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摘要
背景:微绒毛包涵病(MID)是新生儿和婴儿期的一种临床症状为难治性腹泻的疾病。本病的典型病理特征已为人所熟知，但其病理生理机制尚不清楚。
目的:这项研究的目的是确定MID肠细胞内细胞骨架和胞外和内吞途径的可能改变。
病人:对4例MID患者进行了研究。3名患者有先天性腹泻，1名患者有迟发性腹泻。
方法:病人小肠活检的冷冻薄切片用抗细胞骨架抗体和刷缘酶蔗糖酶-异戊二醛酶标记。用免疫金颗粒在电子显微镜下观察一抗的结合位点。活组织切片在器官培养中进行标记，以分析肠细胞内的生物合成和内吞途径。
结果:抗肌动蛋白和绒毛蛋白抗体的标记在对照组和患者活检中没有显著差异。生物合成标记显示刷缘酶蔗糖酶-异戊二醛酶在胞内正常加工和转运。隐窝上皮细胞的分泌颗粒为蔗糖酶异戊二醛酶阳性，不同患者的标记密度不同。患者活检显示微绒毛包涵体，在摄取后5分钟内内吞阳离子铁蛋白，并在孵育10分钟后内吞卵白蛋白。这些微绒毛包涵体与早期核内体相对应，因为它们缺乏溶酶体相关的膜蛋白。晚期的核内体和溶酶体含有蔗糖酶异构体酶没有显示微绒毛样结构。
结论:MID中的微绒毛包涵体来源于肠细胞顶端膜的自噬作用，并吞噬微绒毛。
- 微绒毛包涵体
- 自吞作用
- 早期核内体
- 微绒毛包涵性疾病
- 是的,sucrase-isomaltase
- LAMP:溶酶体相关膜蛋白
- 卵,卵清蛋白
- 不是,周期性acid-Schiff
- 微绒毛包涵体
来自Altmetric.com的统计
微绒毛包涵病(MID)是婴儿难治性腹泻综合征中的一种疾病。1该病的主要病理特征为绒毛萎缩和光镜下肠细胞顶端细胞质内周期性酸性席夫阳性物质积累。1，2电子显微镜标准是病理特征，主要包括隐窝上皮细胞中分泌颗粒数量的增加和在绒毛肠细胞中最常见的微绒毛包涵体(MIBs)的存在。3.4患者的预后仍然很差，肠外营养和肠移植是唯一的治疗选择。1，2，5只有了解了MID的发病机制，才能开发出更有效的治疗方法。
自从Davidson在1978年描述了这种疾病以来，分子缺陷和病理生理学仍然不清楚。1一种候选基因的奠基人效应被归因于纳瓦霍人。6认为MID是生物合成途径的一种缺陷。7，8分泌颗粒数量的增加以及隐窝上皮细胞顶端胞浆内PAS阳性物质的异常积累表明颗粒从高尔基复合体到顶端膜的正常运输受到阻碍。因为酸性磷酸酶没有定位于MIBs，而且它们的膜似乎是微绒毛的膜，这些身体的自噬性质被撤消了。1进一步提出，细胞骨架成分如肌动蛋白、肌凝蛋白和长春素参与了MID的发病机制。9 -，11
本研究的目的是阐明MID的病理概念，应用功能分析方法分析肠细胞的胞内通路，以及定量方法确定MID肠细胞微绒毛内绒毛和肌动蛋白的密度。利用MID患者的十二指肠活检，我们进行了免疫电镜研究和器官培养代谢标记，以分析该疾病肠细胞内的生物合成和内吞转运途径。
方法
病人
研究了4例MID患者(表1)⇓)．其中两例(病例1和2)是近亲父母的兄妹。3名患者先天性腹泻，1名患者迟发性腹泻。所有患者都患有难治性腹泻，需要完全肠外营养。
在每个儿童中，通过近端小肠粘膜活检标本的光镜和电镜诊断，显示特征:肠细胞病理PAS染色，微绒毛萎缩，绒毛肠细胞中MIBs，隐窝上皮细胞顶端区大量颗粒。
十二指肠活检的准备
