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背景:纯合子突变的内皮素A受体(EDNRB)在发现致命的基因(sl / sl)老鼠导致巨结肠病(HSCR)分段aganglionosis长。然而,对肠神经系统的发展的影响(ENS)推广的一个杂合的突变EDNRB基因是未知的。本研究旨在描述和morphometrically评估表型异常存在的杂合的(+ / sl)EDNRB有缺陷的老鼠相比,纯合子(sl / sl)EDNRB不足和野生型老鼠(+ / +)。
方法:远端小肠、盲肠和结肠都获得sl / sl + / sl, + / +老鼠。为了演示三维实体组织,肠道壁microdissected进wholemounts和孵化pan-neuronal标记9.5蛋白基因产物。形态学量化评估实体包括神经节的大小和密度,每神经节的神经细胞,神经纤维的直径肠肌和黏膜下神经丛内链。
结果:Sl / Sl老鼠的特点是完整aganglionosis类似相同的HSCR患者中观察到的组织病理学特征。+ / sl老鼠显示更微妙的存在的异常:黏膜下神经丛的特征是大大增加神经节的大小和密度,和过分生长的神经纤维束。的形态学评价之间的肌间神经丛未显示统计学意义差异+ / sl + / +老鼠。
结论:sl / sl的老鼠相比,+ / sl的老鼠显示non-aganglionated畸形ENS.有趣的是,这些动感的异常相似的组织病理学标准肠神经发育不良(印第安纳州)。尽管印第安纳州被描述在几个肠道蠕动障碍,明确clinical-histopathological实体的概念仍然是争议进行了讨论。目前的发现支持了印第安纳州的概念基于明确的形态标准表明遗传链接,从而可能为人类提供一个模型。此外,数据突显出重要作用的“基因剂量”表型效应推动的EDNRB/EDN3系统并确认存在的发展不是一个“要么全部要么没有”的现象。
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- 印第安纳州,肠神经发育不良
- EDNRB内皮素B受体
- EDN3,endothelin-3
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- sl / sl,纯合子
- + / sl,杂合的
- + / +,野生型
来自Altmetric.com的统计
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巨结肠病(HSCR)是一种先天性畸形的肠神经系统(ENS),视为multigenic neurocristopathy,1和代表重要的儿科发病率和死亡率的一个原因。2HSCR完成的组织病理学特征特性缺乏神经节肠肌和黏膜下神经丛和神经纤维肥大的远端部分胃肠道内链。在过去的十年中不同基因突变已确定在HSCR患者。3
肠神经发育不良(印第安纳州)一词在1971年首次引入Meier-Ruge4描述增生性改变黏膜下神经丛的底层肠道蠕动障碍症状在HSCR所观察到的类似。印第安纳州被报道在成人和儿童患有慢性便秘和经常与HSCR有关。巨头神经节和神经纤维链过度增大的黏膜下神经丛是最著名的印第安纳州的组织病理学特征。5,6然而,印第安纳州的病因学是不清楚和明确定义的概念clinical-histopathological实体仍争议进行了讨论。7HSCR和印第安纳州经常发生在组合,8相似的分子缺陷可能造成这些不同的存在的发展障碍。
个体发育的研究表明,内皮素a受体突变(EDNRB)基因或其特定配体endothelin-3 (EDN3)导致缺陷的神经嵴细胞的发展。9日,10当殖民肠道的神经嵴细胞是不完整的,远端小肠aganglionic剩下的一部分。一个功能EDNRB/EDN3系统通常可以防止过早波峰提取前体细胞的分化使前体人口持续足够长的时间完成胎儿肠的殖民化。11日,12这样的一个基因参与HSCR的发病机理EDNRB。13在人类身上,突变EDNRB和EDN3基因13日,14可能是由HSCR患者的10%。15到目前为止,至少有13个不同的突变EDNRB基因与肠道有关aganglionosis已确定。16 -18一个纯合子EDNRB不足导致华尔登布尔氏综合症的IV型(Shah-Waardenburg综合症),第二长分段HSCR和华尔登布尔氏综合症的特点是感音神经性听力损失和颜料的障碍。14日,19日,20.这种表型不仅观察到人类的动物模型EDNRB或EDN3基因纯合子地中断或突变。21日,22
