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摘要
背景:通过对腹腔疾病患者黏膜肠T细胞克隆的研究，发现了免疫原性麦胶蛋白表位。一种是HLA-DQ8受限，它被T细胞的识别通过组织转谷氨酰胺酶作用的负电荷残基的引入而增强。
目的:目的:在处理过的腹腔黏膜的HLA-DQ8阳性和HLA-DQ8阴性患者的器官培养系统中，检测HLA-DQ8限制性表位的原生(QYPSGQGSFQPSQQNPQA)和去氨基(QYPSGEGSFQPSQENPQA)形态。
患者和方法:10例腹腔疾病患者(6例HLA-DQ8阳性，4例HLA-DQ8阴性)的空肠活组织切片与麦胶蛋白的消化性胰蛋白酶消化(PT)或天然(肽a)或脱酰胺(肽B)肽进行体外培养。上皮内CD3+固有层总CD25+和CD3+CD25+计数细胞，检测固有层细胞间粘附分子1 (ICAM-1)和上皮细胞上Fas分子的表达。
结果:在HLA-DQ8阳性，而在HLA-DQ8阴性的情况下，腹腔会增加上皮内CD3的密度+细胞，固有层总CD25+和CD3+CD25+与单纯培养液培养相比，PT、肽A或肽B培养的活检组织中细胞及ICAM-1和Fas分子表达显著增加。
结论:这些数据表明，DQ8限制性麦胶蛋白肽仅在HLA-DQ8阳性腹腔患者的肠道黏膜中具有免疫原性，无论是原生型还是脱酰胺型。
- 腹腔疾病
- 醇溶蛋白肽
- HLA的限制
- 器官培养
- 粘膜免疫
- Fas
- CD,腹腔疾病
- 固有层单个核细胞
- PT, peptic-tryptic消化
- TBS，特里斯缓冲盐水
- 人民行动党,peroxidase-antiperoxidase
- 碱性磷酸酶/抗碱性磷酸酶
- PBS，磷酸盐缓冲盐水
- 细胞间粘附分子1
来自Altmetric.com的统计
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腹腔疾病(CD)是最彻底的调查和特征的许多形式的食物不耐受。它被定义为在基因易感个体中对小麦麦胶蛋白和相关的脯胺的永久性不耐受导致肠病。1结构变化，固有层单个核细胞的表型和细胞因子的模式表明Th1反应的优势。2乳糜泻的易感性在很大程度上是由遗传因素决定的;大部分的遗传易感性映射到6号染色体上的HLA区域，大约95%的乳糜泄患者携带几乎相同的HLA DQ2异二聚体(DQA1*0501 DQB1*0201)。在大多数这种单倍型阴性的个体中，这种疾病与II类等位基因DQA1*0301和DQB1*0302相关，它们编码与DR4单倍型相关的DQ8分子。3.
最近对乳糜泻黏膜肠T细胞克隆的研究，导致了一些免疫原性麦胶蛋白表位的鉴定。4 -8其中三个明显受HLA-DQ2限制;一种是HLA-DQ8受限，通过引入组织转谷氨酰胺酶作用的负电荷残基，T细胞对它的识别增强。8日,9
小肠器官培养是研究与麦胶蛋白多肽接触后腹腔黏膜免疫事件的有价值的模型;事实上，已经证明体外麦胶蛋白挑战系统再现了发生在既定腹腔病变中的粘膜免疫反应的许多特征。10有人提出，麦胶蛋白挑战可能启动两条平行的途径，其中一条导致T细胞激活，另一条先于它。上皮细胞在2小时内过表达HLA-DR分子，在第二阶段，T淋巴细胞完全激活;T淋巴细胞在粘膜上层迁移;在高级固有层间室迁移的T淋巴细胞主要是CD4+显示出激活的标记;迁移的上皮内淋巴细胞为CD8+不要表达这些标记。该器官培养系统已经被用来鉴定能够激活粘膜细胞介导免疫的麦胶蛋白表位。11
本研究的目的是测试HLA-DQ88日,9受限的麦胶蛋白表位，原生和脱酰胺形式，在器官培养系统。
材料和方法
患者与HLA分型
乳糜泻患者10例(男4例，女6例;中位年龄24岁(13-45岁))，根据修订的ESPGHAN标准诊断。他们坚持了至少两年的无谷蛋白饮食;小肠组织学正常，血清(抗麦胶蛋白和抗肌内膜抗体)阴性。