两例新鲜的十二指肠活检组织与卵清蛋白(OVA，分数V;Sigma, St Louis, Missouri, USA)和阳离子铁蛋白(Sigma)在室温下5、10和20分钟，然后准备进行免疫电子显微镜和常规电子显微镜。将OVA溶解在0.15 M无菌生理盐水中，浓度为100 mg/ml (360 mosmol/kg)。用浓度为0.5 mg/ml的阳离子铁蛋白与磷酸盐缓冲盐水稀释。样品在孵育期间在37°C摇动。常规电镜下，活检组织固定于3%戊二醛0.1 mol/l碳酸钠缓冲液(pH 7.2)中，室温下60分钟，在OsO中固定4，在分级乙醇溶液中脱水，并嵌入Epon 812。
抗体
本研究使用的一抗如下:抗人肌动蛋白小鼠单克隆抗体(稀释1:100;解释水平理论9001;加拿大安大略省Cedarlane)、兔抗人绒毛蛋白多克隆抗体(稀释1:30)、小鼠和兔抗蔗糖酶异构体酶(SI)单克隆抗体(稀释1:50和1:1.000)、小鼠抗溶酶体相关膜蛋白1 (LAMP-1)单克隆抗体(稀释1:30;pharingen, Hamburg, Germany)和抗OVA小鼠单克隆抗体(稀释1:10;σ)。
使用金偶联山羊血清对抗兔和小鼠IgG(直径分别为6和12纳米的金颗粒偶联，稀释倍数分别为1:10和1:50;Dianova,德国汉堡)。
免疫电子显微镜冷冻切片的免疫标记
所有患者的十二指肠活检组织在50 mmol/l HEPES的5%多聚甲醛固定和聚乙烯吡罗烷酮/蔗糖冷冻保护后，冷冻于液氮中。使用Tokuyasu技术对超薄冷冻切片(50 nm)进行切片和标记，如前所述。12，13小组织标本在−110°C下用FCS (Leica, Bensheim, Germany)进行切片。解冻切片与抗体在室温下孵育45分钟。用免疫金标记后，将栅格与乙酸铀酰进行对比，并嵌入2%的甲基纤维素。使用飞利浦400电子显微镜(德国卡塞尔)进行检查。
肌动蛋白和绒毛蛋白标记密度的定量评价
通过计算每个切片微绒毛面积的金颗粒数量来评估肠细胞内肌动蛋白和绒毛的定量。每个患者的随机电子显微镜照片从肠细胞的顶端，放大25000倍。每μm金颗粒的相对数量2如别处所述，用点计数法确定微绒毛的区域标记。12，14统计分析使用学生的t测试。
生物合成的标签
从一个病人的活检标本培养和标记如上所述。15三个小块的活组织切片被标记在器官培养中35S蛋氨酸30分钟，4小时，18小时。用针对刷缘蛋白SI的单克隆抗体免疫沉淀标记样品的Triton X-100洗涤剂提取物。最后用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析免疫沉淀，用或不用内糖苷酶H处理。
结果
MID肠细胞中肌动蛋白和绒毛蛋白的超微结构定位
用抗绒毛蛋白和抗肌动蛋白抗体标记薄冰冻切片显示，在对照和病变活检的单个肠细胞的微绒毛中，金颗粒的数量不同(图1)⇓)．肌动蛋白的结合位点也在肠细胞的末端网和基底外侧膜中被检测到。根据肠细胞在隐窝-绒毛轴上的位置，肌动蛋白和绒毛蛋白的染色无差异。
对照组(A, C)和患者(B, D)的小肠活组织切片，用抗绒毛蛋白抗体(A, B)和肌动蛋白抗体(C, D)标记。通过定性方法，患者和对照组样本的微绒毛标记密度没有差异。酒吧= 0.1μm。
肌动蛋白和绒毛蛋白标记的定量显示患者活检与对照组活检之间无显著差异。微绒毛内肌动蛋白抗体标记密度为35.4-49.8个金颗粒/μm2在3例患者的活检中，金颗粒/μm的含量为38.523例对照活检(表2⇓)．微绒毛内的绒毛标记密度为33.6(患者2号)和19.8(患者4号)金颗粒/μm2相比之下，在患者活检中为44.7粒/μm24例对照活检(表3⇓)．学生的t患者对照试验显示肌动蛋白标记t=0.7，绒毛蛋白标记t=0.8。
