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菜单条gydF4y2Ba
癌症gydF4y2Ba
循环突变体的前瞻性研究gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba结直肠肿瘤患者的血清中:术后随访的强预后指标gydF4y2Ba
免费的gydF4y2Ba
  1. B M瑞安gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  2. F LefortgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  3. R麦克马纳斯gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  4. J戴利gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  5. P W N基林gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  6. D G堰gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  7. D凯莱赫gydF4y2Ba1gydF4y2Ba
  1. 1gydF4y2Ba爱尔兰都柏林圣詹姆斯医院临床医学系gydF4y2Ba
  2. 2gydF4y2Ba爱尔兰都柏林圣詹姆斯医院分子医学系gydF4y2Ba
  3. 3.gydF4y2Ba生物技术等实验室Génétique Appliquée，瑞士吕利埃大学'Ingénieurs HES de Lullier, 1254 JussygydF4y2Ba
  1. 通信:gydF4y2Ba
    B·瑞安博士，荷兰马斯特里赫特大学医院消化内科，邮政信箱5800，邮编6202AZ;gydF4y2Ba
    bbryan在{}planet.nlgydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

背景和目的:gydF4y2Ba在结直肠癌患者的血清中检测到突变的肿瘤衍生DNA。我们研究了突变血清gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba在一大批结直肠肿瘤患者术前均可检测到。一项前瞻性研究对94例接受假定的治愈性大肠癌切除术(CRC)的患者进行了研究，以确定血清是否突变gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba可作为术后疾病标记物。gydF4y2Ba

方法:gydF4y2Ba分析78例患者的术前血清(A组)，94例患者的术后血清(B组)，3个月采集一次，持续3年gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba在匹配的肿瘤和血清样本中分析突变。gydF4y2Ba

结果:gydF4y2Ba术前组(A组)gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba在41/78(53%)肿瘤和32/78(41%)术前血清中发现突变。41岁的肿瘤gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阳性病例中，31/41(76%)检测到相同的血清突变。B组为术后随访组，原发性肿瘤60/94例gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阳性。在这60人中，16/60(27%)成为持续性血清突变gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba积极的术后。16例患者中有10例(63%)复发，而血清突变阴性的患者中只有1/44例(2%)复发(优势比71.7(95%可信区间7.7-663.9;p = 0.0000)。34例肿瘤突变阴性病例均无血清突变gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba尽管9/34例患者复发，但术后呈阳性。术后血清突变体疾病复发的相对危险gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba阳性患者为6.37例(2.26-18.0;p = 0.000)。gydF4y2Ba

结论:gydF4y2Ba血清变异gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba在结直肠肿瘤的所有阶段均可在术前检测到。术后,血清变异gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba是疾病复发的一个强有力的预测指标，甚至比Dukes的疾病分期更强，因此显示出在临床实践中作为临床前疾病复发的一个标记的潜力。gydF4y2Ba

  • DNAgydF4y2Ba
  • KRAS2gydF4y2Ba
  • KRAS2gydF4y2Ba突变gydF4y2Ba
  • 预后gydF4y2Ba
  • 结直肠癌gydF4y2Ba
  • CRC,结直肠癌gydF4y2Ba
  • 流域的开发,tubulovillous腺瘤gydF4y2Ba
  • 东航,癌胚抗原gydF4y2Ba
  • 或者,优势比gydF4y2Ba
  • 聚合酶链式反应gydF4y2Ba

http://dx.doi.org/10.1136/gut.52.1.101gydF4y2Ba

来自Altmetric.com的统计gydF4y2Ba

    请求的权限gydF4y2Ba

    如果您希望重用这篇文章的任何部分或全部，请使用下面的链接，它将带您访问版权清除中心的RightsLink服务。您将能够快速获得价格和以多种不同方式重用内容的即时许可。gydF4y2Ba

    结直肠癌(CRC)是美国和欧洲每年诊断出的最常见的胃肠道癌症。gydF4y2Ba1gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba基因突变在结直肠腺瘤向癌发展的早期出现，超过50%的人类CRCs和腺瘤港湾gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变。gydF4y2Ba2，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba内的突变gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba基因最常出现在密码子12和13的1号和2号位置。gydF4y2Ba3 -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba

    使用免疫组化或逆转录聚合酶链式反应(PCR)的分子分期策略显示，大约30-40%的II期/Dukes’B病患者局部淋巴结存在隐性微转移。gydF4y2Ba7 -gydF4y2Ba10gydF4y2Ba使用类似的策略，在各种胃肠道恶性肿瘤患者的骨髓中也发现了微转移。gydF4y2Ba11，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba因此，越来越明显的是，标准分期方法低估了许多结直肠癌患者的分期，而使用分子技术可以在很大比例的所谓早期疾病患者中检测到微转移性疾病。gydF4y2Ba

