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摘要
背景:细菌与某些形式的慢性结肠炎模型有关，但细菌在人类溃疡性结肠炎(UC)中的身份和作用尚不确定。
目的:从UC患者炎症黏膜中分离病原菌，检测该菌对Vero细胞是否具有毒素，并确定该毒素是否诱导动物UC样病变。
方法:从UC患者中分离细菌，并过滤培养物的上清液，测试对Vero细胞的细胞毒性。用聚合酶链反应检测产生细胞毒性上清的细菌细胞，以寻找维罗毒素基因。用高效液相色谱法检测细胞毒菌株培养上清的有机酸浓度。给小鼠灌肠含有细胞毒菌株上清液中平均浓度的有机酸，以确定UC中是否出现结肠病变。
结果:只有培养物的上清梭菌属varium维洛细胞死亡。细菌细胞缺乏维罗毒素基因。细菌培养上清中含有高浓度的n-丁酸和平均浓度(32 mmol/l)对Vero细胞有细胞毒性。24小时后给小鼠灌肠含有丁酸或F varium观察培养上清、结肠溃疡伴隐窝脓肿、炎症细胞浸润和细胞凋亡变化。
结论:培养上清中的丁酸F varium导致小鼠uc样病变。这项研究表明F varium可能是UC病因不明的因素之一。
- 溃疡性结肠炎
- 细菌
- 结肠粘膜
- 梭菌属varium
- 加州大学,溃疡性结肠炎
- 聚合酶链式反应
- 尿苷DNA末端缺口末端标记
- PBS，磷酸盐缓冲盐水
- 菌落形成单位
- H&E，苏木精和伊红
来自Altmetric.com的统计
溃疡性结肠炎(UC)的病因不明。尽管UC与传染性结肠炎的组织学特征相同，1它可以与其他传染性病原体引起的结肠炎(如志贺氏菌、出血热)进行鉴别诊断大肠杆菌沙门氏菌，阿米巴病，淋病，衣原体，difficle梭状芽胞杆菌)进行大便培养、粘膜培养和血清学检测。正常腔内细菌与自发性结肠炎有关，而自发性结肠炎在无菌敲除小鼠中不发生。2 -5UC腔内菌群在许多研究中都有研究。6 -9UC患者有异常多的兼性厌氧细菌。6其中一种是粘合剂大肠杆菌，与UC的发病机制有关。7在两项研究中,大肠杆菌从18例UC复发患者中的4例的粪便中分离出产生维罗毒素的细胞8以及所有28例UC复发或缓解期患者的直肠活检。9然而，在另一项研究中，34例UC活动性患者的粪便中这种细菌呈阴性。10
然而，黏膜菌群应该发挥关键作用，因为感染开始于微生物粘附于宿主。11我们之前报道过，在所有16例UC患者的黏膜菌群中发现了侵入结肠黏膜的细菌，但10例对照组均未发现。12最近,Swidsinski等在UC患者中发现高浓度的粘膜细菌，但在健康对照组中没有。13我们能够通过入侵试验检测粘液和粘膜中的入侵细菌14他们使用亚胺培南而不是庆大霉素。亚胺培南未被肠黏膜吸收15杀死了腔内的好氧和厌氧细菌。16在此，我们从炎症粘膜中分离出细菌，并检测其是否含有维罗毒素。然后在实验动物身上测试产生毒素的物种是否有能力引起类似UC的病变。
方法
粘膜细菌的分离
活检标本是在知情同意的情况下从10例患者(平均年龄36 (SD 11)岁;七男三女)。患者从连续31例经内镜和病理诊断为活动性UC的患者中随机选取，既往无抗生素使用史。如别处所述，对粘膜微生物进行细菌学检查。17总之,标本第一次孵化imipenem(50μg / ml盐水)一小时在37°C。连续稀释的样品被分散在4个琼脂板上进行有氧培养，8个琼脂板进行厌氧培养。分离出的细菌用纸片扩散试验检测亚胺培南的敏感性(最小抑菌浓度<4 μg/ml)。
体外毒性试验