发现致命(sl)与纯合子的老鼠EDNRB不足之处,一个HSCR建立动物模型,23日,24发展megaintestines长引起的分段aganglionosis类似相同的组织病理学观察人类HSCR特性。24纯合子(sl / sl)大鼠的特点是白色外套颜色与色素斑点25两者都显示301个基点删除EDNRB基因。23老鼠携带这个删除的只有一个EDNRB基因(杂合的EDNRB有缺陷的老鼠,+ / sl)不开发HSCR和颜料的异常,但小异常肌间神经丛的建议。26在人类中,杂合的EDNRB基因突变也不显示一个关联的华尔登布尔氏II型的表型,但可能导致HSCR。然而,HSCR表型是不完全纯合突变的外显率(74%)低于杂合的(21%)。畸形的存在而没有HSCR杂合的和纯合子个体是未知的。3
因此,本研究的目的是评估可能存在的异常+ / sl 301个基点删除一个老鼠EDNRB基因。是否的杂合的突变EDNRB基因能够引发畸形的存在像印第安纳州的组织病理学特征还有待验证。
材料和方法
老鼠
动物从Wistar-Imamichi AR应变(先天性aganglionosis)作为纯合子(sl / sl)老鼠。23日,27他们通过交配繁殖杂合的老鼠(+ / sl)。老鼠有一个常染色体隐性301 bp的删除EDNRB基因生成第1外显子和内含子1,对应于第一和第二的跨膜域EDNRB。25动物断奶的妈妈在21天的年龄和维护标准的啮齿动物食物随意。每个老鼠的基因型用于实验证实了使用引物聚合酶链反应侧翼的301个基点删除突变EDNRB基因。28四个星期老+ / sl老鼠(n = 5)比较两个星期老sl / sl (n = 5)和四个星期老野生型(+ / +)大鼠(n = 5)。
肠道wholemounts和免疫组织化学
深乙醚麻醉后,老鼠牺牲和肠道立即被移除。小肠、盲肠和结肠都充满着一个固定的解决方案(3%磷酸多聚甲醛缓冲,0.2%苦味酸)两个小时。执行的形态学评估、无偏肠道扩张的程度,标本获得+ / +和+ / sl老鼠同样拉伸导致小肠的腔的直径相同,盲肠和结肠。固定后,肠段肠系膜边境裂开和50%乙醇洗4×10分钟。改善免疫组织化学条件,标本在0.1磷酸钠冲洗缓冲和存储在一夜之间在4°C在同一个解决方案补充0.05%硫柳汞。治疗后NaCNBH为0.1%330分钟,标本清洗和存储在4°C 0.1包含0.01%南磷酸钠3。
肠道wholemounts膜肌层和黏膜下层切割stereomicroscopic控制。预处理后10%正常山羊血清(Dakopatts,哥本哈根,丹麦;X 907) 30分钟他们孵化一个9.5蛋白基因产物引起的抗血清(95101年Ultraclone RA,稀释1:400)24小时。29日,30.山羊antirabbit免疫球蛋白(Dakopatts Z 421,稀释1:10 0)被用作辅助抗血清。解决方案中的wholemounts被孵化含有过氧化物酶antiperoxidase复杂(113年Dakopatts Z,稀释1:10 0)12小时。4-Chloro-1-naphthol作为发色体的过氧化物酶反应。
形态测量学和统计分析
除了描述性的组织病理学评估动感的异常,+ / sl + / +实体的老鼠受到的形态学分析。测量包括登记神经节、神经细胞和神经纤维束,并分别进行了肠肌和黏膜下神经丛。评价进行盲评的两个评级机构。对于所有的测试,评分者间信度范围从0.88到0.96 (p < 0.0001)。
每个动物的肠道被切割成24 wholemounts 12膜肌层和12的黏膜下层,对应于小肠(n = 10),盲肠(n = 4)和结肠(n = 10)。在每个wholemount 10个随机选择的神经纤维的直径线记录和平均值计算。意味着神经节的密度计算通过计算神经节的数量在四个不同领域(1毫米2在给定wholemount)。决定意味着神经节的大小、八个神经节的面积测量软件的使用手册分割函数包Kontron KS 100(德国蔡司)允许手动跟踪感兴趣的区域。每神经节神经元内容决定通过计算位于10神经节神经细胞的数量。
分别为每个组数据汇集和评估肠段的检查(小肠、盲肠、结肠)。统计对比老鼠和+ + / + / sl老鼠是由非参数双尾Mann-Whitney U p≤0.05视为一项指标的检测意义。
