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摘要
背景和目的:白介素(IL) 17是一种具有强烈促炎活性的细胞因子。在这项研究中，我们评估了炎症性肠病(IBD)患者炎症黏膜和血清中IL-17表达的变化。
方法:从溃疡性结肠炎(UC) (n=20)、克罗恩病(CD) (n=20)、感染性结肠炎(n=5)、缺血性结肠炎(n=8)和正常结直肠组织(n=15)的患者中通过内窥镜或手术获得组织样本。IL-17的表达用标准免疫组化方法进行评估。ELISA法测定血清IL-17水平。逆转录-聚合酶链反应分析il - 17mrna表达。
结果:正常结肠粘膜、传染性结肠炎和缺血性结肠炎标本均未检测到IL-17的表达。在活动期UC和CD患者的炎症黏膜中，CD3中可明显检测到IL-17的表达+T细胞或CD68+单核细胞/巨噬细胞。IL-17的平均数量+活动期UC和CD患者与非活动期患者相比，细胞明显增加。正常黏膜未检测到il - 17mrna的表达，但UC和CD活动期黏膜中检测到il - 17mrna的表达。在正常人、传染性结肠炎或缺血性结肠炎患者的血清中未检测到IL-17，但在IBD患者中IL-17水平显著升高。
结论:IBD患者黏膜和血清中IL-17表达升高。IL-17在IBD中的表达可能与肠黏膜免疫和炎症反应的改变有关。
- 炎症性肠病
- 细胞因子
- T细胞
- 单核细胞/巨噬细胞
- 白介素17
- 炎症性肠病
- 加州大学,溃疡性结肠炎
- CD克罗恩氏病
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- 肿瘤坏死因子
- FITC,异硫氰酸荧光素
- 酶联免疫吸附试验
- 逆转录聚合酶链反应
- 酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿
- PBS，磷酸盐缓冲盐水
来自Altmetric.com的统计
炎症性肠病(IBD)如溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)的特点是炎症反复发作和有慢性小肠结肠炎病史。T细胞和单核/巨噬细胞的活化被认为是IBD发病的重要因素。1 -4
人白细胞介素17 (IL-17)是一种约20 kDa的糖蛋白，含有155个氨基酸，与小鼠IL-17(最初被确定为细胞毒性T淋巴细胞相关抗原8)和病毒IL-17 (T淋巴细胞的开放阅读框13)具有密切的序列同源性疱疹病毒saimiri。5，6据报道，IL-17在T淋巴细胞中分泌有限，主要是在记忆CD45RO中+细胞。7 -9最近，有报道称IL-17F是IL-17家族的一员，由单核细胞/巨噬细胞系分泌。10相比之下，IL-17受体广泛分布在各种细胞类型上。11，12越来越多的证据表明，IL-17是各种组织炎症反应的有效中介。例如，IL-17诱导了几个与炎症相关的基因，包括IL-6、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、白血病抑制因子和细胞间粘附分子1。13 -18此外，IL-17增强了IL-1β和肿瘤坏死因子α (TNF-α)诱导的促炎反应。19 -22
IL-17与几种炎症性疾病有关，如风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性硬化症、系统性红斑狼疮、银屑病、幽门螺杆菌相关的胃炎，支气管哮喘和肾移植排斥反应。21 -29然而，IL-17在IBD中的病理生理作用尚不清楚。在本研究中，我们研究了IL-17在IBD患者中的表达。我们的结果提供了IL-17在炎症性肠病的炎症黏膜中过表达的证据，因此可能有助于炎症性肠病的病理生理。
材料和方法
组织样本
UC和CD的诊断是基于传统的临床、内镜和组织病理学标准。来自UC (n=20)和CD (n=20)结肠受累区域的手术或活检标本在知情同意的情况下获得。根据UC疾病活动度指数评估UC患者的疾病活动度，30.而乳糜泻患者则由乳糜泻活性指数决定。31所有IBD患者都使用水杨酸盐治疗，但没有人使用免疫抑制剂(如硫唑嘌呤)治疗。通过结肠镜检查获得感染性结肠炎(n=5)和缺血性结肠炎(n=8)的活检样本。取正常结直肠组织(n=15)。
免疫组织化学
