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背景:突变的意义的乙型肝炎病毒(HBV) precore /核心抗原造成持续感染和随后的肝脏疾病是值得商榷的。
目的:调查儿童乙肝病毒核心基因序列变化与慢性乙型肝炎病毒感染和肝细胞癌(HCC)的影响。
方法:30一个慢性乙肝病毒感染儿童记录乙型肝炎e抗原血清转化选择从415年长期载体和12 HBV相关肝细胞癌孩子进行了研究。四连环前后血清样本乙型肝炎e抗原血清转化的31个孩子,和一个12肝细胞癌的儿童的血清样本进行乙肝病毒核心基因序列分析。
结果:突变累积的慢性感染持续和最常发生在核心基因密码子21岁(29%)、密码子147(29%)、密码子65 (16%),precore终止密码子28(74%),31慢性HBV感染孩子。网站核心基因突变在HCC孩子们识别核心密码子74年,87年和159年。肝癌的孩子有更多的核心基因的突变比慢性乙型肝炎病毒感染(p = 0.013)。
结论:积累的突变肝细胞癌儿童的乙肝病毒核心区域不同于那些在慢性乙型肝炎病毒感染孩子。这可能是一个线索儿科肝癌的发病机制。
- 乙型肝炎病毒
- 肝细胞癌
- 乙型肝炎e抗原
- 乙型肝炎核心抗原
- 乙肝病毒,乙肝病毒
- 肝癌,肝细胞癌
- e抗原、乙型肝炎e抗原
- 表面抗原、乙型肝炎表面抗原
- HBcAg、乙型肝炎核心抗原
- 细胞毒性T淋巴细胞,细胞毒性T淋巴细胞
- PCR,聚合酶链反应
- ALT,丙氨酸转氨酶
来自Altmetric.com的统计
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- 表面抗原、乙型肝炎表面抗原
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- 细胞毒性T淋巴细胞,细胞毒性T淋巴细胞
- PCR,聚合酶链反应
- ALT,丙氨酸转氨酶
的几个热点地区乙型肝炎病毒(HBV)核苷酸序列是容易突变,可能由于各种外在压力。1例如,precore G一个终止密码子突变在核苷酸位置检测到1896在重型肝炎,急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。2 -8我们有解决这种突变的时间变化在慢性乙型肝炎病毒感染孩子。9因为乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的目标是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导HBV感染的肝细胞溶解,10 -12它也容易变异。核心基因的突变可能会改变核心蛋白的构象,并允许乙肝病毒逃避免疫监视通过损失或改变immunodominant抗原表位。或者,他们可以持续致命的毒株,从而诱导宿主免疫攻击,导致严重的肝脏疾病。
乙型肝炎病毒核心基因突变的先前的研究显示,核心基因是高度保守的慢性乙型肝炎病毒感染的免疫耐受阶段。13 -15因为患者通过免疫耐受阶段,越来越多的核心基因突变被发现,在什么地方富含B和T细胞抗原表位。
所有这些研究乙肝病毒核心基因变异进行了在成人患者。绝大多数地区的慢性乙肝病毒感染的省级行政区呈高度流行)等台湾在围产期或儿童早期开始。16在这项研究中,415年进行纵向跟踪孩子理解核心基因的时间剖面变化前后的乙型肝炎病毒感染乙型肝炎e抗原(e抗原)血清转化。与此同时,我们比较了乙肝病毒核心基因的核苷酸序列12儿童HBV相关肝细胞癌与慢性乙型肝炎病毒感染的儿童。肝癌是最严重的后果对成人和儿童慢性乙型肝炎病毒感染。17以前在台湾成人肝细胞癌的研究表明,有3 - 6不同的错义突变积累核心基因可能与严重的肝损伤。18我们认为这将是有趣的识别核心基因突变在童年肝癌。此外,如果我们能找到任何儿童肝细胞癌和慢性乙型肝炎病毒感染之间的差异,这些突变可能提供线索的发展儿童肝癌。
对象和方法
儿童慢性乙型肝炎病毒感染
总共有415慢性乙肝病毒载体的孩子在我们门诊随访。在这些415名儿童中,169人已经经历了e抗原血清转化。我们随机选择31个孩子(男:女比17:14;意味着(SD)入学年龄7.9(3.5)年,其中男童)从上述169受试者完成的标准为≥2年随访前e抗原血清转化,e抗原血清转化后≥2年。因此我们能够观测到至少四年的核心基因变异。随访时间平均7.1(标准差2.7)岁(范围4 - 13.1)为这些31个孩子。他们的意思是(SD)入学年龄为7.5(3.9)年(范围16年生)。平均年龄在e抗原血清转化为10.9(4.3)年。四个血清样本的每个31日孩子们研究了序列核苷酸乙肝病毒核心基因的变化。四个血清样本:(1)最早可以在招生进入跟踪研究,3.0(2.0)前几年e抗原血清转化; (2) immediately before (<6 months) HBeAg seroconversion; (3) immediately after (<6 months) seroconversion; and (4) the latest serum sample available which was 4.0 (2.0) years after HBeAg seroconversion. All 31 children were asymptomatic clinically.
