条文本
PDF
摘要
背景和目的:的成功幽门螺杆菌根除方案取决于胃的pH值，炎症和粘液的厚度。我们的目的是研究胃酸分泌、炎症和粘液溶解对胃抗生素转移的影响。
对象和方法:134只麻醉大鼠静脉给药甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素，胃内容物经留置管抽吸。胃炎由感染所致，胃酸分泌由奥美拉唑或五孕素控制H幽门或者服用碘乙酰胺。通过胃腔内灌注pronase来实现粘液溶解。
结果:甲硝唑的转移随胃酸分泌而增加，而奥美拉唑的转移则下降，与胃酸无关。克拉霉素也随胃酸分泌而转移，但随后迅速降解。奥美拉唑阻止了这种降解，提高了胃腔浓度。奥美拉唑不改变阿莫西林的转移。胃炎引起的H幽门甲硝唑和阿莫西林对胃转移无影响，而克拉霉素对胃转移影响增加23%。而碘乙酰胺引起的胃炎降低了克拉霉素的转移，而对甲硝唑和阿莫西林的转移没有影响。Pronase治疗使阿莫西林转移增加4倍，甲硝唑转移增加66%，但减少克拉霉素转移35%。
结论:甲硝唑和克拉霉素主要与胃酸转移，而不是通过酸捕获机制。Pronase增加胃分泌物中阿莫西林和甲硝唑的出现。
- 酸分泌
- 胃炎
- 粘液厚度
- 胃转移
- 抗生素
- 老鼠
来自Altmetric.com的统计
的发展幽门螺杆菌治疗方案很大程度上是经验的。然而，在体外和体内的疗效之间有一些明显的差异，表明抗生素胃分布的重要性。抗生素输送到胃黏液层的功效H幽门令人惊讶的是，关于居住法的研究很少。作为H幽门对标准抗生素的抗药性越来越强，1为了帮助设计新的抗生素制剂，有必要发现胃抗生素给药的基本机制。2使用阿莫西林、甲硝唑和克拉霉素的临床试验表明，使用质子泵抑制剂提高胃内pH值至关重要。3.使用弱效疗法的研究也表明，胃炎患者的消炎率高于轻度炎症患者。4 -，6这表明，炎症可能促进某些抗生素的渗透，就像脑膜炎中阿莫西林进入脑脊液的转运增强一样。7胃黏液的作用是保护胃上皮细胞不受有害物质的伤害，同时也可能为抗生素的渗透提供屏障，应用黏液溶解剂已取得良好效果，提高了根除率。8日,9本研究的目的是检查胃酸分泌和胃腔pH值对三种最常用的抗胃酸的胃转移率的作用H幽门抗生素，甲硝唑，阿莫西林，克拉霉素使用一个新的麻醉大鼠胃抗生素运输模型。该模型可以独立控制胃酸分泌和胃内ph值。我们还研究了胃炎对胃抗生素转移率的影响H幽门或者在饮用水中加入碘乙酰胺。最后用pronase破坏胃粘液，测定其对胃抗生素分泌率的影响。
材料和方法
所有实验均根据英国内政部项目许可证进行，共使用134只雄性Wistar大鼠，体重250-370克。老鼠被关在有铁丝底的笼子里24小时，并免费饮水。麻醉诱导以2.7 ml/kg腹腔内剂量1:1:2的Hypnorm(芬太尼/氟尼松)，咪达唑仑和H2使用连接到计算机记录系统的颈动脉内血压传感器监测生命体征。通过尾静脉输注0.9%生理盐水维持水合作用。在剖腹手术，套管袖口与两个“O”环通过十二指肠切口插入胃窦经幽门。用0.9%的生理盐水冲洗胃，直到抽吸物中无杂物，然后注入1.5 ml生理盐水。经过30分钟的平衡期，使胃血流量稳定下来，在两小时采样期开始时给予抗生素静脉注射，然后继续输注。给药剂量如下:甲硝唑9mg /kg丸剂，3.6 mg/kg/h滴注;阿莫西林11 mg/kg丸剂，20 mg/kg/h滴注;克拉霉素26 mg/kg丸剂，7.3 mg/kg/h滴注。
每隔15分钟取颈动脉血0.3 ml，持续2小时;离心分离血浆，速冻于N液中2．每隔15分钟用注射器抽吸胃内容物并记录其体积。净胃分泌量由吸入量减去注入量(1.5 ml)计算。用玻璃电极测量pH值，然后将样品立即在液体N中快速冷冻2然后转移到−80°C的冰箱中。两小时后，大鼠颈部脱位，切除胃，部分保存在10%福尔马林中，H幽门在液体N中测量黏液厚度2．根据炎症程度(无、轻度、中度或严重)对粘膜切片进行分类，这是评估人类胃炎的常规方法10一个胃肠病理学专家。切片用甲苯胺蓝染色以鉴别H幽门．
