条文本
PDF
摘要
背景和目的:本研究的目的是通过检测胰腺星状细胞、它们的肌成纤维细胞后代和胰腺导管是否参与了再生过程，系统分析人类急性胰腺炎的再生模式。
患者和方法:在1994年1月至2000年11月期间，我们获得了24个含有重要组织的尸检标本进行病理检查。福尔马林固定的组织样本进行常规处理，并对细胞角蛋白7和19、平滑肌动蛋白、desmin、Ki-67和CD68进行免疫染色。来自器官捐赠者的胰腺组织作为正常对照。
结果:在出现症状后的11 - 41天内取尸切除标本。在坏死切除样本的重要区域，出现了由松散的血管结缔组织组成的球状超细胞球，部分显示出导管样的轮廓，几乎垂直于球的外围的残余外分泌组织。在正常组织中，导管周围只有少量星状细胞和肌成纤维细胞。相反，在急性胰腺炎后的超细胞再生球中检测到大量星状细胞和肌成纤维细胞，它们都位于疏松组织内并形成致密的导管周围鞘。星形细胞/肌成纤维细胞和导管细胞增殖活性增强。
结论:胰腺星状细胞及其激活的肌成纤维细胞后代可能参与人急性坏死性胰腺炎后的再生。为了进一步强化这一再生概念，需要进行时间过程研究。
- 急性胰腺炎
- 胰腺再生
- 星状细胞
- 增殖微胆管
- SMA: α平滑肌肌动蛋白
- CK,细胞角蛋白
来自Altmetric.com的统计
急性胰腺炎包括胰腺的各种炎症病变。根据最近的一个命题，这些病变被描述为，重症急性胰腺炎，轻度急性胰腺炎，急性流体集合，胰腺坏死,急性假性囊肿．1坏死和出血作为重症急性胰腺炎的标志，其病因和发病机制已经得到了详细的研究，近年来已经建立了几种致病途径的模型。2 -，5急性胰腺炎急性发作的最终结果是一种典型的胰腺和胰腺周围组织破裂，从胰腺间质水肿和低级别多灶性坏死(轻度急性胰腺炎)到大量出血性坏死。1，6 -，8在存活的患者中，至少有一些病变通常被认为是可逆的，与慢性胰腺炎的整体进展特征相反。如果坏死组织存在，它可能会被感染或形成含有碎片的液体集合。这些急性积液可能会自行消失或发展成假性囊肿。没有具体讨论的问题是，在开始坏死和切除坏死之间的这段时间内，外分泌器官是否发生了修复和/或再生。理论上，被急性胰腺炎破坏的胰腺外分泌组织的再生需要上皮细胞群和形成基质的细胞的替换，允许丢失的上皮细胞有序地再生。
最近，在胰腺中发现了代表肝脏中各自细胞同源的星状细胞。9胰腺星状细胞已被证明在纤维化发生中发挥重要的致病作用，特别是在慢性胰腺炎纤维化发生的机制中。10相比之下，尚不清楚胰腺星状细胞是否参与人类急性坏死性胰腺炎后的重塑和再生机制。
在目前对急性坏死性胰腺炎患者的研究中，我们系统地研究了在重症胰腺炎后再生中维持胰腺组织稳态的两个关键细胞系统的作用:导管复丛和胰腺星状细胞。
患者和方法
病人
在1994年1月至2000年11月期间，我们从42例急性坏死性胰腺炎患者中取尸切除标本进行病理检查。在这些标本中，18个全是坏死组织。其余24个标本包含重要的组织结构，用于本研究。这些样本来自8名女性和16名男性患者(中位年龄59岁;28 - 71;出现症状后11天至41天的95%置信区间(CI) 50-61.3)。如前所述，术前评估坏死程度。11表1总结了相关数据⇓．来自器官捐赠者的胰腺组织作为对照。
组织学和免疫组织化学
随机选择样本固定在4%中性缓冲福尔马林和石蜡包埋。标准形态学评价基于苏木精和伊红染色切片。对于免疫组化，脱蜡切片通过分级系列乙醇再水化，并将其放入Tris缓冲盐水中。根据使用的抗体，切片进行胰蛋白酶消化(Difco, Detroit, Michigan, USA)或在10 mM柠檬酸缓冲液中，pH值为6.0，在微波炉或高压锅中进行热诱导表位提取。一抗靶向细胞角蛋白(CK)-7(克隆OV-TL 12/30;Dako Diagnostics AG, Zug，瑞士;工作浓度2 7mu;g/ml;CK-19(克隆RCK108;Dako;0.8 7μ;g / ml; trypsin), desmin (clone D33; Dako; 5 7mu;g/ml; microwave), α smooth muscle actin (SMA, clone 1A4 ; Sigma, St Louis, Missouri, USA; dilution 1:600; no pretreatment), CD68 (clone PG-M1; Dako; 2.5 7mu;g/ml; microwave), and Ki-67 (clone MIB1; Dako; 1 7mu;g/ml; pressure cooker). After the primary antibody a biotinylated goat-antimouse Ig antibody (Dako) was applied, followed by streptavidin-biotin complex/alkaline phosphatase (Dako). Sections were developed in new fuchsin-naphtol AS-BI (Sigma), counterstained with haematoxylin, and mounted. For double immunohistochemistry, stainings for the respective antibodies employed an avidin-biotin complex/horseradish peroxidase system (Vector, Burlingame, California, USA) and 3,3-diaminobenzidine as chromogen, and a streptavidin-biotin complex/alkaline phosphatase system as outlined above, respectively. For immunohistochemistry, positive control sections were processed simultaneously. For estimation of the proliferation index (in per cent; labelled nuclei/all nuclei counted×100) of stellate cells and ductule cells, in acute pancreatitis and in normal controls, Ki-67/SMA and Ki-67/CK-7 double immunostains were used. In these preparation, five areas were randomly chosen, and in each area 300 nucleated cells of interest were counted and analysed for the presence of labelled nuclei.
统计数据
前瞻性收集所有临床数据，并在个人电脑上输入统计软件包程序(SPSS统计软件，芝加哥，伊利诺伊州，美国)。数据分析采用Fisher精确检验或适当的Mann Whitney U检验。
结果
正常胰腺组织:定性分析
对照组组织结构正常。CK-19在大导管和小导管的上皮细胞中反应明显，而在导管中反应较少，而CK-7在导管和导管上皮细胞中均检测到显著阳性。SMA在血管肌细胞中强表达，作为内部对照。SMA反应性梭形细胞和星状细胞分布在胰管周围，少量分布在胰管周围，主要分布在胰管与腺泡的出口。在靠近导管的腺泡细胞周围观察到的细胞较少。导管和小管周围有少量desmin阳性星形和梭形细胞(数据未显示)。
急性胰腺炎:定性分析
对临床症状出现后不同时间点获得的尸切除样本的分析显示，一些(见下文)含有保存的球形组织结构。这些血管化结构与坏死组织明显区分开来(图1A⇓)，被解释为代表再生响应，因此被称为再生球。其组织学特征如图1-3所示⇓⇓⇓．
(A)超细胞再生球的边界。注意病灶的明显分区。在与完全坏死区域(左下角)直接接触的地方，有一层薄薄的富含纤维蛋白的渗出物(区域1:箭头)，将重要的再生球与周围的坏死区截然分开，其次是富含白细胞浸润的低血管区(区域2:小箭头)。更深入的内部，可见高度血管的肉芽组织，逐渐成熟(第3区:大箭头)(苏木精和伊红染色，×120)。(B)超细胞再生球的第三区。在肉芽组织区域内可见一个小的导管状轮廓(图中央)。注意，这个结构被梭形细胞的外膜所包围(苏木精和伊红染色，×200)。(C)超细胞再生球的外围部分;坏死界面显示在左上角。小导管散布在疏松和富含基质的组织中。 The peripheral most part of such a ductule is seen in the form of small epithelial cell cluster (red) whereas more centrally placed parts exhibit more mature cells (cytokeratin 7 (CK-7) immunostain, ×80). (D) In a larger regenerative sphere, a cytokeratin positive ductule takes its origin from a residual pancreatic lobule, sprouting from here to the periphery of the hypercellular regenerative sphere forming long and ordered structures (CK-7 immunostain, ×80).
