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背景:在肝硬化门脉高压的结果增强肝内阻力增广流入。前部分是由于肝内血管收缩和血管舒张之间的不平衡。增强肝endothelin-1和减少活动本构内皮一氧化氮合酶(NOS 3)在CCl四氯化碳(报道4)肝硬化大鼠肝脏。
目的:研究是否增加肝CCl号3可以获得4由体内cDNA肝硬化大鼠肝转移和调查可能影响门户的压力。
方法:3肝NOS免疫组织化学和免疫印迹被用来测量3号蛋白质。重组腺病毒携带cDNA编码人类3号、CCl的门静脉注入4肝硬化大鼠。肝硬化控制接收载波缓冲区,赤裸裸的腺病毒或腺病毒携带lac Z基因。
结果:号3免疫反应性和大量的蛋白质(西方墨点法)CCl明显减少4肝硬化肝脏。互补脱氧核糖核酸转移后,3号表达和蛋白质的数量部分恢复。入口压力为11.4(1.6)毫米汞柱在未经治疗的肝硬化(n = 9)和11.8(0.6)在虫胶Z转染(n = 4)肝硬化大鼠但减少到7.8(- 1.0)毫米汞柱(n = 9)五天后3号cDNA转移。没有观察到全身血液动力学变化,肝脏测试或尿硝酸盐、肺、肾、或在第3号表达式表示一个高度选择性转移。
结论:号3 cDNA肝硬化大鼠肝转移的可行性和肝3号的增加导致显著降低门脉高压没有系统性影响。这些数据显示肝内NOS的主要血液动力学的作用3 CCl在门静脉高压的发病机制4肝硬化。
- 一氧化氮
- 一氧化氮合酶
- 肝硬化大鼠
- 基因转移
- 门脉高压
- Ad5,重组腺病毒血清型5
- β-Gal,β-galactosidase
- 创新领导力4、四氯化碳
- 不,一氧化氮
- 3号、本构内皮一氧化氮合酶(NOS同种型3)
来自Altmetric.com的统计
门脉高压是肝硬化的主要并发症。门户压力升高的结果从增强正弦阻力增强涌入的门户静脉血。1后者是继发于肝外小动脉的血管舒张的特点是内源性血管收缩剂的反应性下降,包括去甲肾上腺素和血管紧张素ⅱ,2大概是由于增强血管扩张的物质的存在。1,3,4最近的数据表明一氧化氮(NO)的重要作用,内皮产生的本构的主动脉和肠系膜动脉内皮一氧化氮合酶(NOS 3)发病机理的周边血管舒张。4 -6增强肝血管阻力由于纤维组织似乎不容易治疗。然而,研究包括肝硬化大鼠肝硬化患者肝脏以及证明增强肝内血管阻力,至少部分由收缩引发的元素7 -14可修正的。激活肝星状细胞似乎特别参与这个过程,因为它们转变成myofibroblasts可以收缩的正弦曲线。14日,15Endothelin-1,没有被认为是最重要的血管收缩剂和血管舒张剂,分别作用于星状细胞。10 -15正常的门静脉压力似乎源于肝内没有生产由内皮细胞之间的平衡14日,16日,17和血管收缩剂剂如endothelin-1。17日,18四氯化碳(CCl4)肝硬化大鼠模型,初步结果表明NOS 3免疫反应性以及肝脏NOS活性降低。19日,20.此外,CCl内皮细胞分离4肝硬化肝脏也降低NOS活性。21日,22增强在肝硬化门静脉压力可能导致生产不来抵消增强endothelin-1不足。14如果这是正确的,当地生产的增加不可能导致减少门静脉高压。
研究这些病理生理事件,我们测量肝CCl 3号4肝硬化大鼠肝脏和调查3号是否可以增强体内的肝cDNA转移如果这cDNA转移对门户产生影响的压力。19
材料和方法
创新领导力4肝硬化