按照前面描述的方法进行分子分型。12简单地说，DNA提取是按照快速提取方法进行的。对DRB1、DQA1和DQB1基因的多态第二外显子进行扩增，并用序列特异性寡核苷酸探针对扩增的DNA进行点杂交分析。表1报道了患者的HLA分型。6例患者DQ8阳性，3例DQ2阳性。4例患者DQ2阳性，DQ8均为阴性。在这里，前六个被称为DQ8阳性，其余四个被称为DQ8阴性。
肽
麦胶蛋白的消化性胰蛋白酶消化(PT) (S Pastore品种，意大利罗马高等卫生研究院De Vincenzi博士的礼物)被用作阳性对照。肽A对应203-220残基(序列QYPSGQGSFQPSQQNPQA的gda09, SwissProt P18573)。它的脱酰胺形式(肽B)在208和216位出现谷氨酰胺转化为谷氨酸的两个残基(QYPSGEGSFQPSQENPQA)。如先前报道的那样合成多肽。9
空肠活检和体外器官培养的处理
从每位患者空肠近端取4个活检标本，所有标本立即置于0.15 mol/l氯化钠冷冻中，并在30分钟内带到实验室。每个患者的一个标本被适当定位并嵌入OCT化合物中(Tissue Tek, Miles Laboratories, Elkhart, Indiana, USA)，在异戊烷中快速冷冻，在液氮中冷却，并在- 70°C保存直到冷冻切片。其余的切片放置在不锈钢网上，置于器官培养盘(Becton Dickinson, New York, USA)中心孔之上，活检组织的粘膜表面位于最上面。文化就像之前报道的那样发生了13在培养基单独存在时，PT麦胶蛋白消化(1mg /ml)，或原生肽(肽A 1mg /ml)或脱酰胺肽(肽B 1mg /ml)。将培养皿置于无菌厌氧罐中，其中95%氧气/5%二氧化碳，37°C孵育。培养24小时后，将组织包埋在OCT复合物中，在液氮中快速冷冻，准备冷冻切片。
染色技术
低温切片(5 μm)在室温下风干，在丙酮中固定10分钟。所有切片在室温Tris缓冲生理盐水(TBS)中反复洗涤，在正常兔血清中(1:100在TBS中孵育30分钟)，然后根据过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)或碱性磷酸酶/抗碱性磷酸酶(APAAP)法染色。分别用单克隆抗体进行检测(表2)。室温孵育一小时后，切片与兔抗鼠血清孵育30分钟(Dako，米兰，意大利)，再与APAAP复合物孵育30分钟，以染色CD25阳性细胞和细胞间粘附分子1 (ICAM-1)阳性细胞，或与PAP复合物(Dako)孵育30分钟，以染色CD3和CD95 (Fas)阳性细胞。每次抗体孵育后，载玻片在TBS中洗涤10分钟，当使用PAP复合物时，最后用2氨基-9乙基咔唑(Sigma)孵育5分钟;当用APAAP复合物代替时，免疫反应产物通过与20 mg萘酚- as -二磷酸溶液在0.5 ml中连续搅拌3分钟得到N-N-二甲基甲酰胺加入0.2 ml亚硝酸钠(Sigma Chemical Company, St Louis, Missouri, USA)， 0.08 ml New Fucsin (Merck, West Point, Pennsylvania, USA)， 40 ml TBS, pH 8.7，和17.5 mg左旋咪唑(Sigma)。一抗的缺失用于控制非特异性抗体的结合。切片最后用梅尔氏苏木精染色并安装。采用同型非免疫小鼠免疫球蛋白作为一抗，以控制特异性。在实验中检测活化的T细胞(CD3+CD25+)，免疫荧光共聚焦显微镜，因为它允许更好的分辨率三种颜色程序。冷冻切片固定在丙酮中，在室温下与小鼠抗cd25人单克隆抗体(Dako, 1:25)和兔抗cd3人多克隆抗体(Dako, 1:100)的混合物孵育1小时，然后是马抗鼠FITC的混合物(1:200,Vector Laboratories, California, USA)和猪抗兔TRITC的混合物(Dako, 1:300)。这些抗体在黑暗中应用45分钟，然后与ToPro-3(荷兰莱顿分子探针)孵育(30分钟)，以反染细胞核。最后，切片置于磷酸盐缓冲盐水(PBS):甘油(1:1)中。将一、二抗体适当稀释于含1%牛血清白蛋白的PBS中，所有孵育均在室温下进行，中间PBS冲洗10分钟。
