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摘要
背景:幽门螺杆菌血型抗原结合粘附素(BabA)介导细菌对胃上皮上人血型抗原的粘附。尽管菌株窝藏babA2最近发现与消化性溃疡和胃癌有关，其作用是什么巴布A2在细胞周转、胃炎的严重程度和癌前病变中的作用尚不清楚。
目的:我们相关的H螺杆菌babA2，空泡毒素(vacA)和细胞毒素相关基因A (cagA)的基因型与胃炎症的严重程度和上皮细胞周转在一组来自胃癌高发地区的中国患者。
患者和方法:H幽门分离株来自104例参与胃癌预防计划的中国患者。基因变异的babA2, vacA,cagA采用聚合酶链反应测定。根据最新的悉尼分类检查胃窦和语料库组织病理学。细胞凋亡用尿苷脱氧核苷基末端标记(TUNEL)评分，增殖用Ki-67免疫染色评分。
结果:104例患者中，102例(98.1%)隐匿cagA+菌株和所有的vacAs1基因型。的babA2+83例(79.8%)患者中发现菌株，与胃窦区淋巴细胞浸润程度较高(p=0.028)、腺萎缩(优势比(OR) 7.5, 95%可信区间(CI) 2.3-24.3)和肠化生(OR 7.4, 95% CI 2.2-25.3)有关。在感染的个体中也注意到上皮细胞增殖增加babA2+菌株(p = 0.025)。菌株窝藏cagA+/vacAS1基因型缺乏这种关联babA2．
结论:的存在babA2+H幽门菌株单独或与cagA+而且vacAS1与肿瘤前胃病变的存在相关。
- 细胞凋亡
- babA2
- 幽门螺杆菌
- 基因型
- 扩散
- 胃
- IM,肠上皮化生
- cagA细胞毒素相关基因A
- VacA,空泡毒素
- 在萎缩
- TdT，末端脱氧核苷酸转移酶
- TUNEL，三磷酸盐切口末端标记
- 人工智能,细胞凋亡指数
- π,增殖指数
- 或者,优势比
- BabA，血型抗原结合胶粘剂
- 聚合酶链式反应
来自Altmetric.com的统计
- IM,肠上皮化生
- cagA细胞毒素相关基因A
- VacA,空泡毒素
- 在萎缩
- TdT，末端脱氧核苷酸转移酶
- TUNEL，三磷酸盐切口末端标记
- 人工智能,细胞凋亡指数
- π,增殖指数
- 或者,优势比
- BabA，血型抗原结合胶粘剂
- 聚合酶链式反应
幽门螺杆菌它寄生于人的胃中，是慢性胃炎、消化性溃疡、胃萎缩(AT)、肠化生(IM)和胃腺癌的主要原因。然而,H幽门感染通常是无症状的，只有少数患者出现严重的临床后果。其原因可能与宿主的遗传易感性差异有关，1环境因素,2 -，4和遗传多样性H幽门．5，6在这种语境下，相关性是具体的H幽门毒力相关基因已被广泛研究。细胞毒素相关基因A (cagA)是第一个被确认的，并被证明与十二指肠溃疡和胃癌有关。7,8随后发现了空泡毒素(VacA)。等位变异的vacA在基因的信号区(s1, s2)和中间区(m1, m2)发现了调控细胞毒活性的基因。9具体地说,vacAS1 /m1株细胞毒活性高于S1 /m2株，而s2/m2株无细胞毒活性。9
除了细菌毒素，最近的研究提供了证据，细菌粘附因子可能也有助于致病性H幽门．血型抗原结合胶粘剂(BabA)已被证明是介导的粘附H幽门胃上皮细胞上的人类血型抗原。10日,11已克隆出两个编码BabA的相应基因:巴巴1,babA2，但只有babA2基因是功能活跃的。12最近,babA2与十二指肠溃疡、胃癌有显著相关性。13的重要性H幽门胃上皮细胞周转、胃炎症程度、腺AT和IM的粘附因子尚不清楚。观察到这些毒力决定因素的频率及其与胃肠道病理的关系似乎在不同地理区域之间有很大差异，这使情况更加复杂。在本研究中，我们进行了相关研究babA2，cagA,vacA中国患者的胃炎症、腺萎缩和IM的存在以及胃上皮细胞周转的基因型。
材料和方法
研究设计和课题
这是一项横断面研究检验了各种H幽门基因型，胃炎症和细胞周转。受试者之前被招募到一个随机对照试验H幽门山东省烟台县是中国胃癌发病率最高的地区之一。14所有受试者均行内窥镜检查，并进行胃活检。在10%缓冲福尔马林中固定两份胃窦和两份躯体活检，并进行组织学检查。一个额外的胃窦活检用于细菌培养H幽门．
在这项研究中，104H幽门阳性受试者(中位年龄50岁;范围39-75)。这些患者是从持续活动的患者中随机选择的H幽门通过细菌培养检测感染，首先随访。15这些患者之前都没有接受过抗肿瘤药物治疗幽门螺杆菌治疗。