肝硬化是CCl引起的4由填喂法在12周近亲交配的雄性Wistar鼠200 - 250 g(比利时鲁汶大学动物屋)接收他们的饮用水中苯巴比妥,概述。23治疗的动物经当地委员会批准鲁汶天主教大学的动物实验。
在肝硬化大鼠体内cDNA转染
肝硬化大鼠被随机分配接受,intraportal注入,重组腺病毒E1删除5携带人类NOS 3 cDNA (Ad5NOS3)血清型(n = 9)。一代通过同源重组腺病毒,其净化,以及体内cDNA转移的可行性报告。24 -26
其他肝硬化大鼠作为控制和接受:
载体缓冲区(安慰剂):400μl 100毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值7.4 (n = 9);
E1删除重组腺病毒血清型5携带cDNA lac的Z (Ad5βGal)编码基因大肠杆菌β-galactosidase(β-Gal) (n = 4)。这个记者酶允许评估分布的cDNA转移和adenoviral的组织学影响转染;
没有添加cDNA E1删除重组腺病毒血清型5(所谓的空病毒Ad5RR) (n = 3)。
正常大鼠(n = 9)作为另一个对照组;五个接受Ad5NOS3 cDNA Ad5RR传输和接收到的其他四个空病毒。
intraportal注入技术
创新领导力4肝硬化大鼠保持在戊巴比妥麻醉(30毫克/公斤);门静脉暂时与非创伤性显微外科夹夹尽可能肝门。细针(26日计)插入夹之间的门静脉和肝。门脉循环是第一次冲洗1毫升的100毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值7.4。然后,400μl三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液pH值7.4(安慰剂)或400μl 5×109病毒空斑形成单位/毫升Ad5RR(空),Ad5βGal或Ad5NOS3慢慢注入门静脉。其次是注入100μl三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液。将夹门静脉30分钟延长adenovirus-sinusoidal细胞接触。腹部被关闭和动物可以从麻醉中恢复过来。
在初步实验中,重组腺病毒携带的最佳剂量3号cDNA被评估使用浓度范围从5×106空斑形成单位Ad5 / 5×10毫升11空斑形成单位Ad5 /毫升。低腺病毒浓度并未导致增加NOS 3表达而最高浓度引起轻微的肉芽肿性肝炎(数据未显示)。因此,我们使用100倍低浓度(5×109空斑形成单位/毫升)的腺病毒进行进一步的实验。
血液动力学的测量和生化
血液动力学的测量进行了破盲的方式在0天,第五天在正常大鼠,转染与Ad5NOS3 (n = 5)或空病毒(n = 4),并在第五天安慰剂肝硬化大鼠(n = 9),在Ad5βGal转染大鼠肝硬化(n = 4),并在Ad5NOS3转染肝硬化大鼠(n = 9)。24小时尿液收集4天测量尿肌酐,钠,和硝酸盐。颈静脉、颈动脉和肠系膜静脉的一个分支或门静脉插管与聚乙烯10导管在轻度戊巴比妥麻醉。所有的压力都是通过一个压力传感器(Servocorder SR 6255 n;渡边、日本)。后,动物是被过量戊巴比妥钠和肝脏,肾脏和肺组织学被移除。鲜血从腹主动脉。生化分析是由自动化实验室程序(BM日立911;德国勃林格曼海姆)。血清胆汁酸浓度硝酸和泌尿和光度测量颜色测试(Merckotest胆汁酸和硝酸Spectroquant分别; Merck, Darmstadt, Germany).