样品在10%缓冲福尔马林中固定，在乙醇中脱水，并嵌入石蜡。切片(4 μm)在pH为6.1的柠檬酸缓冲液中进行预处理，微波(700 W, 1分钟)。冷却后，用Dako封闭试剂(#X0909;随后用山羊抗人白细胞介素17多克隆抗体(在含5%脱脂牛奶的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以1:100稀释)孵育;Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA)在4°C的潮湿室中保存48小时。作为阴性对照，切片与正常山羊IgG孵育(Santa Cruz Biotechnology)。用一抗孵育后，切片用0.1% H反应2O2用生物素结合兔抗山羊IgG(在含1%脱脂牛奶的PBS中稀释1:2)处理;Vector, Burlingame, California, USA)在室温下放置60分钟，然后使用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(Vector)。用二氨基联苯胺检测过氧化物酶活性。
对于anti-IL-17 + anti-CD3和/或anti-IL-17 + anti-CD68双染色，按照上述方法对脱蜡切片进行预处理。首先涂抹抗il -17抗体(稀释1:100)，在4°C的湿化室中培养48小时。随后，单克隆小鼠抗人CD3或CD68(在含5%脱脂牛奶的PBS中1:100稀释;Novocastra, Dossenheim, Germany)在4°C下涂抹一夜。德克萨斯红标记抗山羊IgG(在含1%脱脂牛奶和0.1% Triton X100的PBS中稀释1:500;美国宾夕法尼亚州吉尔伯特维尔罗克兰市)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的马抗鼠IgG(稀释1:500;Vector)在室温下应用120分钟。图像由数字共聚焦激光扫描系统MRC-600 (Bio Rad, Hercules, California, USA)获得。以正常山羊或小鼠IgG作为阴性对照。
人IL-17的酶联免疫吸附试验(ELISA)
血清IL-17水平测定采用人IL-17酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒，试剂盒购自BioSource International (Camarillo, California, USA)。ELISA检测下限为9 pg/ml。29例UC患者(15例不活跃，14例活跃)和32例CD患者(15例不活跃，17例活跃)的血清样本进行了评估。对照组包括20名无IBD和非免疫介导性疾病家族史的健康个体，或12名非IBD腹泻疾病患者。取全静脉血，离心凝血分离血清。然后取等分，在- 80°C保存，直到进行测试。用含0.1%吐温20的PBS稀释样品，按照BioSource提供的手册操作。
外周血T细胞和单核/巨噬细胞的分离
通过FACS vantage (Becton Dickinson, Mountain View, California, USA)从外周血中分离出抗cd68阳性的人单核细胞和抗cd3阳性的T细胞。各居群纯度为95 ~ 98%。
分别用50 ng/ml的IL-2 (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA)或100 ng/ml的脂多糖(Sigma-Aldrich Japan, Tokyo, Japan)刺激T细胞和单核细胞。
逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测人IL-17
为了确认IL-17在人外周血单核细胞和T细胞中的表达，我们进行了RT-PCR分析。RT-PCR法检测粘膜组织中il - 17mrna的表达。用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿(AGPC)法分离细胞总RNA。32对于每个样本，使用0.5 μg总细胞RNA与寡聚(dT)引物和Superscript II逆转录酶(Gibco BRL, Rockville, Maryland, Maryland)合成第一条cDNA链。cDNA样本(1 μl)在25 μl含有10×Taq buffer (Perkin Elmer Cetus Corp.