H幽门文化
如前所述，将一个胃窦活检组织置于选择性运输培养基中，并在马血琼脂上培养，在37°C的微嗜氧条件下。15H幽门通过典型菌落形态、革兰氏染色和脲酶、过氧化氢酶和氧化酶阳性生化试验进行鉴定。用无菌棉签从培养皿中收集细菌，并在- 70°C的布鲁氏菌肉汤中添加30% (vol/vol)胎牛血清和20% (vol/vol)甘油。所有冷冻菌株都进行了污染控制。
检测H幽门基因型和测序
H螺杆菌cagA，vacA,babA2用聚合酶链式反应(PCR)测定基因型。提取基因组DNAH幽门使用高纯PCR模板制备试剂盒(罗氏，德国)。用1.2%琼脂糖凝胶与溴化乙锭染色，评估DNA的完整性。PCR反应的总体积为50 μl，其中包含50 pmol引物，100 ng基因组DNA，四种dntp各1.0 mM, 2单位的AmpliTaq DNA聚合酶(perkins - elmer, Norwalk, Connecticut, Connecticut)。引物序列在前面已经描述过13，16日,17和列在表1中⇓供参考。扩增的PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中分解，溴化乙锭染色，在短波紫外线光源下观察。PCR产物序列通过自动测序(ABI Prism 310 Genetic Analyzer;Perkin Elmer, Branchburg, New Jersey, USA)使用相同的引物对。
组织学评估
苏木精-伊红染色的胃窦和体活检切片由一名病理学家(KFT)检查，该病理学家对其他实验结果一无所知。切片编码，并根据以下参数进行组织学评估:(1)胃炎活性(粒细胞浸润);(2)慢性胃炎(淋巴细胞和浆细胞浸润);(3)在腺;和(4)IM。根据更新的悉尼分类，每个参数被分级为无(0)、轻度(1)、中度(2)或严重(3)。18腺体萎缩被定义为胃腺消失，取而代之的是化生上皮或纤维化。IM被定义为至少有三个相邻的胃小坑，每个胃小坑包含两个或更多杯状细胞。
细胞凋亡的评价及细胞凋亡指数的测定
细胞凋亡采用末端脱氧核苷基转移酶(TdT)介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记(TUNEL)技术(ApopTag;Intergen，纽约，美国)，如前所述。19此外，阳性染色的细胞还应具有凋亡的形态学特征，包括染色质凝结、核解体、核周边浓缩染色质形成月牙盖。凋亡指数(AI)的计算方法为TUNEL阳性细胞核与计数的细胞总数(通常大于1000)之比。
增殖评估及增殖指数测定
增殖通过免疫过氧化物酶染色Ki-67进行检测，Ki-67是一种增殖相关抗原，已广泛用于胃内增殖的评估。19，20.简单地说，将石蜡包埋切片脱蜡、脱水，然后进行微波抗原提取。内源性过氧化物酶被3%过氧化氢阻断。用正常兔血清(5%)防止初级单克隆抗体的非特异性结合。用小鼠抗人Ki-67单克隆抗体(克隆:mib 1，同型:IgG1，未稀释;Zymed，旧金山，加利福尼亚州，美国)。生物素化兔抗鼠抗体(稀释1:200;Dako, Glostrup, Denmark)作为二抗体，然后应用亲和素生物素化过氧化物酶复合物(稀释1:100;Dako)。玻片在四盐酸盐(DAB, Dako)中显影，用梅氏苏木精反染色。增殖指数(PI)表示为Ki-67阳性核与计数核总数之比的百分比。19
统计分析
使用社会科学程序的统计包(SPSS, 10.0版本)和MINITAB (Release 7.2, MINITAB, Inc)进行统计分析。由于年龄的影响可能会混淆胃组织学，特别是AT和IM，我们在本研究中对年龄的影响进行了调整。Mantel-Haenszel统计数据用于评估个体基因型与活性、慢性、腺性AT和IM之间的关系，并对年龄的影响进行了调整;结果以共同优势比(OR)和相应的95%置信区间(CI)表示。根据研究人群年龄中位数将受试者年龄分层为两组(> - 50岁或≤50岁)。采用Mann-Whitney U检验比较不同基因型间胃炎的严重程度。用Spearman相关系数评价(1)细胞增殖与炎症严重程度的相关性;(2)年龄和AT/IM分数。采用Pearson相关系数检验上皮细胞增殖与凋亡的相关性。双尾独立t对不同基因型间AI和PI的差异进行了检验。双侧p值小于0.05被认为有统计学意义。