免疫组织化学
肝、肾和肺标本所有肝硬化大鼠和从10健康控制老鼠相同的年龄进行了研究。标本固定在B5-fixative光显微镜检查。随机活检在液氮快速冻结冷却异戊烷,储存在−70°C,用于免疫组织化学。
没有合酶3免疫组织化学
三个步骤间接immunoperoxidase方法用于冰冻切片。小鼠单克隆抗体特定人类3号从转导获得实验室(美国肯塔基州的列克星顿)和1/200的稀释使用。孵化的主要抗体之后,过氧化物酶共轭兔子antimouse和过氧化物酶共轭猪antirabbit免疫球蛋白。所有二级和三级抗血清来自Dakopatts(丹麦哥本哈根)和稀释在磷酸缓冲盐,pH值7.2,包含10%的正常人血清。孵化项目都是在室温下进行了30分钟,其次是清洗三磷酸缓冲盐的变化,pH值7.2,15分钟。反应产物是揭示了3-amino-9-ethylcarbazole和过氧化氢。我们执行与迈耶的苏木精复染色。负控制包括更换主要抗体的免疫小鼠腹水(美国宾夕法尼亚州卡佩尔实验室,Cochranville)。号3免疫反应性肝脏内皮细胞是半定量的得分没有反应(0),弱反应性(1)适度强烈反应(2),和强烈反应(3)的半定量免疫组织化学评分(图1)。3号、10个不同的大功率领域被认为每个时间和得分盲目和由两个病理学家和一个独立意味着作为最终的得分。
平均评分为本构内皮一氧化氮合酶的免疫反应性(以挪士)正弦内皮细胞来自10个不同的半定量的给出了大功率领域没有反应(0)、弱反应性(1)适度强劲的(2),和强烈的反应(3)。
牛乳糖酶组织化学
β-d牛乳糖反应,低温恒温器部分是12小时孵化的孵化3毫克5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-β——组成的介质d-galactopyranoside(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),0.3毫升N,N二甲基甲酰胺(默克公司,达姆施塔特,德国),7毫升0.1磷酸柠檬酸,pH值5,K-ferrocyanide和0.5毫升的1.65%,其次是在蒸馏水清洗和post-fixation在4%多聚甲醛。幻灯片和核快红复染色。
免疫印迹(西方墨点法)
样品的新鲜肝组织被单一化的浓度0.25 g的肝脏湿重/毫升皮套裤缓冲区,含有40%甘油;0.2 K2阿宝4。H2O pH值7.2和20毫米家伙(σ)。蛋白浓度测定的数量根据布拉德福德。27等量的蛋白质(30μg)从每个样本被7.5%钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳分离。28分离蛋白进行了电泳转移到硝基Protran膜(Schleicher和Schuell、Dassel、德国)1.5小时。膜上的蛋白质被封锁在blotto-Tween溶液(5%脱脂奶;一夜之间0.05%渐变20)在4°C。孵化与初级抗体(鼠标单克隆免疫球蛋白g 1:1000 anti-NOS 3;转导实验室)在室温下进行了两个小时,其次是洗涤与磷酸盐缓冲saline-Tween缓冲区(137毫米氯化钠;38毫米Na2HPO4点H2O;1.8毫米不2阿宝42 H2O;0.05%渐变20)和孵化二级过氧化物酶共轭兔子antimouse Ig 1:1000 (Dako、斯特鲁普、丹麦),并使用增强化学发光检测视觉效果(ECL, Amersham,雷纳姆,英国)。
统计数据
所有数据都表示为(SEM)。结果转染和non-transfected老鼠而使用一个未配对的学生的t测试。
结果
3号组织化学
平均半定量的分数,通过两个独立的病理学家不知道治疗的老鼠,在图1中给出。正常大鼠的肝脏(图2)表明NOS 3免疫反应性的动脉和静脉的内皮门户大片。胆管上皮细胞是负面的。观察肝实质,NOS 3免疫反应性在正弦和肝静脉内皮但肝细胞是负的。CCl的标本4肝硬化大鼠接受缓冲区(安慰剂组),3号的强度在正弦内皮细胞免疫反应性明显下降(图2),而与正常肝脏但不与血管内皮的门户地带。肝硬化大鼠肝脏的转染与Ad5βGal(图2)或空病毒类似正弦强度NOS 3免疫反应性安慰剂的老鼠。β-Gal染色证实肝内lac Z正弦衬里细胞转染和罕见的肝细胞(图2),肝硬化大鼠转染Ad5NOS3显示增强NOS 3正弦衬里细胞的免疫反应性(图2)与安慰剂比较治疗或虫胶Z转染动物但是号3表达仍低于non-cirrhotic老鼠。3号染色在肺和肾脏内皮细胞不是各种不同的组织(数据未显示)。