酸分泌/抑制实验
采用两种静脉给药方案抑制胃酸分泌。甲硝唑实验采用单剂量(10 μmol/kg)。对于阿莫西林和克拉霉素实验，最初给药20 μmol/kg奥美拉唑，在采样期45分钟再次给药，其抑酸效果类似，但更一致。在刺激分泌酸的实验中，每15分钟静脉给药一次(25 μg/kg)。控制胃内pH值(表1⇓)灌注以下缓冲液代替生理盐水:pH值2.7:甘氨酸/盐酸缓冲液，300莫索尔/kg;pH值6.0:2 - (N-morpholino) pH为6.0的乙磺酸缓冲液，300 mosmol/kg。
感应的胃炎
四个H幽门两株Hel73产毒菌株，分别给药于体重180-220克的32只大鼠11(大鼠和小鼠传代变异)、悉尼株和一种新的临床分离株。通过李和同事的方法，11大鼠灌胃2 mlH幽门在悬架(5×108每株Cfu /ml)在中午和下午4点，持续两天。一只大鼠在手术中过早死亡，未获得数据;7只既没有接受手术也没有使用抗生素的大鼠在12周时被处死，它们的胃样本用于H幽门文化和组织学。
在另一组大鼠术前一周的饮水中加入0.1% w/v碘乙酰胺(Sigma, pool, UK)诱导化学性胃炎。这减少了食物和液体的摄入，但所有动物都存活了下来。
胃mucolysis实验
胃粘液溶解使用pronase，一种非特异性蛋白酶在中性pH值下活性。12所有pronase治疗大鼠同时静脉给予奥美拉唑。先用生理盐水洗胃，然后用1.5 ml 20 mg/ml的pronase (Sigma)溶液在pH值为7.4的磷酸盐缓冲生理盐水(渗透性为312 mosmol/kg)代替生理盐水，进行30分钟的平衡期和2小时的实验。选择pronase的剂量(440酪氨酸单位/千克)以达到与人体试验中使用的浓度相似的浓度。8日,9使用Jordan和同事的方法准备大鼠胃进行黏液厚度测量。13黏液连续性以黏液覆盖的粘膜表面百分比表示。
抗生素分析
采用改进的窄孔高效液相色谱技术，在以前报道的方法基础上，测定血浆和胃吸出样品中甲硝唑、阿莫西林和克拉霉素的浓度。14 -，16用50 μl血浆或200-500 μl胃抽液等量分析。对照组采用高剂量血浆和0.9%生理盐水与原液抗生素溶液配制。样品中pronase的存在对任何抗生素的定量都没有影响。定量限甲硝唑为0.015 mg/l，阿莫西林为0.04 mg/l，克拉霉素为0.10 mg/l。在研究的浓度范围内，测定方法的精密度(定义为重复测量相同浓度的相对标准偏差)为±1.4-13.1%，线性偏差<1%。
计算和统计
120分钟实验的胃抗生素清除率(ml/min)计算为:
用胃清除率除以血浆清除率计算胃转移分数。通过校正血浆抗生素浓度的受试者间变化，这两个参数都能描述抗生素在不同实验条件下穿过胃粘膜的相对转移。17
使用SPSS 8.0软件(SPSS Inc.， Chicago, USA)计算样本统计。采用Mann-Whitney U检验比较两组结果;Kruskal-Wallis h检验用于比较三个或更多组。p值<0.05认为有统计学意义。
结果
在整个实验过程中，大鼠的生命体征保持在正常范围内。
组织学
实验2.5 h后，对照组大鼠胃黏膜组织学正常。H幽门给药大鼠胃粘膜均出现轻度至中度混合炎症细胞浸润，主要为稀疏定植H幽门．未见任何肉眼黏膜溃疡。碘乙酰胺给药大鼠有明显的血管扩张组织学特征。碘乙酰胺引起的炎症细胞浸润程度与H幽门胃炎。Pronase处理的胃黏膜宏观正常，但有明显的组织学改变。浅表上皮层开裂，部分顶端细胞层脱落。在某些切片上，血管充盈，如碘乙酰胺处理的大鼠所见。pronase处理后大鼠胃内未见异常炎症细胞浸润。
粘液厚度
胃黏液厚度H幽门无论是否进行手术，感染大鼠和对照组相似(图1)⇓)．碘乙酰胺组大鼠黏液平均厚度为87 (29)μm，对照组为162 (21)μm (p<0.05)。对照组大鼠胃粘液的覆盖率为100%，而碘乙酰胺大鼠胃黏膜的剥蚀区域总体覆盖率仅为88%。Pronase明显使胃粘液变稀，形成大间隙;总的来说，覆盖率降低到60%。平均黏液厚度降至30 (13)μm (p<0.001)v控制)。