CD3+和CD25+免疫荧光细胞在Leica SP共聚焦显微镜(德国)使用40× Plan-Neofluar油浸泡物镜成像。光源由3个单激光器组成:氩离子488 nm、氦离子543 nm和氦离子633 nm。
的形态学分析
通过计数染色细胞的数量，以100个肠细胞为百分比，确定上皮内隔室中表达CD3的细胞密度;CD25固有层单个核细胞(LPMNC)的数量在总面积1 mm内进行评估2在显微镜下，用校准的眼对准平行于肌层粘膜的显微镜观察固有层。固有层CD3+CD25+按CD3总数的百分比计数+细胞;至少500个CD3+对每个样本中的细胞进行评估。用抗cd95和抗icam -1对上皮细胞和LPMNC的染色强度进行评估，并按任意尺度分级:弱染色(+)=1，中等染色(++)=2，强染色(+++)=3。计数由两名观察员以盲法独立分析。
统计分析
学生的两条尾巴t试验用于比较暴露于麦胶蛋白或合成肽的标本与单独暴露于相同孵育时间的培养基的标本。非参数检验(Wilcoxon双尾检验)的结果与参数检验的结果一致。
结果
HLA-DQ8限制性肽挑战对T细胞活化的影响
对hla dq8+和hla dq8−腹腔病人，在空肠活组织切片培养存在的PT消化麦胶蛋白，细胞数/毫米2表达白细胞介素2受体(CD25细胞)(平均(SD)分别为121(40)和113(15))的细胞显著(p<0.001)高于单独培养的细胞(分别为28(6)和26(8))(图1)。然而，仅在HLA-DQ8中+腹腔数量为CD25+在含有天然肽(139(22))或去氨基肽(124(21))的培养基中培养的细胞明显高于单独培养的细胞(p<0.001)。事实上，在HLA-DQ8中没有发现显著差异−用天然肽(37(2))或去氨基肽(38(10))培养的活检标本与仅在培养基(26(8))培养的标本(图1)之间进行比较。在进一步的实验中，我们检查了CD3的增加+CD25+细胞;事实上，都是HLA-DQ8+和hla dq8−体外挑战麦胶蛋白PT消化的腹腔患者激活的T细胞显著增加(p<0.01);然而,只有hla dq8+腹腔患者CD3明显升高(p<0.05)+CD25+细胞对原生肽或脱氨基肽的反应(表3，图2)。
HLA-DQ8空肠活检标本固有层CD25单个核细胞+和hla dq8−腹腔患者与麦胶蛋白、天然肽(肽A)或脱酰胺肽(肽B)的消化性胰蛋白酶消化(PT)体外培养。折线表示仅用培养基培养的片段获得的值。数值是平均值(SD)。
DQ8空肠黏膜免疫荧光染色+腹腔病人体外培养与脱酰胺肽(A)或只与培养基(B)。(A) CD3增加+与(B)相比，上皮内淋巴细胞(红色)明显;CD25的增加也很明显+细胞(绿色)，尤指在上皮下区。CD3的显著增加+CD25+活化的T细胞(黄色)也被发现。当用天然肽或麦胶蛋白消化酶消化液培养粘膜时，观察到类似的模式。
我们还评估了ICAM-1的表达，以寻找激活粘膜细胞介导免疫的进一步证据。HLA-DQ8活检标本的所有细胞和血管中ICAM-1均显著升高+(p < 0.001)和hla dq8−用PT麦胶蛋白培养腹腔24小时组与单纯培养基培养组比较差异有显著性(p<0.01);相反，仅在腹腔HLA-DQ8中存在+在HLA-DQ8的活检中，ICAM-1的表达是否显著增强(p<0.001)，而在HLA-DQ8的活检中，ICAM-1的表达没有显著差异−患者在肽的存在下培养(原生的和去氨基的)，与单独培养基培养相比(图3)。