3本构内皮一氧化氮合酶(NOS)在大鼠肝组织免疫染色。过氧化物酶免疫组织化学染色,与迈耶的苏木精复染色(×250)。(一)正常肝:3号强烈表达血管内皮细胞和正弦内皮细胞。(B)与安慰剂治疗肝硬化大鼠:3号在正弦内皮细胞明显减少,但不是在血管内皮门户的大片。(C)肝硬化大鼠五天后Ad5βGal转染:NOS 3免疫反应性的安慰剂治疗肝硬化大鼠相似。(D)肝硬化大鼠AdNOS3转染后五天:3号正弦衬里细胞中表达增强的价格相比安慰剂治疗肝脏。(E)为牛乳糖酶染色lac Z转染肝硬化大鼠(×250)。
免疫印迹(西方的屁股)
的免疫反应性的肝NOS 3蛋白质识别在西方的屁股总是CCl低4比在正常控制肝硬化大鼠肝脏CCl从7(图3)4老鼠产生值通过微密度为66.7(6.4)%的七个健康对照。号3蛋白质的量增加与Ad5NOS3转染后(93.7 (6.6)%;n = 5)但不显著后注入Ad5RR (72 (5.2) %;n = 5)。
四个独立代表西方免疫印迹的本构内皮一氧化氮合酶(NOS 3)为例,给出比较正常(N)(通道1和5)和四氯化碳大鼠肝硬化non-transfected (C)(通道2,4,6),动物转染Ad5NOS3 (NOS)(车道3、7、8和10),和那些收到空病毒Ad5RR (RR)(车道9和11)。
血流动力学和生化数据后NOS 3 cDNA转移
5天,门静脉压力为6.4(0.5)毫米汞柱在正常大鼠与空病毒转染(n = 4)和显著降低AdNOS3转染动物(3.9(- 0.3)毫米汞柱;n = 5) (p = 0.04)。在肝硬化大鼠门静脉压力为11.4(1.6)毫米汞柱在安慰剂治疗只老鼠(n = 9)和7.8(- 1.0)毫米汞柱在Ad5NOS3转染大鼠(n = 9) (p = 0.04)(图4)。转染与Ad5βGal门户压力没有影响,因为它是11.8(0.6)毫米汞柱在这组(n = 4)。由Ad5NOS3动脉和中央静脉压力保持不变的基因转移,101(6)和102(16)毫米汞柱,−1.5(2.0)和−1.6(0.7)在9毫米汞柱Ad5NOS3转染和9安慰剂治疗肝硬化大鼠,分别。硝酸的24小时尿排泄不是安慰剂与不同的Ad5NOS3转染大鼠下类似的食物和液体摄入量(表1)。血清电解质、肝脏测试,尿硝酸盐没有差别(表1)。
门静脉压力(平均值),获得5天与Ad5NOS3转染后或Ad5RR(空病毒)在正常大鼠,和安慰剂注射或转染后Ad5NOS3或AdβGal肝硬化大鼠。Ad5RR空腺病毒;Ad5βGal lac Z报告基因腺病毒编码;控制,注射安慰剂;Ad5NOS3,腺病毒编码号3的互补。* p = 0.04与正常大鼠相比Ad5RR处理;†与安慰剂治疗肝硬化大鼠相比p = 0.04。
讨论
正弦高血压在肝硬化的结果增强抵抗由于hepatocytic和纤维化改变1,3和活跃的血管收缩1,10 -14血管舒张抵消了物质。在正常和肝硬化肝脏endothelin-1不,主要血管收缩剂和血管舒张药物质,分别显示门户的重要决定因素的压力。11 -18日,29日,30.减少生产没有CCl的内皮细胞4肝硬化大鼠肝脏可能导致增强的正弦血管收缩的一个重要因素。19 -22在正常情况下,以及CCl结束阶段4肝硬化,宪法内皮3号,而不是诱导同种型号、肝酶催化没有形成。16日,21日,30.肝NOS的活性报道CCl减少4肝硬化大鼠肝脏20 -22而且常常在人类肝硬化阶段结束。31日号活动可以减少是由于减少了大量的蛋白质和/或酶活性下降。有几个因素可能影响肝NOS的活性3:衬底的可用性l精氨酸32或可能回收的l瓜氨酸回l精氨酸在内皮细胞,33或抑制NOS的caveolin-1 3活动。34 -36