    肿瘤衍生的突变DNA已在各种体液中检测到。各种基因的突变，包括gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba，gydF4y2Bap53gydF4y2Ba,gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba等，已在结直肠癌患者的粪便样本中检测到。gydF4y2Ba13 -gydF4y2Ba16gydF4y2Ba突变体gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba已经在胰腺癌患者的胰液中提取的DNA中检测到，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba从膀胱癌患者的尿液标本中，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba还有肺癌患者的痰。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba

    肿瘤来源的循环突变DNA也可以在癌症患者的血浆或血清中检测到，肿瘤来源的RNA也是如此。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba21gydF4y2Ba在正常健康对照组中，循环的野生型DNA水平较低。gydF4y2Ba22日,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba在小细胞肺癌患者的血浆或血清中发现了循环DNA的突变体，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba头颈癌，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba透明细胞肾癌，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba胰腺癌,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba乳腺癌,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba肝细胞癌,gydF4y2Ba29gydF4y2Ba非小细胞肺癌，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba和CRC。gydF4y2Ba31日,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba在几乎所有可以获得肿瘤组织的情况下，血浆中的突变与在原发肿瘤中检测到的突变相同，这表明循环的突变DNA是肿瘤起源。安加gydF4y2Ba等gydF4y2Ba报道称,突变体gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba86% (6/7) CRC患者的血浆中检测到gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba原发CRC中存在突变。gydF4y2Ba33gydF4y2Ba迄今为止，研究CRC患者循环突变DNA的研究只包括了相对较少的患者，只检查了术前血清或血浆样本，没有包括许多早期疾病患者。gydF4y2Ba

    本研究是为了研究是否突变gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba在一大批早期(发育异常腺瘤)到晚期(Dukes’D)结直肠癌患者的术前血清中均可检测到。此外，对近100例接受了假定的治愈性切除的CRC患者进行了前瞻性的术后随访研究，以调查是否有突变循环gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba是否可以在术后检测到，如果可以，是否具有预后意义，有可能作为疾病标记物和疾病复发的预测器。gydF4y2Ba

    材料和方法gydF4y2Ba

    病人gydF4y2Ba

    伦理批准来自我们机构的伦理委员会，所有患者在参与研究前都给予了书面的知情同意。本研究共纳入123例经组织学诊断为结直肠肿瘤(范围从严重发育不良的管状绒毛腺瘤(TVA)到Dukes’D结直肠癌)的患者。在1997年1月至1998年3月期间，所有被诊断为可能治愈的结直肠肿瘤的连续患者(包括非内镜摘除的TVA患者)都被纳入研究。95例患者中有78例同意参与，在首次诊断疾病时被招募到A组，所有病例都获得了术前血液样本。B组94例，其中A组49例，自术后随访。另外45名(60名随机接触的患者)在过去四年里在我们的机构被诊断为可治愈的结直肠癌，他们都仍然参加了常规监测，同意参加这项研究。B组所有患者均接受了假定的治愈性切除术。A组78例患者中有29例因以下原因之一未进入研究的术后随访部分:撤回进一步参与的同意书(n=9);术后死亡(n = 2);术中发现无法治愈切除(n=5); or logistic reasons (n=13). Group B patients were followed for up to three years from the time of entry into until completion of the study (January 1997 to January 2000). Table 1 shows the clinical and demographic details of the patients in both groups.

    把这个表:gydF4y2Ba
    表1gydF4y2Ba

    患者和对照组的特征gydF4y2Ba

    术后采血方案包括术后一周和一个月的样本，随后三个月的样本，直到研究期结束。B组患者在手术后一段时间进入研究，从进入研究到研究完成，每三个月抽血一次。无失访患者。在研究期间，所有患者都进行了标准的疾病随访，包括常规的血液生化、每年的结肠镜检查、癌胚抗原(CEA)测定、每年的腹部超声或计算机断层扫描和每年的胸部检查gydF4y2BaxgydF4y2Ba射线。对于tva患者，随访不太严格，包括术后1年和3年的结肠镜检查。gydF4y2Ba