结果
宏观研究
结肠、盲肠和回肠末端sl / sl老鼠(图1)收缩导致长分段“megaileum”(图1 d)。的肠子+ / sl(图1 b)和+ / +(图1 c)大鼠显示正常的宏观特性(图1 e、f)。只有在一种动物在+ / sl集团是盲肠缩小(图1 e)。然而,没有+ / sl老鼠显示功能性肠梗阻的临床体征和所有发达国家通常类似于野生型老鼠。Sl / Sl老鼠前三个产后周内死亡。
(+ D) sl / sl鼠的肠道。而近端小肠(箭头)似乎正常,远端部分(大箭头)的宽度(“megaileum”)。狭隘的地区从结肠和盲肠还包括回肠末端(小箭头)。(B + E)的动物+ / sl集团盲肠是缩小的。(C + F) + / +鼠的肠道。回肠、盲肠和结肠通常配置显示扩张和收缩段。
组织病理学研究
sl / sl狭隘的肠段内的老鼠,神经节肠肌和黏膜下神经丛缺席(无花果2、3)。而肌间神经丛的特征是增厚的神经纤维链运行在caudocranial方向,黏膜下神经丛由不规则分布密集的神经网络的神经纤维束。过分生长的神经纤维链延长口头向过渡区。扩张肠段内的神经纤维链成为薄和分枝成更小的分支。近端肠肌和黏膜下神经丛的megaileum通常配置显示常规的神经节神经网络的特征。
结肠肌间神经丛(一)sl / sl的老鼠,老鼠(B) + / sl, (C) + / +鼠。肌间神经丛的sl / sl老鼠aganglionic、神经纤维的特点是过分生长线(箭头)运行在caudocranial方向。的神经网络+ / sl + / +大鼠由神经节(箭头)和互连神经纤维链(箭头)。中遇到一些ganglia + / sl老鼠似乎比在+ / +大老鼠。Wholemount准备,9.5蛋白基因产物,×100。
结肠黏膜下神经丛(一)sl / sl的老鼠,老鼠(B) + / sl, (C) + / +鼠。黏膜下神经丛sl / sl老鼠的特点是缺乏神经节和神经细胞和由一个密集的网络过分生长的神经纤维链(箭头)。比较(B)和(C)表明神经节(箭头)+ / sl老鼠放大和更多的人口分布。的神经网络+ / sl老鼠经常包含神经纤维链(箭头)的直径增加。Wholemount准备,9.5蛋白基因产物,×100。
+ / sl老鼠没有显示远端aganglionosis,观察到sl / sl老鼠。然而,与+ / +动物相比,+ / sl老鼠显示以下结构异常:肌间神经丛经常包含神经节更大的规模和主要的神经纤维股似乎略增厚(图2 b 2 c)。这些发现在黏膜下神经网络更为明显,表现出一个明显的增加神经节的密度和大小(图3 b, c)。频繁的边界相邻神经节融合形成“神经节的企业集团”。高放大显示的神经节+ / sl老鼠包含神经元的数量增加而+ / +老鼠(图4,4 b)。此外,黏膜下神经纤维的直径线似乎扩大,特别是+ / sl盲肠和结肠内的老鼠。然而,没有神经细胞变性或神经不成熟的迹象(神经元减少的大小和不发达细胞质)被观察到。
结肠黏膜下神经丛(a) + / sl的老鼠和(B) + / +鼠。在高放大倍数增加神经节的大小和增加每神经节神经元数量+ / sl老鼠而+ / +老鼠很明显。Wholemount准备,9.5蛋白基因产物,×200。
的形态学分析
而aganglionic条件在sl / sl老鼠非常明显,那么严重畸形的存在中遇到+ / sl老鼠,如上所述,受到的形态学分析来验证如果+ / +老鼠的变化显著不同(表1 - 3)。关于肌间神经丛,被发现没有明显的统计学差异+ / +和+ / sl老鼠之间关于神经节的大小和密度,神经元的内容,或神经纤维直径链。然而,因黏膜下神经丛所得数据的统计比较,证实了ganglia + / sl的老鼠明显增大,包含更多的神经元,更密集分布。意味着神经节+ / sl鼠密度超过+ / +大鼠小肠约两次,三次盲肠和结肠的五倍多。类似身高梯度也为神经节的大小和神经元记录内容,表明黏膜下神经丛的增生性改变的远端部分肠道内更为明显。观察也是由对黏膜下神经丛的神经纤维链:而在盲肠和结肠+ / sl的老鼠平均直径显著不同从+ / +老鼠(2倍),在小肠被发现没有明显的统计学差异。
讨论