目前的研究表明,3号疣状减少CCl的肝血窦4类似程度肝硬化大鼠观察人类病毒和酒精性肝硬化。37号3疣状在CCl肝脏在正常和均匀4肝硬化大鼠肝脏与人类肝硬化肝脏的情况相反。373号的半定量的评分系统,计算10个不同的高功率领域,最小化的影响最终的免疫组织化学异质性,并演示了CCl明显降低4肝硬化肝脏(无花果1、2)。这个进球允许检测增强NOS 3表达,CCl号3 cDNA转染后4肝硬化大鼠肝脏腺病毒作为载体。这些结果证实了免疫印迹分析(图3),证明显著降低NOS 3 CCl蛋白质4肝硬化大鼠,增加了基因转移。CCl号3蛋白值越低4肝硬化大鼠不同于那些国王和他的同事们报告36但在其他地方比得上那些获得(58(6)%的正常价值;n = 40)(个人通信,Van de Casteele和Reichen)。这种差异的确切原因还不清楚,但可能是由于不同的免疫印迹过程作为免疫沉淀反应步骤,这些调查人员使用前再悬浮蛋白质电泳,36或者可能是肝硬化的严重程度的差异。
重要的是,增加肝转染后3号不是32 - 38%降低门静脉压力在正常和肝硬化大鼠与安慰剂相比,Ad5RR转染,或Ad5βGal转染大鼠(图4)。我们的结果是同意于和他的同事们最近的研究38观察门户减少压力和门户阻力adenoviral介导基因转移后神经元1号到胆管结扎和创新领导力4肝硬化大鼠,国王和他的同事们39使转染以挪士。当他们通过股静脉注射基因,主要是肝细胞转染除了正弦信号衬里细胞。通过使用门户路线和注射较低数量的腺病毒(109空斑形成单位/毫升在我们的研究中v1011于和他的同事们的研究38和沙和他的同事们39)我们试图避免转染肝细胞NOS在肝细胞可能与唯一的正弦信号激活衬里细胞。在这两个对照组,血液动力学的数据仍然没有改变。参数支持器官选择性intraportal NOS 3 cDNA转移到肝脏得到硝酸缺乏改变24小时尿液中排泄(表1),动脉和中央静脉压力不变,不变的NOS 3免疫反应性的转染大鼠的肾脏和肺。Ad5βGal和Ad5NOS3转染组,表明intraportal腺病毒注入剂量目前并没有引发炎症。诚然,血液动力学的测量进行了全身麻醉下巴比妥酸盐,但我们的先前的研究没有发现这种类型的麻醉的主要影响门户的压力,40和条件相同的转染和non-transfected动物。我们只测量门静脉压力;可能的影响3号cDNA转移有效CCl总肝血流量4肝硬化大鼠仍有待调查。38%的减少引起Ad5NOS3转染在我们正常的老鼠证实3号扮演了一个角色在维持正常的门静脉压力,17可能在部分平衡的影响endothelin-1门户管理应用波生坦略减少压力。18
近年来,腺病毒介导的基因转移研究作为一个新的策略来治疗遗传性传染病和恶性肝脏疾病。41岁的42正常大鼠肝细胞的体内易感性腺病毒介导的基因转移高静脉注射后运载体,43岁的44但在肝硬化肝脏肝取向可能不同纤维隔膜和内皮损失小窗可以阻碍腺病毒对肝细胞但支持传输正弦细胞。38岁的44
与腺病毒转染可能会发挥只是暂时影响转基因的寿命是短暂的,因为血管收缩剂药物,如endothelin-1,可能出现counterregulatory机制的一部分。这样增加内皮素的生产是由早期增强preproendothelin mRNA在内皮细胞和胆管结扎后在星状细胞。45因此有必要进一步的研究来获得延长的增强NOS 3蛋白质和活动。
在孤立的正常46和同4肝硬化大鼠肝脏、7,8注入任何捐赠硝普酸等药物或三硝酸甘油酯抵消去甲肾上腺素诱导血管收缩和减少门户压力,但在体内的情况下对系统的影响动脉系统盛行,甚至intraportal注入导致主要动脉低血压。47这个条件不同于人,没有当地的作用下由内皮细胞NOS 3。
总之,目前的研究提供了进一步的证据的发病机制中的一个活跃的组件在肝硬化肝内血管张力增加。创新领导力4大鼠肝脏有降低NOS 3蛋白质,和intraportal cDNA转让NOS 3使用腺病毒作为载体是可行的在这些老鼠体内。门户的减少压力后观察NOS 3转染表明CCl 3号的主要血液动力学的作用4肝硬化。
确认
支持的研究基金的资助科学研究(FWO 6.0111.98-F乃文)和奖学金委员会的东欧Omasta(鲁汶大学)。M Van de Casteele两。的博士后看来不像是不肯下水我们想感谢J Van Pelt建议和葛兰素补助金。初步沟通的工作是AASLD会议,1996。19
引用
脚注
↵__M Van de Casteele和Omasta贡献同样这项工作。