结果
的特点H幽门隔离
104年的H幽门102例(98.1%)被感染cagA+菌株。所有H幽门隔离属于vacAS1基因型为98.1%cagA+/vacAs1。的中间(m)区域vacA101株菌株可以分型，其余3株无法分型。m1株43株(42.6%)，m2株58株(57.4%)。83人(79.8%)是babA2+的同时存在cagA，vacAs1,babA282例(78.8%)发现基因(三阳性)。H幽门隔离(表2⇓)．的存在babA2基因型与存在无相关性cagA或各种vacA基因型。
胃炎的组织学检查
大多数H幽门感染患者胃内有粒细胞和淋巴细胞浸润(图1)⇓)．94.2%的胃窦活检和72.1%的肌体活检可见粒细胞浸润。除了一个H幽门阳性患者有淋巴细胞浸润。一般来说，炎症的严重程度在胃窦比在身体更明显。53例患者在胃窦有IM和/或AT, 12例患者在体内有IM和/或AT。扁桃体腺萎缩的严重程度与患者的年龄相关，而不是胃窦r= 0.09, p = 0.35;语料库r= 0.24, p = 0.014)。另一方面，IM与患者年龄无显著相关性r= 0.09, p = 0.39;语料库r= 0.18, p = 0.08)。
所有研究患者(n=104)胃炎严重程度的分布。粒细胞浸润(活性)、淋巴细胞浸润(慢性)、腺萎缩和肠化生的程度按照更新的悉尼分级分为无(0)、轻度(1)、中度(2)或重度(3)。18
之间的相关性H幽门基因型和炎症
像大多数H幽门感染患者胃内有急性和慢性炎症浸润的证据，差异无显著相关性H幽门基因型和胃窦或胃体中存在粒细胞和淋巴细胞浸润(p>0.3)。然而，存在的babA2+基因型与胃窦内淋巴细胞浸润(慢性)程度较高相关(p=0.028，表3)⇓)．
之间的相关性H幽门基因型和萎缩/化生
调整年龄后，马车babA2+H幽门分离株与胃窦腺AT (OR 7.5, 95% CI 2.3-24.3)和IM (OR 7.4, 95% CI 2.2-25.3)的较高频率相关(表4)⇓)．在三重阳性(babA2+/ cagA+/ vacAs1)H幽门隔离。三阳性菌株AT和IM对应的OR值分别为7.1 (95% CI 2.2 ~ 23.3)和7.0 (95% CI 2.1 ~ 24.1)。没有一个H幽门基因型或基因型组合似乎与体癌前病变相关。
上皮细胞增殖与凋亡
研究了细胞增殖和凋亡之间的关系。PI与AI (r=0.37, p=0.001)，但增殖与炎症严重程度(活动性和慢性)之间没有直接相关性。
babA2基因型与细胞增殖
不同基因型的增殖指标如图2所示⇓．PI显著高于babA2+分离株(平均(SD) 21.3(17.7))比对照组高babA2−隔离(12.2 (13.9);平均差值9.1,95% CI 1.46-16.70;p = 0.025)。此外，两者之间的PI有显著差异babA2+/cagA+/vacAs1+(21.4 (17.9))babA2−/cagA+/vacAs1+(12.9(13.9))分离株(平均差异8.5,95% CI 0.64-16.29;p = 0.041)。然而，两者在增殖方面没有区别vacAM1(21.6(18.6))和vacAm2(16.5(15.6))菌株(平均差异5.1,95% CI−2.73-12.95;p = 0.19)。
不同细胞增殖指数幽门螺杆菌基因型。结果绘制为平均值和95%置信区间。方格表示均值，水平线表示95%置信区间的上下限。两者之间的增殖指数有显著差异(a)babA2+而且babA2−(p = 0.025);和(b)babA2+/ cagA+/ vacAs1和babA2−/ cagA+/ vacAs1 (p = 0.041)。
baba2基因型和细胞凋亡
细胞凋亡指标不同H幽门基因型如图3所示⇓．与增殖相比，人工智能之间没有区别babA2+而且babA2−分离株(平均(SD) 0.67 (0.61)v0.66 (0.52);平均差0.01,95% CI−0.27-0.29;p = 0.96)。此外，AI之间是可比性的babA2+/ cagA+/vacAs1+而且babA2−/cagA+/vacAs1+(0.68 (0.61)v0.67 (0.53);平均差0.00,95% CI−0.28-0.29;p = 0.98),之间vacAm1和vacA平方米(0.62 (0.54)v0.65 (0.49);平均差−0.02,95% CI−0.26-0.21;p = 0.86)隔离。