HLA-DQ8的空肠活检标本固有层细胞间粘附分子-1 (ICAM-1)的表达+和hla dq8−体外培养腹腔患者与谷蛋白、天然肽(肽A)或脱酰胺肽(肽B)的消化性胰蛋白酶消化(PT)。粘附分子的表达根据染色强度进行评估，并按任意刻度分级:弱染色(+)=1，中等染色(++)=2，强染色(+++)=3。折线表示在单独用培养基培养的片段中获得的值。
HLA-DQ8限制性肽挑战对T细胞浸润的影响
HLA-DQ8细胞中CD3上皮内淋巴细胞明显增多+与仅在培养基中培养(23(9))相比，在麦胶蛋白(54(19))、原生肽(54(19))或脱酰胺肽(44(20))的PT消化液中培养的活组织切片(p<0.01)(图4、图2)−腹腔患者中，CD3上皮内淋巴细胞显著增加(p<0.01)仅在麦胶蛋白存在培养的活检标本中可见(42(12))。事实上，CD3的数量没有显著差异+HLA-DQ8活检时的上皮内淋巴细胞−患者在DQ8限制性肽的存在下培养(原生的(26(8)和去氨基的(25(4))，与仅在培养基中培养的患者(21(8))相比(图4)。
HLA-DQ8空肠活检标本中的CD3上皮内淋巴细胞+和hla dq8−腹腔患者与麦胶蛋白、天然肽(肽A)或脱酰胺肽(肽B)的消化性胰蛋白酶消化(PT)体外培养。折线表示仅用培养基培养的片段获得的值。数值是平均值(SD)。
HLA-DQ8限制性肽挑战对Fas上皮表达的影响
从HLA-DQ8中获得的活检样本中，上皮细胞Fas的表达，特别是在肠细胞的基底外侧膜中明显增加，在PT麦胶蛋白刺激24小时后增加+(p < 0.001)和hla dq8−(p<0.01)的腹腔患者与单纯培养液培养的样品比较(图5)。同时，HLA-DQ8表达显著增强+腹腔活检组织在天然肽(p<0.001)或去氨基肽(p<0.001)的存在下培养，与仅在培养基中培养的相比(图5,6)。这种现象是HLA-DQ8特有的+腹腔患者;事实上，在HLA-DQ8的活检中评估Fas表达时，没有发现显著差异−患者在DQ8限制性肽(原生的和去氨基的)存在下培养。
HLA-DQ8在空肠黏膜上皮细胞Fas的表达+和hla dq8−腹腔患者体外培养与麦胶蛋白、天然肽(肽A)或脱酰胺肽(肽B)的消化性胰蛋白酶消化(PT)。Fas的表达根据染色强度进行评估，并按任意刻度分级，弱染色(+)=1，中等染色(++)=2，强染色(+++)=3。虚线表示用培养基培养的片段得到的值。
DQ8空肠黏膜上皮细胞Fas的表达+腹腔病人体外培养只与培养基(A)或与原生肽(肽A) (B)。在后者，强烈的染色检测到几乎所有上皮细胞;在肠细胞基底外侧膜的表达尤为明显。当黏膜与脱酰胺肽或麦胶蛋白消化酶培养时，观察到类似的模式。原来放大×100。
讨论
大多数证据表明，在腹腔疾病的发病机制中起决定性作用的是肠道病变部位的HLA-DQ2和/或DQ8限制性谷蛋白特异性T细胞。1，7尽管如此，由于面筋蛋白具有相当的生物化学复杂性，对导致粘膜损伤的氨基酸序列仍不确定。多年来，人们使用了一些工具来识别“有毒”序列，可能是为了研究与T细胞识别无关的麦胶蛋白多肽的不同特性。14，15最近，通过从治疗和未治疗的患者的粘膜中分离出麦胶蛋白特异性T细胞克隆，以及通过现代分析工具的实施，在识别T细胞刺激性面筋源肽方面取得了长足进展。这项工作已经证明脱酰胺可以增强T细胞对这些多肽的反应性。到目前为止，已经发现了5种可被T细胞识别的麦胶蛋白表位，其中3种受HLA-DQ2限制，2种受HLA-DQ8分子限制，但预计更多的表位具有免疫原性。16所有HLA-DQ2限制性表位和其中一个HLA-DQ8限制性肽的反应性都因特定谷氨酰胺残基的谷氨酸脱酰胺而显著增强。4 -9但对于属于谷蛋白分子的其余HLA-DQ8决定因子似乎并非如此。17