儿童肝细胞癌
十二个孩子(男:女比9:3;平均年龄9.6(2.8)年,范围4.5 - -13.2)在组织学证实肝细胞进行了研究。他们年龄匹配的慢性乙型肝炎病毒感染组。都是血清反应阳性的e抗原抗体和乙肝表面抗原(HBsAg)。都有一个HBsAg(+)的母亲。确诊时血清样本收集。三个手术切除肿瘤后长期存活。其他9例死亡。排除了肝硬化手术结果和组织学检查在三个。与肝硬化,其他9例肿瘤成像研究或组织学研究结果证明了这一点。 Duration after HBeAg seroconversion was not known for all of these cases as they presented with a liver tumour and were not recruited into the long term follow up study.
乙型肝炎病毒核心基因的核苷酸序列分析
从20μl血清HBV DNA提取,如前所述。2聚合酶链反应(PCR)进行放大precore并从提取血清HBV DNA的核心基因。外部引物的PCR反应混合物包括(意义:5′-ATAAG, AGGAC, TCTTG, GACTC-3′核苷酸位置1654 - 1673,和反义:5′-AAAGA, CAGGT, ACAGT, AGAAG-3′核苷酸位置2503 - 2522,位置根据EcoRI限制网站数量)、核苷酸2.5毫米,Taq 2.5 U, PCR缓冲总量的20μl。十分之一的第一个PCR产品受到使用内嵌套PCR引物(意义:5′-TCCAA, GCTGT, GCCTT, GGGTG-3′核苷酸位置1871 - 1890,和反义:5′-GAAGA, ATAAA, GCCCA, GTAAA-3′核苷酸位置,2487 - 2506年)。预期的嵌套PCR产品尺寸是639 bp和PCR条件和法定程序前面描述的。19嵌套PCR的灵敏度是10−5pg的HBV DNA。嵌套PCR产品然后进行直接测序的自动循环测序分析器(ABI棱镜,染料标记结束符和循环测序反应设备;珀金埃尔默,美国加州福斯特城)。为了防止点突变由PCR的文物,测序反应是在两个方向上进行的。所有测试都是重复的确认结果。
比较的核苷酸序列
计算乙肝病毒核心基因的突变率与慢性感染孩子,我们带的核苷酸差异最早的血清样品和最新的血清样本用于每种情况下,除以跟进年和测序precore /核心基因长度。例如,如果核苷酸差异6 bp,随访6年,和PCR测序产品尺寸是639个基点,突变率会6/6/639 bp = 7.8×10−4核苷酸/网站/年。比较密码子突变在儿童慢性乙型肝炎病毒感染和肝细胞癌之间,确切概率法使用耶茨的校正。一个p值< 0.05被认为是显著的。
结果
核心基因变异和precore终止密码子
在跟踪期间,意味着(SD)的核心基因突变率31儿童(1.5 (1.0))×10−3/网站/年。28 Precore终止密码子是最常见的突变热点。九个孩子有野生型precore密码子28整个e抗原血清转化过程。另一个九个孩子在e抗原血清转化野生型和突变体血清转化后出现。在剩下的13个孩子停止密码出现之前e抗原血清转化。核心基因密码子21岁,65年和147年的热点突变(表1)。比较突变的频率,我们发现,只有28 precore密码子有第一和第四血清样本统计上显著的差异(p = 0.0006)而不是其他三个密码子耶茨(确切概率法的修正)。以下零星的突变检测在一个场合:密码子5,13日,14日,19日,20日,35岁,54岁,55岁,79,80,97,101,103,135,143,163,180,182。
22个孩子中有一个precore终止密码子突变,28日12共存的核心基因突变:六个密码子21突变,两个密码子65突变,6 147密码子突变(2例双密码子的突变21日和65年)。的存在precore终止密码子28没有与上述三种常见的出现核心基因突变。为九个孩子没有precore终止密码子突变,六个核心基因突变:三个密码子21突变,四个65密码子突变,和一个147密码子突变(双密码子的突变21 + 65或65 + 147在一个案例中)。没有区别的出现在密码子突变21和密码子147,无论precore停止密码子的存在(p = 0.74和0.33,确切概率法)。
核心基因变异和ALT的变化