在目前的研究中,我们表明,杂合的301 bp的删除EDNRB基因导致形态异常ENS.显著的改变主要影响黏膜下神经丛和由神经节的大小和密度的增加,增加了神经节的神经元内容,肥大的神经纤维束。显然,一个杂合的缺陷不完全废除抑制性的潜力EDNRB/EDN3系统11让肠道被殖民统治的前体细胞。然而,一个功能的损失EDNRB基因可能导致过早形成“神经节集团”的安排到正常大小的神经节神经细胞已经完成。随着肠道层黏膜下层是最后的殖民在校内的前驱细胞迁移,不完整的存在会影响架构的发展尤其是黏膜下神经网络。此外,随着EDNRB / EDN3系统主要影响神经发展的远端部分肠道内,11日,12畸形的存在将会主要在这一地区。的确,形态学分析的实体+ / sl的老鼠证实,最明显的异常是位于盲肠和结肠和小肠内只有一个较小的程度上。
有趣的是,畸形的存在中观察到+ / sl老鼠,黏膜下巨大的神经节和过分生长等神经纤维链,像印第安纳州的组织病理学特征描述的人类。5,6印第安纳州被报告为一个肠神经病理学基础严重慢性便秘和肠道pseudo-obstruction在儿童和成人。31日,33争议有关的可靠性诊断(例如,组织病理学标准,图像测量技术)和临床管理(例如,保守与手术治疗)质疑作为clinical-histopathological实体。34岁,35然而,地貌形态示量分析的实体+ / sl老鼠进行本研究清楚地显示病变类似发现在IND-for示例中,hyperganglionosis黏膜下神经丛和肥大的神经纤维束。因此至少从形态学的角度来看,我们的研究结果支持印第安纳州的概念作为一种独特的肠道动感的障碍。Hyperganglionosis肠神经丛最近也被描述在一个小鼠模型携带Ncx (Enx Hox11L1)不足,提出了作为人类的模型。36岁,37这些数据表明,相同的表型异常的存在可能是由于多个遗传因素,作为HSCR已被证明。3
尽管数量的增加神经元的病理生理意义不是完善的,据报道,神经细胞增生的Ncx (Enx Hox11L1)老鼠不足导致不正常的肠蠕动37海马神经元的数量增加菲英岛缺乏小鼠学习异常原因。38因此hyperinnervation肠黏膜下神经丛可能会导致不适当的激活的神经元。黏膜下神经丛是积极参与肠道蠕动的调制,39改变在这个异常的神经network-apart肠肌plexus-may也引发肠道运动障碍导致慢性便秘的症状。
在产后早期,+ / sl老鼠显示没有明显的功能性肠梗阻的迹象。我们不能排除肠神经畸形可能是临床上补偿在给定的时间内,不得导致肠蠕动障碍直到成年。而+ / sl老鼠没有显示HSCR的组织病理学和临床特点,在大约5%的患者HSCR杂合的EDNRB缺陷被发现。3目前尚不清楚患者没有HSCR,携带一个杂合的EDNRB不足,显示异常的存在在+ / sl老鼠所观察到的类似。如果EDNRB基因突变是杂合的,那么严重肠神经畸形如印第安纳州可能会由于较弱的基因产物的表达。系统的基因的杂合的突变筛查EDNRB基因代表肯定组患者诊断为印第安纳州尚未执行。然而,最近,它已经表明,在少数患者印第安纳州(n = 20)和联合HSCR /印第安纳州(n = 12),一个EDNRB突变不能被识别。40这并不奇怪考虑的频率EDNRB突变HSCR只有2 - 4%。3同样也适用于那些HSCR病人已经另外诊断为印第安纳。此外,没有基因缺陷患者的印第安纳州也可以归因于这样一个事实:可能出现异常的存在不仅来自先天,也从环境因素。特别是,增生性改变,在印第安纳州,也描述了在实验肠道狭窄反映实体的产后可塑性。41
相比之下,SOX10、内皮素转换酶和其他因素(例如,GDNF神经营养因子蛋白家族,neuropoietic细胞因子),42 -46的EDNRB/EDN3系统作为一个肠神经元分化的抑制工具。11而一个功能EDNRB/EDN3系统防止分化的前体细胞在殖民之前整个肠道壁,纯合子的缺陷导致过早离开远端肠道aganglionic分化。目前的研究提供了morphometrically证据证实存在表型的不仅是改变通过纯合子,还杂合的301个基点的删除EDNRB吉恩:而纯合子的缺陷导致长分段HSCR,杂合的EDNRB缺乏导致了IND-like组织病理学。后者观测表明,hyperganglionosis可能与遗传缺陷,+ / sl老鼠可能为人类提供另一个模型。此外,数据突显出重要作用的“基因剂量”表型效应推动的EDNRB/EDN3系统并确认存在的发展不是一个“要么全部要么没有”的现象。
引用
脚注
↵__现在地址:内科(椅子:教授G Adler),德国乌尔姆大学