的影响幽门螺杆菌、碘乙酰胺(碘)和pronase对胃粘液厚度的影响。惠普−ve、H幽门阴性(无手术);惠普+ ve Op,H幽门感染(手术);惠普+ ve Unop,H幽门感染控制(无需手术)。
H幽门文化
H幽门在86%的受感染对照组的胃粘膜中培养，但从接受抗生素的大鼠的胃中没有获得阳性培养，显示出相似的组织学胃炎程度和相似的定植密度H幽门．
胃液分泌
与接受高剂量奥美拉唑(3.3 (1.6)ml/kg/h)的大鼠相比，服用五味素的大鼠这一比例更高v(1.2) 2.0 ml / kg / h;p = 0.019)。既不H幽门感染和碘乙酰胺胃炎显著影响胃液分泌量。与对照组相比，pronase处理的大鼠胃分泌量更大(8.3 (1.6)ml/kg/h)v(1.2) 2.0 ml / kg / h;p < 0.001)。
克拉霉素转移
胃炎引起的H幽门与对照组相比，导致胃克拉霉素清除率增加23%(表4⇓)．与对照组相比，碘乙酰胺引起的胃炎引起克拉霉素胃转移分数虽小但显著降低;胃清除率也有所降低，但未达到统计学意义(p=0.06)。pronase处理的大鼠胃克拉霉素转移减少35%(图4)⇓)．与奥美拉唑相比，五味素给药导致克拉霉素的胃清除率和胃转移分数显著降低。然而，随后对胃抽吸样品中一种未知化合物的分析显示，克拉霉素已被分解为不活跃的酸降解产物，即脱乳酸-克拉霉素。考虑到这一降解作用，五味素给药时克拉霉素的胃清除率和胃转移分数分别为222 μl/min和3.92%，显著高于奥美拉唑给药时的胃清除率和胃转移分数(p<0.001)。
胃酸分泌和pronase对克拉霉素胃转移的影响。
讨论
麻醉大鼠模型提供了一个研究胃抗生素转移机制的机会，通过最小化受试者间的差异(年龄，性别，体重，菌株)。与人类研究相比，没有幽门丢失或胃液胆汁污染发生17新化合物的胃运输可以很容易地进行评估。五味素或奥美拉唑给药的胃pH值与人类在基础酸输出和奥美拉唑预给药期间发现的相似。17大鼠血浆抗生素浓度与人类药代动力学研究中发现的浓度相当。
另外两个动物模型的胃抗生素分泌已被报道。Ussing腔模型将大鼠胃粘膜置于透明树脂腔中，在粘膜和浆膜侧浸泡溶液。18该模型需要较高的浆膜抗生素浓度，由于没有完整的胃血供，药物扩散路径与体内不同，也没有证明发生粘膜酸分泌。最近描述的胃抗生素分泌的移植胚胎人胃模型使用人的胃组织，也可以感染H幽门但其复杂性限制了其在胃药代动力学研究中的应用。19
在正常胃酸分泌条件下，甲硝唑等弱碱可能从胃毛细血管被动扩散穿过胃粘膜，被胃液的低pH电离，然后“困”在胃腔内，这与pH分配假说一致。17，20.另一种可能是，除了被动扩散外，弱碱可能在壁细胞的酸分泌器中积累，随后随胃酸分泌进入胃腔。根据后一种假设，弱碱进入胃管腔的运输应与管腔ph无关。“困酸”仍可能发生，但将发生在分泌器官内，而不是在管腔内。通过用奥美拉唑或五agastrin控制胃酸分泌，用等渗透pH缓冲液控制胃腔pH，该模型能够区分这些可能性。在五孕激素治疗期间观察到胃甲硝唑转移率，胃腔中位pH保持在2.54或6.00缓冲液，非常相似。此外，在胃液pH为2.77和pH为5.74时，奥美拉唑显著降低胃甲硝唑的分泌率。因此，是胃酸分泌的速率而不是胃腔pH决定了胃液中甲硝唑的分泌，这意味着甲硝唑主要随胃酸转移。这些发现乍一看似乎自相矛盾，因为在临床研究中，奥美拉唑的联合使用大大提高了甲硝唑与阿莫西林或克拉霉素方案的有效性。这可能是由于增强了克拉霉素和阿莫西林的稳定性。然而，也应该注意到，即使在人的胃酸抑制期间，胃吸出甲硝唑C马克斯仍然是MIC的两倍90．此外，提高的腔内pH值确保甲硝唑(pK一个=2.52)是完全结合的，亲脂性的，因此可以通过脂质外膜被动扩散H幽门．