MID肠细胞内吞途径
抗SI和LAMP抗体的双标记实验表明，MIBs对SI呈阳性反应(图2A⇓)但LAMP阴性(图2B⇓)．绒毛肠细胞呈SI阳性液泡，液泡形态不同。在根尖膜上观察到具有复杂内部结构的液泡体，包括单个或组SI阳性刷状边缘微绒毛，LAMP抗体无法标记(图3A)⇓)．此外，腔内含有SI阳性微绒毛样突出物但无LAMP标记的细胞与SI弱染色且外膜上有许多LAMP分子的细胞在外观上存在差异(图3B)⇓)．此外，一些液泡LAMP强阳性，但仅显示弱SI染色(图3C)⇓)．这些不同的结构同时出现在单个绒毛肠细胞中，其顶端表面出现少量明显缩短和无序的微绒毛(图3D)⇓)．
来自微绒毛包涵性疾病患者的薄冰冻肠活检切片。活检组织与卵清蛋白(OVA)孵育10分钟后进行免疫电镜检查。(A)该部分同时用抗OVA的单克隆抗体和6 nm大免疫金颗粒以及抗蔗糖酶-异戊二醛酶(SI)的多克隆抗体和12 nm大免疫金颗粒标记。在绒毛肠细胞和细胞旁间隙的微绒毛包涵体(MIB)内可见内吞的OVA(箭头)。(B) 6纳米免疫金颗粒指示的SI抗体和12纳米免疫金颗粒指示的溶酶体相关膜蛋白(LAMP)抗体的双重标记显示绒毛上皮细胞中的MIBs对LAMP呈阴性。插图显示了来自MIB的微绒毛的放大细节，通过6纳米的大金颗粒(箭头)可视化SI结合位点。LAMP阳性细胞器位于MIB旁边(图右侧);箭头表示LAMP结合位点的12纳米大金颗粒。提单,基底膜。
小肠活检薄切片上蔗糖酶-异构体酶(SI)和溶酶体相关膜蛋白(LAMP)的超微结构定位SI的结合位点由6纳米的大金颗粒指示，LAMP的结合位点由12纳米的大金颗粒指示。(A)靠近根尖膜的微绒毛包涵体(MIB)(见(D)概述)含有SI抗体标记的微绒毛(6纳米大金颗粒);MIB中没有明显的LAMP标记。(B)位于顶端下方的中间核内体(见(D)概述)在微绒毛状突起上含有SI(6纳米大金颗粒，箭头)和少量LAMP分子(12纳米大金颗粒，箭头)。(C)中间核内体(B)和自噬溶酶体中的晚期核内体显示了许多LAMP分子(12纳米的大金颗粒)，但只有少数SI结合位点(6纳米的大金颗粒)，没有任何可检测到的微绒毛。(D)绒毛肠细胞概述;插图显示(A)、(B)和(C)的位置。顶端膜仅显示少量缩短的微绒毛。即早期内体;勒,晚期内体; M, mitochondrium; bars=0.1 μm.
患者活检显示绒毛肠细胞刷状边界向内吞噬(图4A)⇓)，其微绒毛被一层薄薄的胞质链所覆盖(图4C⇓)．活检后与阳离子铁蛋白孵育5分钟并嵌入Epon，发现铁蛋白定位于微绒毛膜(图4B)⇓)和MIBs内靠近肠细胞顶端膜的囊泡膜(图4C, D⇓)．与OVA一起孵育10分钟的标本显示含有抗si抗体标记的MIBs的OVA(图2A)⇑)．
微绒毛包涵体病患者小肠活检Epon切片显示绒毛肠细胞顶端膜自噬。(B)和(C)所示的活检组织与阳离子铁蛋白(箭头)孵育5分钟。(A)根尖膜被肠细胞深深吞噬。箭头表示肠膜顶端和基底外侧之间的区域，星号表示相邻肠细胞的顶端区域。(B)阳离子铁蛋白似乎附着在微绒毛的膜上，微绒毛包涵体位于根尖膜附近。(C)被薄胞质链覆盖的折叠微绒毛。该结构包含两个囊泡，膜上有阳离子铁蛋白颗粒(箭头所示)。(D)阳离子铁蛋白(箭头)不仅可在微绒毛上检测到，也可在根尖膜内陷的囊泡内检测到。D细胞桥粒;陆,肠道内腔; Mi, microvilli; bars=0.1 μm.