我们把precore密码子的突变28和密码子21,65年和147年为索引,将孩子们分成两组基于这些突变的存在与否。峰丙氨酸转氨酶(ALT)水平在e抗原血清转化这两组之间的比较。那些没有核心基因密码子21突变有更高的峰值ALT水平比那些突变(p = 0.035)(表2)。e抗原血清转化后,28岁儿童正常的ALT浓度三个ALT水平升高。ALT水平是59 - 68 IU / l(正常< 35 IU / l)发生,5和7年后e抗原血清转化。没有具体的核心基因突变体都集中在这三个孩子。
核心在肝细胞癌基因变异
ALT浓度峰值的12儿童肝癌是114 (125)IU / l(平均(SD))(范围21 - 392)。突变被发现主要在precore密码子28和核心基因密码子65年,74年,87年,143年、159年和182年(表3)。核心基因密码子21岁,147年只有一个突变被认为肝癌。这些发现明显不同于那些慢性乙型肝炎病毒感染的孩子除了precore密码子28和核心基因密码子65突变在两组是很常见的。
我们的核心基因序列HBV基因型B,这是最常见的在台湾,20.作为标准来比较慢性乙型肝炎病毒感染和肝细胞癌的核心基因的孩子。意味着同义突变点这12个HCC儿童(4.9 (3.6))×10−3/核苷酸位置同时意味着同义突变点在过去的血清样本的31个慢性HBV感染的孩子们(2.0 (0.8))×10−3/核苷酸位置(p = 0.013)。
讨论
这个长期跟进儿科研究提供了额外的数据precore /核心基因突变的意义,尤其是在与HCC的孩子。在文献中很少有相关的数据报告。
28 Precore密码子是最常见的突变。这被认为是一种致命的病毒因素造成肝损伤。21然而,这个突变可能不会考虑增加毒性,核心地区和额外的突变被认为是必要的。2,9日,22我们的研究表明,峰值ALT水平,这可能反映肝损伤的程度,没有不同的团体,没有28 precore密码子突变在慢性乙型肝炎病毒感染的孩子(表2)。
核心基因密码子21岁,65年和147年这三个常见变异与慢性乙肝病毒感染在儿童网站。都位于HBcAg细胞毒性t淋巴细胞抗原表位,23即基码18-27,2450 - 69,2574 - 83,26和141 - 151。27因此可以想象这三个网站是最首选的CTL的目标。
与先前的报道相反,14日,15核心基因突变的数量并没有显著增加e抗原血清转化后在我们的病人。原因可能与不同的研究群体的年龄有关。受试者在前面的报告都是成年人,也许已经经历了e抗原血清转化更长的时间比我们的病人。最新的血清样本撤出大约四年后e抗原血清转化。这样的时间可能不够长积累突变在成年人一样的程度。另一方面,这一发现是一致的在慢性乙型肝炎病毒感染儿童的一项研究表明,核心基因突变e抗原血清转化后并没有显著增加。28
肝细胞癌被认为是最严重的慢性乙型肝炎病毒感染的结局。这项研究显示,儿童肝癌有更多的核心基因的点突变。有两种可能的解释这一现象。(1)随着时间的推移,宿主的免疫系统有更多的机会尝试清除病毒,因此更多的突变病毒物种似乎逃避宿主的免疫系统。在这些HCC的孩子,更多的核心基因突变反应了一定的事实,他们已经经历了更多的host-viral免疫交互。(2)一些核心基因突变是致命的、可能与肝癌的发展。密码子74、87和159个突变被发现在肝细胞癌的孩子而不是在慢性感染同行学习。在这项研究中,儿童慢性航母战斗群和肝癌组相对年龄匹配(平均(SD) 7.9(3.5)年v9.6(2.8)年)和前组随访7.1(2.7)年。的四个血清样本随访期间获得了在肝细胞癌,与同龄的孩子。两组有一个平等的机会体验host-viral免疫相互作用,但不同的结果。以前的报告描述了集群的突变序列参与病毒衣壳化,复制和免疫抗原表位(密码子55 - 63、96 - 108和151 - 155年)在成人肝细胞癌组织。29日细野豪志等使用台湾成年人的肝癌样本,发现核心抗原变异成人肝细胞癌位于域恰逢HLA二类限制T细胞抗原表位。18这些突变可以修改核心蛋白的抗原性以及病毒复制和能够参与建立慢性病毒感染。74年和87年的核心基因密码子突变在童年肝癌的主要抗原区域核心基因30.该地区在159密码子突变启动病毒衣壳化。我们推测,幸存的变异病毒可能利用这些突变逃避宿主免疫系统,促进病毒整合,扩大病毒蛋白质,最后导致癌症的发展。31日
确认
作者感谢Ya-Ling许女士她优秀的核苷酸测序的技术援助。本研究由国家科学委员会的资助,支持台湾行政院(nsc - 85 - 2331 - b002 - 307)。