    血清来自20名健康对照者，包括为筛查目的或调查下消化道症状而进行正常结肠镜检查的个体。gydF4y2Ba

    从血清和肿瘤样本中提取DNAgydF4y2Ba

    将血液(10毫升)抽入血清管(Becton-Dickinson SSAT管)，并立即置于冰上。样品在处理的所有阶段都被保存在冰上。两小时内，血液以1500度离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置30分钟。取下血清，在- 20°C保存，待进一步使用。患者使用血清1ml，对照组使用血清2ml。Qiagen mini-kit血液DNA提取试剂盒用于提取血清DNA。对标准方案进行了修改，包括添加poly-A DNA载体(Promega, Southampton, UK)，以促进DNA在Qiagen柱上的更好吸附。最终体积为65 μl洗脱DNA。对照用5 μl血清DNA进行β-actin PCR，以确定DNA的扩增量。gydF4y2Ba

    用标准技术从石蜡组织中提取DNA。gydF4y2Ba34gydF4y2Ba对所有肿瘤源性DNA进行对照β-actin PCR，以确保提取DNA的完整性。gydF4y2Ba

    KRAS2gydF4y2Ba密码子12突变分析gydF4y2Ba

    使用之前描述的半嵌套突变富集技术组合分析密码子12的突变gydF4y2Ba33gydF4y2Ba和直接测序。所使用的引物是Anker和同事所描述的引物。gydF4y2Ba33gydF4y2Ba上游引物(p4)被修改以创建一个gydF4y2BaBstNgydF4y2Ba1 (New England Biolabs, Beverly, USA)限制位点存在野生型而不存在突变型gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba密码子12。进行了15个PCR循环。25 μl反应量为血清DNA 3 μl或肿瘤DNA 1 μl，浓度为15 mM MggydF4y2Ba++gydF4y2Ba引物p4和p5各0.9 pmol, 0.08 μlgydF4y2BaTaqgydF4y2BaDNA聚合酶(Promega)和dNTP各2 mM混合。PCR产物(3 μl)按20单位消化12小时gydF4y2BaBstNgydF4y2Ba1.限制性消化产物(3 μl)在50 μl的反应中重新扩增35个循环。第二次PCR反应的反应条件为引物p4和p6 6 pmol, 1.5 mM MggydF4y2Ba++gydF4y2Ba， 0.1 μlgydF4y2BaTaqgydF4y2BaDNA聚合酶，最终得到135个碱基对的PCR产物。两种PCR反应均采用热启动，循环条件分别为94°C×4 min、80°C×5 min、15或35个循环(94°C×30 seconds、55°C×60 seconds、72°C×50 seconds)，然后是72°C×4 min。在所有反应中，包括两个无模板对照(无菌水)、一个野生型DNA对照(健康对照全血DNA)和一个突变阳性对照(来自SW 480细胞系的DNA)。gydF4y2Ba

    最后的PCR产物在2%的琼脂糖凝胶上“清洗”;取135碱基对条带，用Qiaquick凝胶提取试剂盒纯化和提取DNA，最终体积为40 μl洗脱。直接测序15 μl纯化的PCR产物使用gydF4y2Ba33gydF4y2BaP-USB热测序试剂盒(USB, Cleveland, Ohio, USA)。所用的测序引物(pQ)与Anker和同事使用的相同gydF4y2Ba33gydF4y2Ba并对非编码DNA链进行测序。测序产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，在70 W的温度下电泳2小时。凝胶被晒干，暴露gydF4y2BaxgydF4y2BaRay胶片24小时，然后冲洗。gydF4y2Ba

    KRAS2gydF4y2Ba密码子13突变分析gydF4y2Ba

    一种类似的突变富集技术来检测在密码子13的突变gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba基因设计。设计了上游引物p13 (5 ' - TATAAACTTGTGGTAGTTGGCCCTGGT-3 ')gydF4y2BaBglgydF4y2Ba1 (New England Biolabs)限制位点存在野生型而不是突变序列。进行了18个循环的起始PCR。25 μl反应条件为:肿瘤DNA 1 μl或血清DNA 3 μl, 2.5 mM MggydF4y2Ba++gydF4y2Ba引物p13和p6各4 pmol, 0.08 μlgydF4y2BaTaqgydF4y2BaDNA聚合酶(Promega)和2.0 μl的2 mM各dNTP。将PCR产物(10 μl)在37℃下消化1小时gydF4y2BaBglgydF4y2Ba1.用引物p13和p6各6 pmol, 2.5 mM Mg重扩增限制性消化物混合物(5 μl) 35个循环gydF4y2Ba++gydF4y2BadNTP为2.5 μl的2mm, 0.1 μlgydF4y2BaTaqgydF4y2Ba聚合酶。第一和第二PCR反应的热启动条件优化为:94°C×2分钟，80°C×5分钟，20或35个循环(94°C×30秒，54°C×60秒，72°C×60秒)，然后在72°C×4分钟扩展。最后的125碱基对PCR产物被纯化和测序使用相同的方法描述的测序gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba密码子的12个产品。在所有的实验中包括以下对照:两个无模板对照(无菌水)，两个突变阳性对照(DNA提取自hct-116结直肠癌细胞系，其中含有杂合子gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba密码子13天冬氨酸突变)和1个野生型DNA对照。gydF4y2Ba