， Norwalk, Connecticut, USA)， 1.5 mM MgCl的反应混合物中扩增25 '和3 '引物各0.1 μM, 1uTaqGold聚合酶(优秀的鲸鱼座)。PCR在热循环器中进行(GeneAmp Model 2400;进行35个循环(94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 40秒)，然后在72°C延长8分钟。PCR产物(5 μl)用1.5%琼脂糖凝胶电泳，用0.5 μg/ml溴化乙锭染色。采用100 bp的DNA梯子(Gibco BRL)作为标记。根据已发表的序列数据构建人IL-17基因特异性引物26: 5 ' -aga gat atc CCT CTG tg atc -3 '， 5 ' -tac CCC aaa GTT atc tca gg-3 '。PCR产物连接到TA克隆载体(Promega, Madison, Wisconsin, USA)，并用双脱氧核苷酸链终止法进行测序。33
统计分析
根据Middle和同事描述的方法，由两名盲法评估人员对切片进行IL-17的免疫反应性评估。34在活动性乳糜泻和UC样本中，对炎症区域进行评估。标记相应区域的切片，并在400倍放大倍率下计算高功率场。使用了每张幻灯片总共5个高功率场的平均计数。
采用Mann-Whitney U检验(Statview Version 4.5)确定差异的统计学意义。p值小于0.05的差异被认为有统计学意义。
结果
为了评估黏膜中IL-17蛋白的表达，活检标本和/或手术切除的标本用抗IL-17抗体染色。如图1所示，未见IL-17+正常结肠粘膜或缺血性结肠炎标本中的细胞。同样，在传染性结肠炎中没有IL-17的免疫染色(数据未显示)。相比之下，IL-17明显增加+活动期UC和CD患者炎症区可见细胞。特别是,IL-17+从活跃性乳糜泻患者的样本中，细胞明显增加。在活动期UC患者中，IL-17+细胞主要位于固有层，但在活跃性乳糜泻患者中，这些细胞分散在黏膜下层和固有肌层。如图2所示，IL-17的数量+在活动性IBD患者中细胞明显增加。特别是IL-17的数量+与活动期UC患者相比，活动期CD患者细胞明显增加。IL-17的编号+与活动性IBD患者相比，非活动性IBD患者样本中细胞减少。
结肠中白介素17 (IL-17)蛋白表达的免疫组化分析。(A)对照正常黏膜(×200);(B)缺血性结肠炎(×200);(C)和(D)溃疡性结肠炎(×200);(E)和(F)克罗恩病(×100和×200)。
黏膜中白细胞介素17 (IL-17)阳性细胞的数量。结果用每个细胞场的阳性细胞数表示(×400)。方框的上下边距代表第25百分位和第75百分位，伸出的臂分别代表第10百分位和第90百分位。中位数显示为方框内的水平线。加州大学,溃疡性结肠炎;CD,克罗恩病。
为了确认IBD患者中IL-17的细胞来源，用荧光标记的抗CD3 (T细胞特异性)、抗CD68(单核/巨噬细胞特异性)和抗IL-17抗体(图3)对活动性乳糜泻和UC患者的样本进行双重染色。在乳糜泻患者的样本(图3A-F)中，有许多CD68/IL-17双阳性(黄色)细胞(图3F)和CD3/IL-17双阳性(图3C)。这表明，单核/巨噬细胞和T细胞是乳糜泻患者炎症黏膜中IL-17的来源。UC患者的样本中也观察到类似的染色模式(图3G-L)。UC患者炎症黏膜中存在CD3/IL-17(图3I)和CD68/ IL-17(图3L)双阳性细胞。
白细胞介素17 (IL-17)在克罗恩病(A-F)和溃疡性结肠炎(G-L)患者中的细胞表达采用两种彩色免疫荧光法测定IL-17的表达(罗丹明红、红色荧光:B、E、H和K)、CD3的表达(异硫氰酸荧光素(FITC)、绿色荧光:A、G)和CD68的表达(FITC、绿色荧光:D、J)。用黄色显示IL-17和CD3 (C、I)或IL-17和CD68 (F、L)共表达的细胞。每个抗体的特异性通过与抗cd3 (M)、抗il -17 (N)和抗cd68 (O)的正常IgG相匹配的亚类阴性反应来确认。
接下来，我们研究了正常个体和活跃性乳糜泻患者黏膜中IL-17 mRNA的表达。本研究使用的RT-PCR系统检测了正常人外周血中分离的T细胞和单核/巨噬细胞中IL-17 mRNA的表达(图4左)。在所有来自正常人的样本中，未检测到IL-17 mRNA的表达(图4右)。在活动性乳糜泻患者的炎症黏膜中，10个样本中有9个检测到IL-17 mRNA的表达。同样，在UC患者的炎症粘膜中，9个样本中有6个被检测到(图4右)。
逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析白介素17 (IL-17) mRNA表达。纯化的T细胞用白介素2刺激3小时，纯化的单核/巨噬细胞用脂多糖刺激3小时。采用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿(AGPC)法提取细胞总RNA, RT-PCR分析IL-17 mRNA表达。同样，IL-17 mRNA的表达也在正常人、活动性克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)患者的粘膜样本中进行了研究。
我们评估了IBD患者的血清IL-17水平。如图5所示，IL-17未在正常人血清中检测到，也未在感染性结肠炎或缺血性结肠炎中检测到。活动期UC和CD患者血清IL-17明显高于健康人。特别是，活跃性乳糜泻患者的IL-17水平明显升高。
炎症性肠病患者血清白细胞介素17 (IL-17)水平ELISA法测定从Bio Source International (Camarillo, California, USA)购买的人IL-17的水平。ELISA下限为9 pg/ml的IL-17。方框的上下边距代表第25百分位和第75百分位，伸出的臂分别代表第10百分位和第90百分位。中位数显示为方框内的水平线。加州大学,溃疡性结肠炎;CD,克罗恩病。
讨论
免疫反应的改变与IBD的发病机制有关。许多关于IBD发病机制的研究都集中在黏膜细胞因子分泌受损上。例如，越来越多的研究报告了促炎细胞因子和趋化因子的粘膜浓度增加，包括IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-12、IL-16、IL-18、干扰素γ和其他。34 -41
IL-17主要来源于活化的T细胞。7 -9最近的报道显示IL-17F是IL-17家族的一员，由单核/巨噬细胞分泌。10IL-17刺激人类细胞中促炎细胞因子的表达和产生，12 -17IL-17的促炎性质取决于转录因子核因子κB的激活。18，21大量的T细胞和单核/巨噬细胞浸润到炎症粘膜已在IBD患者中报道过1 -4但炎症细胞分泌IL-17的作用尚未被研究。因此，本研究的目的是评估IL-17活性在IBD患者中升高的可能性。应用免疫组化技术初步研究了IBD患者炎症黏膜中IL-17的分泌情况。IL-17的编号+IBD炎症黏膜细胞明显升高。特别是IL-17的数量+乳糜泻患者活动性病变细胞增加。用抗cd3或抗cd68和抗IL-17抗体双染色显示，在IBD患者炎症黏膜中，T细胞和单核/巨噬细胞是IL-17的局部来源。根据IL-17的生物学特性，我们的研究结果表明，来自活化的T细胞和单核/巨噬细胞的IL-17可能参与了IBD黏膜炎症反应的诱导和持续。
此前的研究表明，IBD患者血清中的几种促炎细胞因子升高。例如，在IBD患者中IL-6、TNF-α、cc趋化因子eotaxin和巨噬细胞抑制因子的血清水平升高已经有报道。42 -46促炎细胞因子的升高被认为与肠道炎症的严重程度有关。在本研究中，我们发现活动性IBD患者血清IL-17水平显著升高。值得注意的是，活动期乳糜泻患者血清IL-17水平明显高于活动期UC患者。这些结果与免疫组化观察显示的IL-17的数量一致+与UC患者相比，活动期CD患者炎症黏膜中的细胞数量更多。关于血清IL-17水平与疾病活动性之间关系的研究，以往的报道23，25，29血清IL-17水平随疾病活动性的变化而变化。血清IL-17在评估IBD患者疾病活动性方面的作用尚不清楚。对更多患者的进一步研究将阐明它在IBD患者中的作用。
总之，我们证明了活动性IBD患者的黏膜IL-17表达和血清IL-17水平升高。这些结果提示IL-17可能在IBD患者的病理生理中发挥重要作用。需要对更多IBD患者进行进一步研究，以确定黏膜IL-17分泌升高的机制以及IL-17在IBD中的免疫作用。
致谢
作者感谢T Tsujikawa博士和M Sasaki博士的技术援助。该研究得到了日本文部科学省科学研究赠款(B)的部分支持(12470121和13470119)。