恶性)和一个恶性狭窄。没有关系的程度内窥镜炎症和巴雷特的线段的长度(p > 0.5)或病人的酸抑制剂药物(p > 0.5)(表1)。
有8/50的患者低品位发育不良和六个优质发育不良或腺癌患者(表2),癌起源于这些患者的远端段4/6(表2)。
组织病理学和细胞因子的证据炎症梯度
组织病理学的炎症程度有显著的变化在整个段(图1):100%的患者有某种程度的炎症在近端和60%的患者有食管炎高于巴雷特的部分。相比之下,66%的患者有最小的组织病理学证据的炎症巴雷特远端部分(12例0级,22名患者1级;p = 0.01)(图1)。组织病理学炎症程度不相关使用质子泵抑制剂(p=0.06近端,p = 0.18远端)(图1)。此外,有炎症的梯度当多个片段进行分析在长段的巴雷特食管(≥8厘米;p = 0.007)(图1 b)。
(A)程度的光微炎症(使用视觉模拟量表评分0 - 3)在近端与远端巴雷特食管上皮细胞(是)段(n = 50例)(p = 0.001近端与远端段)。酒吧是细分强调酸抑制剂的患者数量(质子泵抑制剂(PPI))。(B)的意思是炎症的分数进步向近端gastro-oesophageal结(美)对牙齿患者(n = 16≥8厘米)。* * p = 0.007较远端部分。
符合光显微镜的发现和突出的嗜中性粒细胞组成部分炎性细胞浸润,引发表达增加了双重的近端(4297 (912)pg /毫克)较远(2192 (634)pg /毫克;p = 0.02)。同样,促炎细胞因子的表达IL-1β增加3.8倍的近端(10 500 (3299)pg / mg)较远(2711 (520)pg / mg)段(p = 0.002)。IL-1β表达也显著增加了在上面的鳞状上皮炎症是段(7838 (1638)pg /毫克)(p = 0.01)。相比之下,抗炎il - 10表达增加远端(4079 (605)pg / g)与近端是(3401 pg / g (402);p = 0.04)(图2)。按照我们之前的研究结果,28il - 4蛋白表达增加是样品(平均1272 (304)pg / mg)与邻鳞状食管粘膜(660 (59)pg /毫克)(p < 0.005)。然而,没有差别水平的il - 4的表达在远端与近端部分(p > 0.05)(数据没有显示)。
器官培养后,表达白介素(IL) 8 (A), IL-1β(B)和IL - 10 (C) ELISA测定。从鳞状食管活检,近端巴雷特食管上皮的(是),远端,和十二指肠在同一病人比较每个细胞因子(至少10位病人)。注意,il - 10的单位是pg / g由于其半衰期短。* * * p < 0.05, p < 0.005较远。
巴雷特的化生的亚型分布段
没有差别在胃和肠上皮化生的比例是段的任何部分(p = 0.95)(图3),独立存在的发育异常(p = 0.58)。肠上皮化生的主要类型是II型(不完整的小肠胃型non-sulphated唾液黏蛋白)但在发育不良的存在类型III化生(与硫酸化黏蛋白特性类似于结肠上皮)成为主流(p < 0.05)(无花果3 b, 4)。没有关系的亚型肠上皮化生和段或区段长度内的位置(p > 0.5)(数据没有显示)。
肠化生和胃亚型测定粘蛋白染色(A)。有一个马赛克的肠道和胃亚型沿着巴雷特食管上皮的(是)段、独立程度的发育不良:没有发育不良(n = 10),低品位发育不良(乐金显示器)(n = 8),和优质发育不良(HGD) (n = 6) (p > 0.5)。主要的肠道亚型(I型,完整的小肠胃型;II型,不完整的小肠胃型;类型III,大肠型)显示为同一患者团体根据程度的发育不良(B)。* * p = 0.01相比其他化生的亚型患者相同程度的发育不良。
代表染色模式III型肠上皮化生。(一)蓝色阿尔新蓝/周期性acid-Schiff酸性黏蛋白(AB / PAS)染色。布朗(B)高铁二胺/ AB为硫酸化黏蛋白染色。此外,还有sulphomucin积极non-goblet柱状细胞。(C)红色高碘酸盐染色borohydride-PAS O-acetylated唾液黏蛋白。
il - 10表达
的倾向增加il - 10的远侧地癌症占主导地位,我们比较发育不良的言论而non-dysplastic标本。而il - 10表达仅限于炎性细胞浸润non-dysplastic标本,il - 10表达的强烈上皮细胞和炎症细胞的发育不良(图5)。
免疫组织化学染色白介素10代表。(一)积极炎症细胞(箭头)固有层non-dysplastic巴雷特食管上皮的(是)(放大×20)。发育异常的是(B和C;放大×40)有大量的积极的炎症细胞在固有层(箭头(B)和(C)),以及明显的胞质上皮染色(C)(箭头)。
酸和胆汁盐对细胞因子表达的影响