    首先对肿瘤DNA和血清DNA样本进行盲分析，寻找密码子12的突变，这是最常见的突变。肿瘤和血清样品分别处理，以避免交叉污染的可能性。然后对密码子12突变阴性的肿瘤DNA和血清DNA样本进行密码子13突变的盲法分析。对20名健康对照者的血清样本进行分析gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba密码子12和13突变。gydF4y2Ba

    统计数据gydF4y2Ba

    使用Windows的SPSS统计软件包对结果进行分析。χgydF4y2Ba2gydF4y2Ba分析、描述性统计、McNemar χgydF4y2Ba2gydF4y2Ba采用相关样本检验和Fisher精确度检验。趋势分析用χgydF4y2Ba2gydF4y2Ba分析。以95%置信区间(CI)计算比值比(OR)作为风险估计值。生存分析采用Kaplan-Meier无病生存分析和log秩统计。采用Cox回归多因素分析评估Dukes期CRC的独立预后对生存的影响，术前血清突变gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba阳性，术后血清突变gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba阳性，化疗辅助治疗。gydF4y2Ba

    结果gydF4y2Ba

    A组:术前各组结果(n=78)gydF4y2Ba

    野生型gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba在所有结直肠肿瘤病例(n=78)和对照组(n=20)的肿瘤和血清样本中发现了序列。gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba在41/78(53%)的肿瘤样本和32/78(41%)的血清样本中发现了密码子12或13的突变(表2)gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阳性病例中，31/41(76%)的血清中存在相同的突变(表2)gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba1/37(3%)肿瘤阳性gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阴性病例共32/78(41%)术前血清突变阳性病例(表2)。gydF4y2Ba

    把这个表:gydF4y2Ba
    表2gydF4y2Ba

    肿瘤和血清gydF4y2BaKRAS2gydF4y2BaA组和对照组突变和癌胚抗原(CEA)状态的变化gydF4y2Ba

    CRC分期与突变发生率无显著相关性gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba血清中。然而，这是混淆的事实，不同比例的患者在每个阶段的疾病是肿瘤gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阳性(表2)。然而，在肿瘤患者中gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阳性(n=41)，血清突变患病率无显著增加gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba随着疾病分期的进展呈阳性(p=0.308, Fisher确切检验)(表2)。图1A显示了一些有代表性的测序结果。gydF4y2Ba

    图1gydF4y2Ba

    k-的第1外显子第12和13号密码子侧翼区域测序的代表性结果gydF4y2Ba拉gydF4y2Ba基因。突变条带用箭头表示。部分(A):(A) Dukes’B病例P1的肿瘤DNA，密码子12半胱氨酸突变。(B)病例P1的术前血清，显示相同的密码子12半胱氨酸突变。(C) Dukes的C病例P2的肿瘤DNA，显示密码子13天冬氨酸突变。(D)病例P2的术前血清，突变与原发肿瘤相匹配。(E) Dukes的A病例P3的肿瘤DNA显示密码子12和13的双天门冬氨酸突变。(F)病例P3的术前血清DNA显示突变密码子12和13，与肿瘤中发现的相同。(B):(A) Dukes' C病例P4的肿瘤DNA，密码子13天冬氨酸突变。(B)病例P4的术后血清，具有相同的密码子13天冬氨酸突变。 (C) Tumour DNA from Dukes' C case P5, with a codon 13 aspartate mutation. (D) Postoperative serum DNA from case P5, with a matched aspartate mutation to that in the tumour. (E) Tumour DNA from Dukes' B case P6, with a codon 12 valine mutation. (F) Postoperative serum DNA from case P6, with a codon 12 mutation, identical to that in the tumour.