20种42株菌株的培养上清(pH 6.3-6.6)对Vero细胞进行毒性试验。18Vero细胞在含10%胎牛血清和50mg /ml庆大霉素的火腿营养混合物F12 (Nissui Pharmaceutical Co, Tokyo, Japan)中培养。通过播种10获得Vero单分子膜4在使用前48小时在每个孔中植入细胞。菌株在ABCM肉汤(Eiken Chemicals, Tokyo, Japan)中37°C孵育72小时。通过计算每毫升菌落数来估计培养细菌的密度。在96孔板中培养的Vero细胞每100 μl孔中加培养上清25 μl。37°C培养96 h，观察形态变化细胞的比例。当上清液对Vero细胞显示毒性时，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释两倍的上清液重新测试毒性。文化的上层清液大肠杆菌以O157:H7 EDL-931为阳性对照，PBS和ABCM肉汤为阴性对照。
聚合酶链式反应(PCR)
每个细胞毒性菌株的一个或两个菌落的细菌被测试维罗毒素基因，如别处所述。19扩增采用以下引物:5 ' -agttaat gtggtggcgaa3 ', 5 ' -gactcttccatctgccg-3 '表示维罗毒素1(从核苷酸289到1099)，5 ' -ttcggtatcctattcccg3 ', 5 ' -tctctggtcattgtattaverotoxin 2 -3 '(289至759)(Takara Shuzo，大津，滋贺，日本)。PCR条件为94°C 3分钟，55°C 30秒，72°C 30秒，25个循环，扩增DNA用海底凝胶电泳(1.5%琼脂糖;5 V/cm)，并用溴化乙锭染色。作为阳性对照，模板DNA大肠杆菌包括O157:H7 EDL-913。
毒素大小的鉴定
用离心浓缩器将培养的细胞毒细菌上清浓缩20倍(分子量切断10万~ 3000;Amicon, Beverly, Massachusetts, USA)和Diaflo超滤膜YC1和YC05(分子量截断1000和500;Amicon)。对透析液进行毒性测定。为了使热不稳定内毒素失活，浓缩液和透析液在120°C加热15分钟。浓缩液和透析液在37°C下孵育1小时，同时加入和不加入pronase和trypsin的混合物(各200 μg/ml)，以检测蛋白酶敏感性。
有机酸分析
测定细胞毒性细菌上清液的有机酸浓度。水相经醋酸纤维素膜(孔径0.20 μm;DISMIC-13 cp;Tokyo Roshi, Tokyo, Japan)和样品用高效液相色谱法检测，如别处所述。20.测定了有毒培养上清液中有机酸的平均浓度，并对每种有机酸溶液进行了毒性测试。通过剂量效应实验比较了有毒培养上清中有机酸的细胞毒性。孵育96 h后，通过显微镜下计数非贴壁细胞，估计能杀死99%细胞的最低平均浓度。未处理的Vero细胞作为对照。使用pH计(PH5011A, Custom Co.， Tokyo, Japan)在有机酸处理和Vero细胞培养的对照井中测量pH值。
体内毒性试验
4周龄雄性CBA/J小鼠在乙醚吸入麻醉下灌肠32 mmol/l丁酸(pH 3.2)。的平均浓度外推n5种细胞毒菌株的培养上清液中均含有-丁酸梭菌属varium)在37°C孵育72小时后。用1.0 ml丁酸溶液(n=8)或上清(pH 6.3-6.6)处理小鼠F varium细胞生长到1×10浓度9菌落形成单位(CFU)/ml (n=9)。对照组小鼠给予1.0 ml 2mmol /l HCl (n=8, pH 2.22)、PBS (n=10)或ABCM肉汤(n=8)灌肠。肛门边缘用氰基丙烯酸酯封闭，24小时后乙醚麻醉处死。切除肛门边缘3厘米的直肠和结肠，用10%缓冲福尔马林(pH 7.2)固定。纵向块包埋并用苏木精和伊红染色(H&E)。其余组织在液氮中冷冻，用尿苷DNA末端标记(TUNEL)检测低温切片的凋亡情况。21每个结肠纵断面UC的严重程度按照0到4级的组织学分级，并以病理指数表示。修改后的标准评分系统17盲法进行数值评估，按照以下方案:0，正常;1、局灶性炎症细胞浸润，包括多形核白细胞;2、腺体丧失伴炎性细胞浸润或隐窝脓肿;3、粘膜溃疡(长< 1mm);4、多发溃疡或长时间粘膜溃疡(长≥1mm)。每个切片至少计数2500个上皮细胞，每100个细胞中受影响的细胞数以凋亡指数(%)表示。对于每只小鼠，一个病理学家(IO)对治疗结果不知情，做出独立的组织学诊断。