酸和胆汁的作用在IL-1β表达式是机关文化依赖于模式的接触。IL-1β表达式中有一个趋势是增加了脉动的酸和减少连续酸暴露(p = 0.1,数据未显示)。暴露的鳞状和巴雷特食管粘膜胆汁了更明显的影响,但由于interpatient变异这并没有达到统计学意义(图6)。IL-1β鳞状上皮的表达增加了接触任何数量的胆汁曝光(p = 0.07)。相比之下,IL-1β表达式中只增加了脉动的曝光(p = 0.09)。没有明显酸和胆汁对il - 4表达的影响(数据没有显示)。
影响外植体接触胆汁脉动的或连续的方式(n = 11)。外植体培养24小时后,上层清液中细胞因子的表达是由ELISA。,巴雷特食管上皮细胞;IL-1β,白介素- 1β。
squamocolumnar细胞培养中细胞因子的表达
一个简化的体外coculture模型被用来模拟squamocolumnar结。引发和IL-1β表达减少,单个细胞培养达到confluency(图7)。相比之下,这些细胞因子的表达显著增加,cocultures达到confluency与单一文化相比(p < 0.0001)。此外,IL-1β表达增加了一倍以上在72小时的coculture相比最大的表情出现在单一文化在12小时(p < 0.0001)(图7)。
细胞因子mRNA表达是由竞争力的量化逆转录-聚合酶链反应对白介素(IL) 1,β(A)和引发(B),细胞被播种时间= 0,达成confluency 72小时。TE7(巴雷特的癌细胞株)和OE-21(鳞状细胞癌细胞株)单独培养和coculture时比较。* * * p = 0.017, p < 0.001, * * * p < 0.0001相比,单一的文化在同一时间点。
讨论
我们的结果表明有炎症内梯度。炎症是最大的新squamocolumnar结相关的食管炎和促炎细胞因子的特点是增加了表达IL-1β和引发。近端炎症不是解释为化生的亚型的分布。然而,促炎细胞因子表达是不定地引起间歇性暴露的是酸和胆汁,并显著增加了squamocolumnar交互。相比之下,远段的特点是一个相对non-inflamed柱状上皮与高水平的il - 10的表达有关。
炎症发生的倾向向近端鉴于接触refluxate有趣的是最大的美和减少对口腔。16炎症的程度是独立的PPI药物虽然有减少的趋势近端炎症患者质子泵抑制剂。可能是胆汁盐部分负责近端炎症而且PPI数据表明,标准剂量的药物可能不能完全抑制胃酸倒流在大约30%的患者。48岁的49
炎症性梯度也独立于化生的亚型。传统上,是被认为含有胃fundic-type上皮在美附近,专门在squamocolumnar结肠道上皮细胞,和cardiac-type粘膜。50gastric-type上皮远侧地的存在会更高度适应一个酸性环境。然而,我们的研究结果表明,在保持是化生的亚型的马赛克和另一个系统穿刺活检术的研究51和已知的异质性的细胞和分子水平。30.52岁的53
然而,我们的数据表明,脉动的暴露是鳞状上皮和近端胆汁盐诱导IL-1β的表达。然而,这并没有达到统计学意义由于大型interpatient可变性(图6)。此外,显著影响的鳞状上皮和柱状上皮细胞类型之间的相互作用可能是重要的促炎反应的一代在这个网站(图7)。squamocolumnar细胞相互作用的重要性与证据是一致的在胃贲门粘膜损伤高度本地化的squamocolumnar结GORD患者。此外,在这项研究中仅包含扁平粘膜活检没有特别发炎。54
炎症的相对缺乏的远端部分是美津附近接触refluxate最大建议是是一种适应性反应gastro-oesophageal逆流接触(图1)。有效的抗炎的存在/ th2细胞因子il - 10可能的预防中起到关键作用的促炎反应远侧地(图2),或者th2表达可能是一个二级反应的柱状细胞gastro-oesophageal回流。
il - 10的表达增加远侧地很有趣的il - 10和致癌作用之间的联系。55 -58il - 10可能作为肿瘤细胞的免疫逃逸机制通过抑制MHC II级依赖抗原表达和th1细胞因子的生产。25在这项研究中,优质发育不良患者增加了上皮细胞和炎症细胞il - 10的表达(图5)。然而,患者的数量在这个群体太小,决定在多大程度上这些因素可能会影响网站在被偏爱致癌作用。
在未来,更好地了解网站的特定细胞因子的作用是和refluxate对细胞因子表达的影响可能使我们能够开发更有效的治疗方法来预防这种疾病的炎症和肿瘤并发症。
确认
丽贝卡·菲茨杰拉德是MRC临床科学家和Benjami Onwuegbusi MRC博士奖学金。皮埃尔Sirieix被联合研究的资助支持圣巴塞洛缪医院董事会,目前一个MRC资助的研究助理。萨勒姆阿布达拉支持利比亚政府奖学金。我们都感谢内窥镜检查人员和患者请参加。