    血清突变体的敏感性gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba应用McNemar's χ对结直肠肿瘤患者的CEA检测进行比较gydF4y2Ba2gydF4y2Ba配对观察分析(表2)。当纳入所有患者时，血清患病率之间无显著差异gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba阳性和CEA水平升高在任何阶段的疾病。当41个肿瘤gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阳性病例分别进行血清突变分析gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba分析在统计学上优于CEA测量作为CRC的标记。41例患者中6例两项检测均为阴性，5/41为血清突变体gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba阴性/CEA阳性，16/41为血清突变gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba阳性/CEA阴性，14/41两项试验均阳性(p=0.027, Fisher确切检验)。gydF4y2Ba

    术前血清突变体阳性的预后价值gydF4y2BaKRAS2gydF4y2BaA组只有49/78例患者的术后随访数据可作为B组研究的一部分。Cox回归分析显示术前血清突变呈阳性gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba不是术后疾病复发的独立预后指标(相对危险度2.07,95% CI 0.3-14.8;p = 0.466)。gydF4y2Ba

    B组:术后随访结果(n=94)gydF4y2Ba

    B组94例中肿瘤60例(64%)gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阳性(表3,4)。来自B组的亚组患者(85/94)，包括Dukes’A、B或C病患者(不包括复发风险极低的6例TVA和复发风险极高的3例Dukes’D患者)，因为这些患者在复发检测方面具有更大的临床意义和相关性。本组85例患者中54例(64%)为肿瘤gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阳性(表4)。肿瘤间术后随访时间无显著差异gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阳性和突变阴性患者(表1)分别为94和85例(p=0.06和p=0.061, Mann Whitney U检验)。gydF4y2Ba

    把这个表:gydF4y2Ba
    表3gydF4y2Ba

    肿瘤gydF4y2BaKRAS2gydF4y2BaB组患者的突变状态和疾病分期gydF4y2Ba

    把这个表:gydF4y2Ba
    表4gydF4y2Ba

    术后血清变异gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba、肿瘤gydF4y2BaKRAS2gydF4y2BaB组复发gydF4y2Ba

    比较肿瘤的疾病复发率gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阳性和肿瘤gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阴性病例，当B组94例患者(p=0.354)或仅85例Dukes’A、B或C病患者(p=0.654)进行分析时，复发率无显著差异(表4)。gydF4y2Ba

    野生型gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba在所有肿瘤和血清样本中都有发现。1例患者为术后血清突变体gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba只有连续两份血清样本呈阳性(间隔三个月)才为阳性。图1B显示了其中的一些代表性gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba匹配的肿瘤和术后血清样本的测序结果。无患者术后血清突变gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba只有一次是阳性的。术后一周的血清检测结果为阴性gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba在49/49名接受测试的患者中。gydF4y2Ba

    当B组的94名患者接受检查时，在肿瘤中gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阴性组(n=34) 9/34例复发病例无血清突变gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba阳性(表4，图2)。相比之下，16/60(27%)肿瘤gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阳性患者变成持续性血清突变gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba在随访期间呈阳性，其中10/16(63%)在随访期间发生复发性疾病，而只有1/44(2%)保持血清gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阴性(表4，图2)。16例患者中有6例(37%)持续血清gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba到随访结束时，突变阳性患者未出现临床疾病复发(表6)。因此，在肿瘤内gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阳性患者(n=60)，肿瘤复发OR为71.6 (95% CI 7.7 ~ 663.9;P =0.0000)gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba与血清突变体比较阳性gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba病人。gydF4y2Ba

    图2gydF4y2Ba

    根据肿瘤和血清，所有B组患者的结果的图形表示gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变状态。这些结果以表格形式列于表4。gydF4y2Ba

    对85例Dukes' A、B或C病B组患者的单独分析得出的结果与所有94例患者的结果相似(表4)。在这个亚组中，肿瘤肿瘤复发的orgydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阳性/血清gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阳性患者与肿瘤患者比较gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阳性/血清gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阴性患者57例(95% CI 6.1-534.5;p = 0.0000)。gydF4y2Ba

    采用Cox回归分析研究术后血清突变体的独立预后价值gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba作为疾病复发的预测因子(表5)。对于该模型，仅包括85/94例Dukes’a、B或C疾病患者。术后血清突变的独立影响gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba由于Dukes’A CRC患者记录的事件数量较少，因此在Cox回归分析中，将Dukes’A和B患者放在一起分析，并与Dukes’C CRC患者进行比较。阳性血清变异gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba相对危险度为6.37 (95% CI 2.3-18.0;p=0.000)， Dukes分期增加的相对危险度为3.1 (95% CI 0.96-9.9;p=0.056)，辅助化疗的相对危险度为0.47 (95% CI 0.12-1.8;P =0.278)用于疾病复发。图3显示了两种肿瘤突变体的Kaplan Meier无病生存曲线gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba阳性和阴性患者(n=85)和肿瘤患者gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba分别为突变阳性患者(n=54)。gydF4y2Ba