(A)小管的增殖活性。两个导管的上皮为红色(细胞角蛋白7 (CK-7))，而增殖细胞的细胞核为棕色(Ki-67)。注意导管轮廓中有标记的细胞核。在小管周围的结缔组织中也可见增殖细胞(CK-7/Ki-67双免疫染色，×400)。(B)星形细胞/肌成纤维细胞的增殖活性。表达α平滑肌肌动蛋白(SMA)的星形细胞为红色，增殖细胞(Ki-67)的细胞核为棕色。一些星形细胞含有标记的细胞核，表明增殖(SMA/Ki-67双免疫染色，×400)
(A)超细胞再生球的松散再生组织包含几个desmin反应细胞，代表胰腺星状细胞的细长形式(desmin免疫染色，×400)。(B)再生球的1区和2区。一些α平滑肌肌动蛋白(SMA)反应性肌成纤维细胞在坏死界面呈爆裂状。未成熟血管后可见肌成纤维细胞(SMA免疫染色，×120)。(C)位于再生球周围区的SMA反应性肌成纤维细胞呈现细胞质突出，部分呈星形形态(SMA免疫染色，×400)。(D)先导小管的末端(外周)段(红色)以上皮细胞簇的形式呈现。注意肌成纤维细胞(棕色)与导管细胞密切接触(CK-7和SMA双免疫染色，×400)。(E)先导导管(细胞角蛋白7 (CK-7)免疫染色;红色)。可检测到导管周围的包膜状梭形细胞鞘，被血管拱廊包围(×200)。 (F) Proximal and therefore more mature segments of pilot ductules are encircled by a compact sheath of myofibroblasts The centre shows a pilot ductule with irregular arrangement of epithelial cells. The spindle cells forming the now compact periductular sheath are markedly positive for SMA, these cells representing myofibroblasts (double immunostain: CK-7, red; SMA, brown) ×400).
在常规染色切片中，小管已经出现(图1B⇑)有时几乎到达再生球的边缘。一些再生球体包含一个或几个动脉分支，明显供给血管通道，形成周围肉芽组织的毛细血管网络。
免疫组化染色证实了小管的存在和明确的方向。在CK-7和CK-19制剂中，这些剖面的免疫表型和结构明显对应于不同分化阶段的胰腺导管，并可能形成前进导管剖面的尖端(图1C, D⇑)．由于导管的生长和动脉分支一起决定了再生球的整体生长模式和布局，我们将这些结构称为先导导管。在先导导管周围，梭形细胞排列更为紧密。基于双重免疫染色(CK-7/Ki-67和SMA/Ki-67)，小管和星状细胞中可见增殖活性(图2A，图B)⇑)．
综上所述，从小叶残体到再生球周边生长的先导导管与激活的胰腺星状细胞群密切相关，形成独特的导管周围鞘，其成熟梯度反映了这些结构发展的时间顺序。
急性胰腺炎:定量分析
为了定量分析组织学和免疫组化结果，在所有样本中分别评估了以下特征:超细胞再生球;再生球的分带;再生球中存在供血动脉;CK-7和CK-19活性小管的存在;再生球中心和外围小管密度;desmin反应性胰腺星状细胞的存在;存在排列松散的SMA反应性肌成纤维细胞;导管周围有厚的肌成纤维细胞鞘。
在研究中检查的24例尸切开术标本中都观察到再生球。在24例急性胰腺炎的组织学分析中，18例(75%)显示一条或多条喂养动脉。在100%的再生球中，形成含有肉芽组织的小管梯度的特征性分区。在12/24(50%)再生球中检测到不同成熟度的CK-7和CK-19反应性小管，在8/12(66.6%)再生球中观察到典型的先导小管从再生球中心延伸到周围。在100%的再生球中，胰腺星状细胞和肌成纤维细胞数量明显增加，在21/24(88%)的样本中，它们都位于再生球的中心和外周位置。在9/12个样品中(75%)可见SMA反应细胞的导管厚而有序的导管中心鞘引导导管。