MID肠细胞的生物合成途径
器官培养中对患者活检样本的生物合成标记显示，与对照活检样本的对应物相比，刷缘蛋白SI在细胞内处理和运输正常。这是由这些蛋白质的内do H敏感的富甘露糖前体形式的正常转化率(SIh)到内do H抗性复合物糖基化和成熟种(SIC)(图5⇓)．
微绒毛包涵体病患者肠细胞内的胞外途径。(A)在器官培养中对患者活检样本进行生物合成标记:endo H抵抗糖蛋白，对应于复杂的糖基化成熟SIc4小时后检测到。如果h是内do H敏感的富甘露糖前体形式。(B)患病小肠的冷冻薄切片，上面标有蔗糖酶-异戊二醛酶(SI)抗体和12纳米大免疫金颗粒。隐窝上皮细胞顶端区域的分泌颗粒为SI强阳性。相反，根尖膜不含SI。(C)隐窝上皮细胞，在根尖膜上有强烈的SI标记，可见6纳米大的免疫金颗粒。相反，肠细胞顶端区域的分泌颗粒没有SI染色。陆,肠道内腔;Mi,微绒毛;SG,分泌颗粒;酒吧= 0.1μm。
免疫电子显微镜优先显示患者1和患者3的少数隐窝上皮细胞含有许多SI阳性颗粒(图5)⇑)，除了大部分隐窝上皮细胞的颗粒完全阴性的SI(图5C)⇑)．有SI阳性分泌颗粒的隐窝上皮细胞(图5B)⇑)以及含有MIBs的肠细胞(图3D)⇑)在根尖膜上未见SI。所有患者的大部分肠细胞在刷缘处均显示SI的密集标记，患者活检与对照组活检在标记密度上无明显差异。其他细胞内结构，如内质网和高尔基堆，只有少数金颗粒标记。在与这种配体孵育5-10分钟(未显示)的活组织切片中，位于顶端的囊泡为阴性。
讨论
MID的电子显微镜研究显示，肠细胞中存在独特的MIBs，这在任何其他肠道疾病中都不会发生。1，2，4，16MID的另一个特征是隐窝上皮细胞顶端胞浆中电子密集的囊泡显著增加。
由于MID中有大量的分泌颗粒，肠细胞内的转运缺陷似乎是可能的。3.7，8飞利浦等已经表明在MID中肠细胞的直接和间接构成通路是完整的。16这些发现被我们的结果证实了正常的细胞内处理和运输的刷缘蛋白SI。少数隐窝上皮细胞顶端的大部分分泌颗粒被抗si抗体显著标记。这与飞利浦形成了鲜明对比等他们在根尖膜和MIBs中发现SI，但在分泌颗粒中未发现。16我们建议在我们的MID模型中(图6A)⇓)，转运颗粒将SI(和其他刷状边界蛋白)运送到根尖膜，但不同患者的运送程度不同，这很可能取决于所诱导的分泌蛋白。这一结论的依据是，与分泌颗粒SI阴性和刷缘SI阳性的(未诱导的)肠细胞相比，分泌颗粒SI阳性的(诱导的)肠细胞在根尖膜上不含SI。虽然在根尖膜中存在免疫反应性SI支持了MID中完整的生物合成途径的概念，但隐窝上皮细胞根尖区SI阳性颗粒的大量存在可能表明这些颗粒在根尖膜内融合延迟。
隐窝和绒毛微绒毛包涵病(MID)上皮细胞的胞外和内吞途径模型。(A)分泌颗粒存在于隐窝上皮细胞中，由不同强度的蔗糖酶异构体酶(SI)抗体标记。分泌颗粒不含SI的隐窝上皮细胞在根尖膜(AM)上显示SI标记。相比之下，隐窝上皮细胞微绒毛上没有SI标记，显示有SI染色的分泌颗粒。(B)带有可检测到的微绒毛包涵体(MIBs)的绒毛肠细胞的特征是少量和缩短的微绒毛。MIBs中的微绒毛被SI抗体标记，但溶酶体相关膜蛋白(LAMP)为阴性，表明其早期的内体性质。MID肠细胞的晚期核内体被LAMP阳性识别，显示少量微绒毛样投影和SI标记。溶酶体对LAMP呈强阳性，含有少量SI，没有任何微绒毛样结构。提单,基底膜。