    把这个表:gydF4y2Ba
    表5gydF4y2Ba

    影响疾病复发风险因素的Cox回归分析gydF4y2Ba

    图3gydF4y2Ba

    Kaplan Meier无病生存曲线根据血清突变体gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba,肿瘤突变gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba、疾病分期。生存分析只包括Dukes’A、B或C病患者，因为包括管状绒毛腺瘤或Dukes’D患者可能会对结果产生偏差，因为分别有低和高的复发率。下面的符号(+)和(−)表示gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变状态。(A)在n=85名患者中，肿瘤(+)和(-)患者，血清(+)患者生存率明显较差(p=0.0000)。(B)肿瘤(+)患者(n=54)，血清(+)患者生存率明显较差(p=0.0000)。(C)对n=54例肿瘤(+)患者按疾病分期分层，血清(+)患者在各疾病分期的预后明显较差(早期疾病p=0.0000，晚期疾病p=0.007)。血清(+)和早期或晚期疾病患者与血清(-)和早期或晚期疾病患者无病生存曲线相似。gydF4y2Ba

    包括所有94名患者，不考虑肿瘤gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba现状，术后血清突变体检测gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba对疾病复发的敏感性为52.6%，特异性为92%，阳性预测值为62.5%。对于60岁的肿瘤gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阳性患者，术后血清突变检测gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba对疾病复发的敏感性为91%，特异性为88%，对疾病复发的阳性预测值为62.5%。gydF4y2Ba

    血清变异gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba阳性与标准模式疾病监测作为疾病复发标志物进行了比较(表5)。7 / 10(70%)患者为血清突变体gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba阳性和复发者为血清突变体gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba在使用标准模式检测到疾病复发前为阳性。在首次检测阳性血清突变体时，10例患者中有3例伴CEA升高gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba(表6)。中位“领先时间”为4个月，在使用标准监测方法诊断前从0到16个月不等。gydF4y2Ba

    把这个表:gydF4y2Ba
    表6gydF4y2Ba

    术后血清突变K-的复发部位和时间gydF4y2Ba拉gydF4y2Ba积极的病人gydF4y2Ba

    讨论gydF4y2Ba

    我们已经证明了那个变种人gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba在32/78(41%)结直肠肿瘤患者的术前血清中可检测到，证实了几项小型研究的结果。gydF4y2Ba31日,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba这是对结直肠肿瘤患者术前循环突变DNA进行调查的最大的系列。除了一种血清gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变与原发肿瘤中检测到的相同，表明血清突变DNA是肿瘤起源。在这一差异病例中，石蜡包埋肿瘤标本的采样误差可能是未能检测到肿瘤内突变的原因。gydF4y2Ba

    术前，检测突变循环gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba在本研究中对结直肠肿瘤100%特异。结直肠肿瘤的阳性预测值为100%，但敏感性相对较低，为41%。限制血清突变体敏感性的主要因素gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba检测的是患病率gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba原发肿瘤内的突变:只有41/78(53%)的结直肠肿瘤有gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba原发肿瘤中有31/41(76%)的肿瘤发生突变gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阳性病例在血液循环中检测到相同的突变。这些结果表明循环血清突变gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba是肿瘤存在的标志，但仅当肿瘤中有肿瘤时gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变。gydF4y2Ba

    循环变异gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba在本研究中，即使在TVA(需要手术切除的大型TVA)患者中也可检测到:4/9(44%)的TVA，或4/7(57%)的TVAgydF4y2BaKRAS2gydF4y2Batva突变阳性，有检测到的循环突变gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba．这与最近一项研究的结果一致，该研究证明了突变血清gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba但与我们目前的研究相比，之前的研究没有在所有病例中匹配肿瘤和血清样本。gydF4y2Ba35gydF4y2Ba

    在结肠腺瘤患者中检测突变的循环DNA具有重要意义，原因有二。首先，它为恶性肿瘤患者循环DNA的机制提供了洞察。有人提出，突变DNA可能通过从循环的转移性肿瘤细胞或从原位病变直接释放进入癌症患者的循环。gydF4y2Ba36gydF4y2Ba由于癌前病变没有转移的潜力，血清突变gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba在这些病例中发现的必须从原位病变中释放出来。其次，通过血清检测发现结直肠癌前肿瘤的能力对筛查具有意义。目前，该方法用于筛查的一个主要限制因素是灵敏度低，但通过分析CRC中常见突变的多个基因可以大大提高灵敏度，如gydF4y2BaAPCgydF4y2Ba而且gydF4y2Bap53gydF4y2Ba．事实上，在粪便样本中检测多种结肠癌特异性DNA变化，已被证明比仅使用一种标记物时提高了癌症检测的灵敏度。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba因此，联合方法可为高达100%的结直肠肿瘤提供血清可检测的体细胞遗传标记。gydF4y2Ba