统计分析
采用Mann-Whitney U检验，Bonferroni校正，评价不同灌肠剂组间病理指标和凋亡指标的差异。p<0.05为差异有统计学意义。
结果
粘膜细菌的体外毒性研究
表1列出了分离的细菌种类。所有菌株均对亚胺培南敏感，在37℃ABCM培养基中培养72 h的菌数为1-2×109CFU /毫升。培养五种细胞的上清F varium菌株对Vero细胞具有细胞毒性(图1)F varium菌株对Vero细胞也有细胞毒性，但1:4稀释后的上清没有细胞毒性。另一方面，没有发现维洛毒素的基因编码F varium．其他菌种的上清和培养肉汤都没有毒性(表1)大肠杆菌阳性对照是有毒的。
一个菌株的培养上清的细胞毒性作用F varium在维洛细胞。细胞长丝状卷须,被捕,许多人分离培养基。文化的上层清液大肠杆菌O157:H7 EDL-931，产生维罗毒素，有同样的效果(未显示)。未接种的培养肉汤没有细胞毒性。
识别verotoxin
我们试图鉴别有毒物质F varium．通过分子量为500的过滤器的上清液被加热和蛋白酶处理。处理过的上清液对Vero细胞仍然具有毒性，这表明毒素是一种小的非蛋白性分子。可能是毒素的有机酸和浓度在两者的上清液中检测到F varium和ABCM肉汤控制见表2。产生的有机酸的最高平均浓度F varium是n-丁酸，32.1 (SD 3.9) mmol/l。在100 μl的Vero细胞培养液中加入25 μl的培养上清，96孔板中有机酸的最终浓度为原浓度的1:5稀释。的平均浓度n-丁酸在细胞培养上清液中产生的pH值为3.2，对Vero细胞的细胞毒性为ph6.90。丁酸与乙酸培养液的pH值相同。然而，醋酸在平均浓度下没有细胞毒性。
在剂量效应实验中，比较有毒培养上清中有机酸的细胞毒性，使>99%细胞被杀死的最低有机酸平均浓度和pH值如表2所示。作为有机酸的浓度，除了n-丁酸，在Vero细胞培养中低于产生细胞毒性的最低平均浓度，有机酸浓度除n培养上清中发现的-丁酸不被认为是有毒的。
实验性uc样结肠溃疡
目视检查显示，小鼠结肠粘膜糜烂处理上清F varium或丁酸。显微镜下观察到粘膜糜烂和包括中性粒细胞在内的炎症细胞浸润。小鼠用F varium与对照组相比，丁酸或丁酸在粘膜中有更多的凋亡小体(图2)。F varium，中位数3(四分位范围3,4);丁酸4 (3,4);p= 0.973)高于对照组(HCl 2 (1.5, 2.5)， p=0.073;ABCM肉汤1 (0,1)，p=0.002;PBS 0 (0,1)， p=0.001)。同样，凋亡指数升高(F varium23.2%,中位数(四分位范围20.2,24.6);丁酸21.4% (19.3,23.0);p=0.776)与对照组相比(HCl 8.3% (6.6, 10.5)， p=0.021;ABCM肉汤2.9% (2.7,3.2),p = 0.002;PBS 2.4% (2.1, 5.3)， p<0.001)。
丁酸在体内的作用，培养上清F varium、小鼠结直肠黏膜控制物质。(A)用丁酸处理小鼠的隐窝脓肿形成。结直肠黏膜上部可见炎性细胞浸润和早期糜烂改变。隐窝脓肿(箭头所示)。病理指标3(24小时后丁酸灌肠，苏木精和伊红(H&E)，原放大倍数×400)。(B)用培养上清处理小鼠的早期粘膜变化F varium．结直肠黏膜浅层有明显退行性改变。几个凋亡小体(箭头)出现在肠隐窝的下部。在固有层可见轻度炎症细胞浸润。病理指标2(上清灌肠后24小时，H&E，原始放大倍数×400)。(C)小鼠早期弥漫性糜烂用培养上清处理F varium．结肠内可见弥漫性糜烂改变，可见腔内炎性渗出。在固有层可见严重的炎症细胞浸润，并伴有广泛的腺体丢失。病理指标4(上清灌肠，H&E，原放大倍数×400)。(D)在本小鼠和其他用培养上清或丁酸处理过的小鼠中，肠隐窝下部可见大量凋亡细胞，末端尿苷DNA切口末端标记(TUNEL)(丁酸灌肠，原放大×300)。