由于在MIBs中未发现溶酶体标记物酸性磷酸酶，因此推测MIBs并非起源于根尖膜的自噬作用。1进一步的研究表明包涵体的形成是由于胞外通路的阻塞和胞浆内运输颗粒的滞留。更小的颗粒被认为会发展成MIBs或大的泡状体。7我们在器官培养条件下获得的结果表明，阳离子铁蛋白和OVA可能在5-10分钟内作为配体从MID肠细胞的顶端被内吞，然后在MIBs中定位。这表明MIBs源于吞噬刷缘膜的自噬作用。药物解聚微管诱导上皮细胞自噬和mib样结构的形成17，18和肌动蛋白10支持肠细胞的细胞骨架缺陷与MIBs的产生有关的概念。在低钙条件下的MDCK细胞中产生了被称为空泡顶端腔室的mib样结构，这种结构阻止了细胞与细胞之间的接触。19有许多关于上皮细胞形成具有细胞内腔的细胞器的报道。20.因此，许多上皮细胞中都有细胞内管腔，包括在培养条件下发展加快的癌细胞。有趣的是，在所有这些例子中都讨论了细胞骨架的功能障碍。
因为MIBs不包含lamp，而lamp存在于晚期核内体、溶酶体中，在早期核内体中存在的程度较低，21它们被认为是早期核内体，这与它们缺乏酸性磷酸酶是一致的。1早期核内体构成第一个内吞腔室，从细胞表面内化的配体通过这个腔室被回收或传递到晚期核内体和溶酶体。22在这些细胞器中出现的配体比晚期的核内体和溶酶体酸性更低，在吸收后的5分钟内。23我们最近发现，肠细胞内吞乳糖腔内OVA进入早期和晚期核内体，并在口服后5-10分钟内将这种配体运输到基底外侧膜和细胞旁间隙。13我们认为，在酸性磷酸酶和LAMP存在最强烈的细胞器晚期核内体和溶酶体的进一步进展和降解过程中，MIBs内微绒毛的形态消失。
虽然本研究揭示了MID中MIB形成的发病机制，但MID的基本分子缺陷仍不清楚。我们的定量结果并没有证实MID肠细胞中肌动蛋白和绒毛蛋白的任何结构异常，尽管应用实验方法不能排除这些蛋白的功能缺陷。然而，充足的证据表明，MID的分子缺陷定位于MID肠细胞的细胞骨架内。细胞骨架的成分，如肌动蛋白和微管蛋白，不仅参与内吞24但在分泌过程中也是如此25，26(极化的)上皮细胞。需要进一步研究确定MID细胞骨架的基本分子遗传缺陷。
总之，我们的研究结果反驳了MID肠细胞生物合成途径的缺陷。我们的数据表明，MID是一种由肠细胞顶端膜自噬增加和吞噬微绒毛形成MIBs引起的疾病。
致谢
作者感谢Cordula Westermann的出色技术支持;A Zweibaum博士(INSERM U178, Villejuif Cedex, France)，蔗糖酶-异麦芽糖酶多克隆抗体;和D Louvard博士(居里研究所，巴黎，法国)研究抗人绒毛多克隆抗体。该研究得到了德国研究基金会(ddf - zi 294/6-1)的支持。