    这是第一个前瞻性调查CRC患者原发肿瘤切除后循环突变DNA的自然史的研究。我们的结果表明术后血清突变体的存在，这一结果具有显著的潜在临床意义gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba强烈预测CRC患者的疾病复发。事实上，在多变量分析中，术后血清突变阳性gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba是CRC复发的最强预测因子，甚至强于Dukes分期或辅助化疗治疗的影响。这与几项针对小细胞肺癌患者的小型研究结果一致，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba非霍奇金淋巴瘤,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba和胰腺癌,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba治疗后血清中突变DNA的持续或再次出现预示预后不良。与术前结果一样，限制血清突变体表现的主要因素gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba作为CRC复发的标志是有无agydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba原发肿瘤发生突变。这与之前报道的发现一致gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba恶性克隆的状态在其整个自然史中是稳定的。gydF4y2Ba40gydF4y2Ba

    所有在研究后期(不是术后立即)进入研究的阳性患者，在第一次检测时检测呈阳性，因此可能在此之前一段时间已呈阳性。然而，不可能准确记录他们变成阳性的时间。术后一周的血清样本(n=49)均未检测到突变gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba．尽管这些患者中的一些人后来成为血清突变体gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba在随访期间呈阳性，表明即使在术后一周，他们仍然存在隐藏的肿瘤。这说明了两件事:首先，血清中循环的肿瘤DNA的半衰期不到一周，这并不奇怪，因为血浆中含有大量的DNA酶，这些DNA酶可能会持续降解血浆中存在的DNA，因此血浆中DNA的存在代表着从身体细胞释放和被DNA酶降解之间的平衡。其次，这一发现还表明，在足够的突变DNA被释放到循环系统中之前，必须存在一个临界质量的肿瘤，从而使其能够被当前研究中使用的方法检测到。提高了灵敏度，使检测微量循环突变体成为可能gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba可能会通过使用更现代的技术，如DNA微芯片来促进。gydF4y2Ba

    一例术后血清突变患者(表6中M39)gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba阳性随后出现局部复发，并进行了第二次根治性切除;随后的血清突变体gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba试验是负面的。这表明血清突变DNA分析可以检测出临床可治疗的复发性疾病，而不仅仅是在早期识别出无法治疗的转移性疾病。此外，我们确定了6名血清突变患者gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba未出现临床疾病复发的术后阳性患者。这些患者很可能有隐性疾病复发，因此密切的随访是必要的。对这一发现的其他解释也有可能。他们可能有结肠息肉，但在结肠镜检查中没有发现，而结肠息肉中有同样的息肉gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变作为原发性切除肿瘤。已经证明突变血清gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba即使是小的结肠息肉也能检测到。gydF4y2Ba35gydF4y2Ba其次，在结肠肿瘤患者的组织学正常结肠黏膜中发现了分子场效应的改变gydF4y2Ba41gydF4y2Ba这可能会将突变DNA释放到血液循环中。最后，在这些患者中，一个或多个可能存在另一个部位的同步肿瘤。然而，事实是，在所有病例的术后血清gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变与原发肿瘤中的相同，表明血清突变DNA来自与原发肿瘤相同的克隆细胞。对这些患者和其他患者的进一步研究和随访将有助于阐明这一问题。gydF4y2Ba

    在本研究中，肿瘤中的疾病复发率gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阴性患者(26%)与肿瘤患者无显著差异(p=0.354)gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阳性患者(18%)。然而，肿瘤的随访时间gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变组时间略短于肿瘤组gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba突变阳性组。这种随访时间的差异可能掩盖了两组间复发率的显著差异。gydF4y2Ba

    我们的研究结果是新颖的。我们已经证明，在大部分结直肠肿瘤患者，包括那些恶性病变前的患者中，可以在术前检测到血清突变DNA。此外，当循环突变gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba似乎只有在患有gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba在原发肿瘤的突变中，通过分析多重突变和使用DNA芯片技术可以大大提高敏感性。gydF4y2Ba42gydF4y2Ba值得注意的是，我们首次发现术后血清突变gydF4y2BaKRAS2gydF4y2Ba检测是疾病复发的一个非常重要的预测因子，甚至比Dukes的分期更强。作为一种疾病标志物，术后血清突变DNA检测在结直肠癌等癌症的随访管理中具有很大的潜力。特别是，术后突变DNA检测可能有助于识别早期隐匿性疾病复发的患者，这些患者可能受益于早期化疗干预。gydF4y2Ba