对于显示先导小管的样本，出现这种结构的最早时间点是症状开始后的17天，时间周期从11天到41天不等。
对于星状细胞/肌成纤维细胞，平均Ki-67增殖指数为22.2%(范围8-35%;正常对照组0.26%，范围0-0.6%)。小管细胞增殖活性增加，主要分布在再生球周边和小管顶端区域(平均增殖指数3.6%，范围1.9-5.8%;正常对照0.13%，范围0-0.4%)。
病因、性别、C反应蛋白值、APACHE II评分和胰腺星状细胞活化程度之间无相关性。
讨论
在这项研究中，我们已经表明，人类急性坏死性胰腺炎后的再生以一种独特的、高度有序的方式进化，似乎与引起急性疾病的胰腺损伤类型无关。再生过程包括胰腺星状细胞、其分化的肌成纤维细胞后代和来自残小叶的胰腺导管，这表明星状细胞/肌成纤维细胞和先导导管是一个结构和功能单元并行生长。
最近的证据表明，胰腺星状细胞是胰腺纤维形成和重塑的关键细胞类型，但其在急性胰腺炎中的作用尚未明确。最初是在1982年，在老鼠体内观察到储存在胰腺中的维生素A细胞12但8年后，这些细胞首次在人类胰腺中被发现。13这种细胞系统在胰腺纤维形成中的潜在作用是通过从人类胰腺中分离出的肌成纤维细胞样细胞而发现的，14已经证明，胰腺中储存维生素A的细胞实际上可以在原代培养中分化为产生细胞外基质蛋白的肌成纤维细胞。15类似于大鼠门静脉周围，但不是中心周围的肝星状细胞，16胰腺星状细胞可表达desmin，而来自这些细胞的肌成纤维细胞通常对SMA反应。17，18与肝脏中大多数但不是所有的星状细胞位于腺窦周围间隙(所谓的滨侧隔室)不同，胰腺中的星状细胞似乎主要位于腺泡周围位置。14他们对这一组织空间的偏好是有趣的，因为已有研究表明，肝星状细胞也位于肝门静脉的小管附近，从而形成一个高峡外或窦外腔室。19
已经证实，胰腺星状细胞，类似于它们的肝脏对应体，在纤维化中发挥致病作用。20.在慢性酒精性胰腺炎中，星状细胞积极合成胶原蛋白似乎与脂质过氧化衍生的醛协同定位，21暴露于乙醇或乙醛导致培养的大鼠胰腺星状细胞的细胞激活。22胰星状细胞活化的机制包括转化生长因子β，部分来源于活化的巨噬细胞，20.23白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α，诱导白细胞介素8、单核细胞趋化蛋白1和RANTES的分泌，24以及血小板衍生的生长因子。25
特别有趣的是，胰腺星状细胞及其激活的后代在再生球内以非随机的方式发育和生长。一方面，细胞的进化速度与再生组织的生长速度相同，形成高度定向的结构。另一方面，它们与增殖的导管一起形成独特的复合结构或单元，形成肌成纤维导管周围鞘。这些上皮间充质芽很可能是从残存小叶中原有的结构中招募来的，并逐渐延伸到正在生长的再生球导管中，从而充当先导元件。急性胰腺炎后的导管反应，称为管状复合物，先前在实验模型中观察到，26这些复合物来源于胰腺炎开始后4-7天内增殖的改变的腺泡细胞。此外，已有研究表明胰蛋白酶诱导的坏死性出血性胰腺炎后的胰腺修复涉及完整腺泡和管状复合体的细胞增殖。27
这些发现表明，胰腺星状细胞可能不仅参与纤维形成，而且参与组织重构。因此，它们模仿了它们的肝脏类似物，最近的研究表明，大鼠肝脏中的肌成纤维细胞反映了肝脏重塑的程度，而不是肝硬化，因为肌成纤维细胞体积分数相反地反映了肝细胞体积的双态性。28提示导管复合体和星形细胞在组织重塑中起着起搏器的作用。
在目前的研究中观察到的现象的运作机制尚不清楚。
总之，本研究结果表明，胰腺星状细胞及其激活的肌成纤维细胞后代可能参与急性坏死性胰腺炎后的再生。为了进一步强化这一再生概念，需要进行时间过程研究。