在服用奥美拉唑后达到胃pH值(大约pH值6)时，阿莫西林作为亲水性两性离子存在，具有logD(作为pH值的一个亲脂性函数的度量方法)17)的- 1.6倍，因此预计其在脂质膜上的转运很差。我们的研究证实了这一预测;我们只能在人的胃吸出物中检测到极低浓度的阿莫西林(在正常胃中低于2毫克/升)。奥美拉唑通过减少胃分泌量来增强阿莫西林的抗菌作用，从而有效地提高药物浓度。17奥美拉唑还能提高阿莫西林的稳定性和易感性H幽门这种抗生素。21由于胃抽吸样品被富含阿莫西林的胆汁污染，以及难以检测低浓度的阿莫西林，阿莫西林在人体内的胃运输研究存在问题。我们能够证明，在大鼠胃中阿莫西林转移率非常低，与在人类中看到的一致。由于在大鼠模型中排除了胆汁，我们可以得出结论，尽管阿莫西林具有亲水性，但它可以穿透胃上皮。
在五胱甘肽刺激的胃酸分泌过程中，胃克拉霉素清除率和转移率明显降低了四倍。与血浆相比，奥美拉唑给药的净结果是克拉霉素在胃吸液中集中。在人吞噬细胞中，大环内酯在酸性溶酶体中以质子化形式集中，在细胞胞浆中也有少量聚集。22因此，就像甲硝唑观察到的那样，克拉霉素应该集中在胃粘膜酸分泌器中。对这一差异的解释是，发现只有在给药大鼠的胃吸液中才有生物活性的脱ladinos -克拉霉素(克拉霉素的酸分解产物)。在较高的pH值下，克拉霉素稳定性的提高超过了奥美拉唑治疗期间胃转移率的降低(图4)⇑，手稿在准备中)。
大鼠胃粘膜幽门螺旋杆菌定植稀疏，引起相对轻微的急性炎症。H幽门在人类体内存在多年，而在大鼠中感染只有两个月，所以胃萎缩和对胃酸分泌的影响可能还没有时间发展。也许并不令人惊讶的是，在奥美拉唑给药期间，胃粘液厚度或腔内pH值没有差异;即使在慢性感染的人，粘液的厚度没有明显的影响，除了老年人。23
胃克拉霉素清除率明显增加H幽门感染大鼠与对照组比较。对这种增加的一种解释可能是，克拉霉素被多形核白细胞积极吸收，这些多形核白细胞充当药物到炎症组织的潜在运载剂，因为当细胞外克拉霉素被移除时，克拉霉素迅速从培养的白细胞中丢失。22克拉霉素是三种抗生素中蛋白质结合度最高的，有趣的是H幽门提取物引起大鼠胃粘膜微循环白蛋白渗漏。24
相比之下,H幽门感染、碘乙酰胺胃炎与更严重的组织学改变相关。血管扩张，粘液变稀，未见H幽门．老鼠减少了食物和液体的摄入，体重减轻了。这些复杂的可能相互矛盾的效应表明碘乙酰胺不是一个有用的模型H幽门胃炎。碘乙酰胺没有引起胃抗生素清除率的任何显著变化。胃克拉霉素转移分数降低，可能是碘乙酰胺剂量大鼠低体重的人工产物。
在临床研究中pronase的明显好处可能是由于破坏正常的生境H幽门增加了对抗生素的敏感性，25或者通过影响抗生素的转移。我们的研究表明后一种机制是重要的。Pronase引起胃黏液层的明显降解和上皮细胞破坏的明显迹象。胃分泌量明显增加，可能是诱导大量保护性粘液分泌所致。虽然我们没有测量来自受损粘膜表面的血液污染，但这可能导致了胃中阿莫西林水平的升高，因为血浆中阿莫西林的浓度高于胃吸出液。这可能部分解释了吸入性克拉霉素水平的降低，因为克拉霉素通常集中在胃液中，可能被含有较低浓度克拉霉素的血浆稀释。实验过程中阿莫西林转移率的逐渐升高表明阿莫西林通过细胞旁途径通过粘膜，这是由于紧密连接中断，或者黏液是阿莫西林转移的一个重要障碍，在实验过程中逐渐被消化掉。在pronase实验中，胃克拉霉素转移率逐渐降低，这强烈表明黏液不是胃克拉霉素分泌的显著障碍，而是一个需要健康上皮细胞的活跃过程已被pronase逐渐降解。抗生素溶粘剂的安全性和有效性值得在未来的人体临床试验中进行研究。
致谢
作者非常感谢克里斯特·塞德伯格、迈克尔·Wrangstadt和阿斯利康公司同事的支持和鼓励。该研究由Astra研究基金资助。我们还要感谢Andrew Goddard, Darren Fowkes, Dave Reffin, Ian Jansen, Robert Logan, James Bebb, Jo Whetstone, Joanne Bower和Gill Turner对这项工作的技术支持。