    致谢gydF4y2Ba

    这项工作得到了慈善组织PPP医疗保健信托基金(PPP Healthcare Medical Trust)对Barbara Ryan的资助。罗斯·麦克马纳斯是惠康研究员，杰奎琳·戴利得到了爱尔兰健康研究委员会的资助。这项工作在2000年圣地亚哥和2001年亚特兰大的消化疾病周上以抽象形式提出。gydF4y2Ba

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      王我gydF4y2Ba，罗勇，张杰，gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba肝癌患者血浆和血清中异常p16甲基化的检测。gydF4y2Ba癌症ResgydF4y2Ba1999gydF4y2Ba；gydF4y2Ba59gydF4y2Ba：gydF4y2Ba71gydF4y2Ba3所示。gydF4y2Ba
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      Esteller米gydF4y2Ba， Snachez-Cespedes M, Rosell R，gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba非小细胞肺癌患者血清DNA肿瘤抑制基因异常启动子高甲基化的检测。gydF4y2Ba癌症ResgydF4y2Ba1999gydF4y2Ba；gydF4y2Ba59gydF4y2Ba：gydF4y2Ba67gydF4y2Ba-70年。gydF4y2Ba
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      Kopreski米gydF4y2Ba，本可F, Kwee C，gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba结直肠癌患者血浆和血清中K-ras基因突变的检测。gydF4y2BaBr J癌症gydF4y2Ba1997gydF4y2Ba；gydF4y2Ba76gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1293gydF4y2Ba9。gydF4y2Ba
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    32. deKok JgydF4y2Ba，范·索林奇W，鲁尔斯T，gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba结直肠癌患者血清肿瘤DNA的检测。gydF4y2BaScand J clinin实验室投资gydF4y2Ba1997gydF4y2Ba；gydF4y2Ba57gydF4y2Ba：gydF4y2Ba601gydF4y2Ba4所示。gydF4y2Ba
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      安加PgydF4y2Ba莱福特F，瓦西乌辛五世，gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba从结直肠癌患者血浆中提取的DNA中发现了K-ras突变。gydF4y2Ba胃肠病学gydF4y2Ba1997gydF4y2Ba；gydF4y2Ba112gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1114gydF4y2Ba-20年。gydF4y2Ba
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      冈萨雷斯RgydF4y2Ba，席尔瓦JM，桑切斯A，gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba小细胞肺癌患者血浆DNA中的微卫星改变和TP53突变:随访研究和预后意义。gydF4y2Ba安杂志gydF4y2Ba2000gydF4y2Ba；gydF4y2Ba11gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1097gydF4y2Ba-104年。gydF4y2Ba
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      Frickhofen NgydF4y2Ba穆勒E，桑德赫尔M，gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba在b细胞瘤患者的无细胞血样中检测到重排列的Ig重链DNA。gydF4y2Ba血gydF4y2Ba1997gydF4y2Ba；gydF4y2Ba90gydF4y2Ba：gydF4y2Ba4953gydF4y2Ba-60年。gydF4y2Ba
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      山田TgydF4y2Ba，中森S，大户H，gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba胰腺癌患者血浆DNA中K-ras基因突变的检测:与临床病理特征的相关性gydF4y2Ba中国癌症ResgydF4y2Ba1998gydF4y2Ba；gydF4y2Ba4gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1527gydF4y2Ba-32年。gydF4y2Ba
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      Losi LgydF4y2Ba王晓东，王晓东，王晓东。K-的稳定性gydF4y2Ba拉gydF4y2Ba基因突变贯穿人类结直肠癌的自然史。gydF4y2Ba欧元J癌症gydF4y2Ba1992gydF4y2Ba；gydF4y2Ba28gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1115gydF4y2Ba-20年。gydF4y2Ba
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      朱DgydF4y2BaKeohavong P, Finkelstein S，gydF4y2Baet al。gydF4y2BaK-ras突变阳性结直肠癌患者正常结直肠组织中K-ras基因突变gydF4y2Ba癌症ResgydF4y2Ba1997gydF4y2Ba；gydF4y2Ba57gydF4y2Ba：gydF4y2Ba2485gydF4y2Ba-92年。gydF4y2Ba
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      Fodor年代gydF4y2Ba， Rava R，黄X，gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba用生物芯片进行多重生化分析。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba1993gydF4y2Ba；gydF4y2Ba364gydF4y2Ba：gydF4y2Ba555gydF4y2Ba6。gydF4y2Ba
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