不同细胞凋亡指数幽门螺杆菌基因型。结果绘制为平均值和95%置信区间。两组细胞凋亡指数无明显差异(a)babA2+而且babA2−；(b)babA2+/ cagA+/ vacAs1和babA2−/ cagA+/ vacAs1;和(c)vacAm1而且vacAm2．
讨论
在本研究中，我们检测了三种基因型(cagA，vacA而且babA2)，它们被认为具有较高的致病潜力H幽门分离自中国北方。所有H幽门分离株为vacAS1基因型为98%cagA+，表示cagA+/ vacAS1基因型在该人群中高度流行，具有胃癌的高背景发病率。此外，我们发现大约80%的患者感染了babA2+毒株和41.3%的患者存在窝藏vacAm1菌株。马车的babA2+菌株与更强烈的慢性炎症相关(表3⇑)，胃窦内腺性AT和IM的存在(表4)⇑)．这种与肿瘤前胃病变的联系也在H幽门三联阳性的分离株(babA2+/cagA+/ vacAs1）相比之下,cagA+/vacA缺失的S1株babA2．最近，胃炎症和babA2基因型在德国的一项研究中被报道。21研究人员报告说，I型(cagA+/vacAs1)H幽门菌株是阴性的babA2缺乏与胃炎症和瘤前病变的联系。相比之下，德国的研究报告38%的患病率babA2的基因,babA2在我们的研究人群中大约80%都存在。在日本最近的一项研究中，糖尿病的流行babA2基因型占85%。22患病率的差异babA2+H幽门这三个不同研究中的分离株似乎与这些国家的胃癌发病率相似。在日本、中国等胃癌背景发病率较高的国家，babA2的发生频率往往较高+H幽门．附着在胃上皮细胞上H幽门是由BabA介导的，有假设认为这个附着过程先于所有其他假定的致病过程。21直观地说，通过BabA与上皮细胞的粘附可能促进了诸如CagA蛋白等细菌产物有效地传递到宿主细胞以及随后的酪氨酸磷酸化过程。23越少,babA2可能只是依恋过程的中介之一，其他未知因素也可能参与其中。否则，人们可能会发现感染和感染之间的炎症评分有更大的差异babA2+而且babA2−隔离(表3⇑)．
年龄是可能与AT和IM存在相关的因素之一H幽门被感染的人。在我们之前的研究中，我们发现老年受试者比年轻受试者更有可能出现化生进展。14然而，即使在调整了年龄后，AT和IM的频率仍然显著高于患有babA2+株或三阳性H幽门压力。在本研究中，我们将患者分为两组，以50岁为分界线，因为这是我们研究对象的中位年龄。而且，在以往的决策分析建模研究中H幽门为了预防胃癌，研究人员建议在40-50岁年龄段进行筛查被认为是合理的经济有效的。24因此，看来大部分胃的改变都与慢性有关H幽门感染在50岁时就已经出现了。
细胞增殖和凋亡之间的平衡紊乱可能导致细胞丢失和粘膜损伤，也可能导致细胞积累和癌症发展。25，26最近的研究表明，H幽门感染可增加胃粘膜细胞凋亡。19，27 -，30.然而，影响H幽门对胃上皮细胞增殖的看法是矛盾的。19，27日,30 -，33对这种差异的一种解释可能与不同细菌基因型的存在有关。34岁,35然而,是否H幽门粘附因子，如BabA，影响细胞动力学尚不清楚。我们的研究结果表明，受试者隐瞒H螺杆菌babA2+菌株的胃增殖率明显高于对照组babA2−菌株，这与炎症程度无关。更重要的是，胃细胞增殖的增加并没有伴随凋亡的增加。虽然三阳性菌株(babA2+/cagA+/vacA1)有类似的细胞增殖增加，传统I型(cagA+/ vacAs1)H幽门菌株是阴性的babA2缺乏这样的联想。换句话说，在感染了H螺杆菌babA2+菌株的胃上皮细胞增殖与凋亡之间存在分离，可能是肿瘤发生的诱因。
总之,babA2+H幽门来自烟台县的研究人群中约80%存在分离株，烟台县是中国胃癌发病率最高的地区之一。的存在babA2+H幽门菌株单独，或与cagA+/ vacAs1，与腺性AT和IM的存在以及胃窦中胃上皮增殖增强有关。运输babA2+H幽门菌株和胃上皮细胞的相关变化可能部分解释了研究人群中胃癌的高背景发病率。
致谢
作者要感谢Jessica Ching, MPH和Albert张，MSc提供的统计建议。