我们的目标是将这些观察结果转移到一个更复杂的系统中，该系统以腹腔活组织检查的体外器官培养为代表，该模型过去已用于测试麦胶蛋白多肽的生物学特性14最近，他们的免疫原性。10日,13我们的数据显示，DQ8限制性麦胶蛋白表位，其在T细胞克隆上的活性，8日,9在治疗后腹腔黏膜的器官培养系统中也有活性。在这个系统中，它显著增加了固有层单个核细胞的密度，特别是表达白介素2受体的T细胞。后一种现象，伴随着这些细胞的重新分布，在上皮下腔室招募，其幅度与在存在整个麦胶蛋白PT消化体的培养中观察到的相似。最可能的解释是所使用的肽肯定是免疫显性的，但也有可能是特定于该肽的T细胞克隆的激活之后是其他单个核细胞的旁观者激活;事实上，在我们的培养系统中，随着麦胶蛋白的刺激，主要的CD25+亚组以CD3-CD25为代表+细胞，后者可能是激活的巨噬细胞。
我们还观察到在肽存在下培养的片段中ICAM-1的表达显著增强。后一种现象已经在用麦胶蛋白消化液培养的腹腔活检中得到描述18并归因于强烈的γ干扰素诱导，这是体外反应的主要特征之一。19此外，在我们用该肽培养的活组织切片中观察到另外两种现象:CD3上皮内密度增加+上皮细胞Fas分子表达增强。第一个观察到的现象已经在体外对麦胶蛋白产生反应;由于其不受CTLA4-Ig(一种干扰T细胞共刺激的分子)的影响，其对T细胞的依赖性受到了质疑，并假设存在与粘膜T细胞平行的途径。18对Fas的诱导也进行了类似的观察，认为Fas对上皮细胞(非t细胞介导的)有直接影响。18然而，CD3上皮浸润仍有可能是固有层T细胞激活的结果。事实上，在人胎肠的外植体中，抗cd3抗体激活的小肠T细胞诱导上皮内淋巴细胞显著增加，提示这可能是固有层T细胞激活的结果。20.更难以解释的是Fas在上皮细胞上的表达，因为此前没有证据表明T细胞激活对这种现象的影响，在我们的经验中，这似乎是DQ限制。在解释结果时还必须考虑在系统中使用的相对大量的肽。
这些现象在HLA-DQ8阴性受试者中均未观察到。这种明确的HLA-DQ对肽活性的限制不仅对我们理解麦胶蛋白在腹腔黏膜中触发事件的顺序具有重要意义;事实上，这是第一次在乳糜泻患者的不同亚群中显示出不同的生物活性。目前尚不清楚腹腔患者的反应是针对少数还是多个多肽，但我们的观察提出了它们的免疫原性问题，这取决于患者的基因组成。对于我们研究的肽，它很可能是免疫显性的，因为所有6个HLA-DQ8腹腔粘膜测试显示出明确的反应。
当分析所有体外反应时，没有注意到原生或脱酰胺形式的肽之间的差异。正如T细胞克隆研究表明的那样，两种多肽可能都是活性的，即使是不同程度的活性。在器官培养系统中使用的相对大量的肽甚至可以使非脱氨基肽激活T细胞;在这种情况下，脱酰胺作用并不重要。在备择假设中，只有脱酰胺肽是活性的;由于去酰胺化很可能发生在器官培养过程中，21与非脱氨基肽培养的片段最终会被激活。以阻断原位组织转谷氨酰胺酶活性为目的的实验有助于确定该原生肽的粘膜脱酰胺化的可能作用。
总之，我们有证据表明，在体外器官培养系统中，通过HLA-DQ限制的方式，一种对从腹腔粘膜分离的T细胞克隆具有活性的肽也具有活性，可导致T细胞激活、T细胞上皮内迁移和凋亡前现象。器官培养系统被证实在确定麦胶蛋白多肽的生物活性方面非常有用，在其毒性的最终证据被挑战研究提供之前。
致谢
这项研究是在欧洲共同体委员会的具体RTD方案“生活质量和生活资源管理”(QLK1-CT-1999-00037)的财政支持下进行的，该方案是对欧洲人口中乳糜泻患病率及其遗传成分的评估。这项工作部分得到了“卫生高等研究院”的支持:食品工业的发展(98/JK/T3)”。衷心感谢C Meccariello先生和L Cipriano博士(意大利CNR Avellino食品科学与技术研究所)的技术帮助。