结肠溃疡性结肠炎样病变的病理和凋亡指标F varium培养上清或丁酸灌肠。小鼠的平均病理指数F varium(3.3)或丁酸(3.5)高于盐酸(p=0.021和0.019)、ABCM肉汤(p均<0.001)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠(p均<0.001)。同样，小鼠的平均凋亡指数F varium(24.0%)或丁酸(20.8%)高于盐酸(p=0.0045和0.012)、ABCM肉汤(p均<0.001)或PBS (p均<0.001)。HCl组小鼠的平均凋亡指数(10.1%)高于ABCM肉汤组和PBS组(p<0.001)。值为平均值(SD);统计分析采用Mann-Whitney U检验，Bonferroni校正。
讨论
我们的数据表明，主要毒素来自培养上清F varium丁酸。我们没有发现任何证据来支持对有毒物质的鉴定F variumverotoxin。维罗毒素，最初被发现是由肠出血产生的大肠杆菌压力,18分子量为7万。verotoxin基因很容易被PCR检测到。19我们使用适当的PCR技术检测verotoxin基因的努力表明它并不存在。我们的含丁酸上清液的毒性与来自牙菌斑的丁酸和丙酸的体外毒性报道一致，22和丁酸在培养滤液中的两种拟杆菌物种。23日,24由于丁酸的平均浓度在上清液中产生的培养条件为pH 3.20，但在对Vero细胞有细胞毒性的孔中，pH变为了pH 6.90，细胞毒性似乎与pH无关。
乙酸、丙酸和丁酸是由结肠中的厌氧菌产生的25并被迅速吸收为结直肠上皮细胞提供能量。26然而,丁酸盐,27日,28丙酸和醋酸酯也诱导结直肠肿瘤细胞凋亡。丁酸盐的作用最大。29因此，对Vero细胞的毒性可能与细菌产生的丁酸诱导细胞凋亡有关。丁酸或培养的上清处理小鼠的凋亡指数较高F varium与对照组相比，与活动期UC患者的结果一致。30.31
在我们的模型中，我们的数据不支持腔内酸度增加导致上皮损伤的可能性。具体来说，用pH值6.3-6.6的上清处理小鼠可观察到粘膜糜烂F varium但在HCl (pH值2.22)处理的对照组小鼠中没有。结果显示，用F varium和丁酸的含量均高于用HCl、ABCM肉汤或PBS处理的对照组。因此，更有可能是培养出的丁酸和富含丁酸的上清F varium灌肠剂诱导的粘膜细胞凋亡导致溃疡，而不是酸性。
丁酸代谢缺陷可能参与UC的发病机制。UC患者的结肠细胞氧化丁酸比没有粘膜异常的对照细胞要少。32可能是培养出的高浓度丁酸和富含丁酸的上清F varium灌给小鼠的灌肠液中含有的灌肠液超过结肠上皮可代谢的灌肠液，从而诱导粘膜细胞凋亡并引起溃疡。我们发现丁酸与溃疡有关，这似乎与报道的丁酸钠灌肠已成功用于治疗UC矛盾。33然而，在一项对照试验中，丁酸钠灌肠对UC治疗无效，34报道的研究中使用的物质与我们实验中使用的丁酸不同。
我们对活动性UC病例活检标本的免疫化学分析表明F varium侵入粘液和粘膜，生活在隐窝中。35在这些隐窝中产生的丁酸有望直接影响上皮细胞。同样的,H幽门可在大多数慢性胃炎或消化性溃疡患者的胃粘膜中发现，36寄生于上皮细胞的粘液层或侵入上皮细胞本身的。37，38
致谢
我们感谢K Ariake博士和Y Ozaki先生在毒性测试方面提供的技术援助，感谢东京医科和牙科大学医学研究所流行病学系横山T博士提供的统计分析。