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背景:形态和功能的改变肠神经系统(ENS)已报告在炎性肠道疾病,但它仍然是不确定是否神经编码的肠肌层的神经元在溃疡性结肠炎(UC)改变。
目的:在这项研究中,我们调查了发射机co-localisation肠肌层的神经元的正常结肠和UC患者结肠。
方法:胆碱乙酰转移酶(聊天),神经元特异性烯醇酶(研究)——血管活性肠肽(VIP)和P物质(SP)在整个支架通过免疫组织化学方法检测到的UC患者结肠肌间神经丛(n = 10)和控制(n = 8)。
结果:聊天积极和VIP阳性神经元的比例相对于了无人口没有差别在发炎(分别为33.3%和9.3%)和non-inflamed结肠段(33.6%和9.7%)的加州大学与控制(35.0%和6.9%)。SP阳性神经元的比例明显增大发炎(15.5%)和non-inflamed(20.3%)比控制段(5.9%)。亚种群变化的分析显示,26.9%的神经元只有聊天积极控制,但明显红肿的小比例(18.8%)和non-inflamed(15.8%)地区的加州大学。包含聊天和SP的神经元的比例明显高于在发炎(11.8%)和non-inflamed(13.9%)比控制区域(5.0%)。
结论:改造的肠肌在加州大学涉及的转变主要是胆碱能神经元SP阳性神经支配。这种效应可能构成的一部分运动性障碍中观察到加州大学神经基础。
- 肌间神经丛
- 溃疡性结肠炎
- P物质
- 神经可塑性
- 影响神经系统的代码
- CD,克罗恩病
- 聊天、胆碱乙酰转移酶
- 存在,肠神经系统
- 炎症性肠病、炎症性肠病
- 分析了无,神经元特异性烯醇酶
- SP, P物质
- 贵宾,——血管活性肠肽
- 加州大学,溃疡性结肠炎
- PBS,磷酸缓冲盐
- NK-1,神经激肽1
来自Altmetric.com的统计
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两种主要形式的炎症性肠病(IBD),克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC),可以区分他们的临床表现,在肠道炎症、免疫档案,和可能的病因学。1此外,肠神经系统的变化(ENS)曾被观察到在炎症性肠病,包括修改的形态(即神经细胞增生和大型节间的纤维束),肠神经元neuromediator内容,改变肠神经元的功能(释放neuromediators受损)(评论,看到弋波和柯林斯2)。这些变化在肠神经元可能参与改变的能动性和分泌反应在炎症性肠病。
以前的研究报道改变肠道neuromediators UC患者和CD。这些研究主要关注描述神经的分布和肽含量和浓度的确定各种CD或UC患者的肠道内肽。人口的变化——血管活性肠肽(VIP)和P物质(SP)主要是观察,但相同的病理结果常常是矛盾的。加州大学研究报告粘膜或整个组织中SP含量增加,3 -6减少SP免疫反应性的神经,7甚至没有变化在结肠粘膜与SP含量控制。8有关贵宾的变化,没有明确的趋势已被确认。Surrenti和他的同事们8显示粘膜VIP水平下降而获利,和同事9发现增加VIPergic加州大学和控制患者的神经支配模式。O 'Morain和他的同事们10观察增加VIP贵宾在加州大学虽然没有改变或SP内容被科赫和他的同事们报告。3
这些明显的差异的一个原因可能是不同的药物治疗,持续时间或炎性疾病的程度,或者肠道的地区进行了研究。差异也可能导致困难的一部分获得代表或定量测量当执行研究薄组织部分。此外,纤维内肽含量的变化是否正常肠道在UC相关变化neuromediator肠丛中的内容目前还不清楚。因此,互补的方法研究旨在描述纤维含量的变化UC是确定肠丛内的假定的神经元的变化内容使用免疫组织化学方法对整个支架的肠肌或粘膜下神经丛网络保存的完整性。该方法已成功应用于描述肠肌及粘膜下神经丛CD的变化。11日,12此外,这种方法,通过确定co-localisation不同neuromediators在单个神经元,神经受影响人口的代码可以建立。这是关键的重要的与不同神经元共存神经化学标记可能有不同的功能。13因此,识别这些人群的神经化学代码的变化可以解释部分胃肠道功能的变化观察到这些病态。
缺乏信息假定的胆碱能的变化,SP免疫反应性的,和VIP免疫反应性的人群UC患者的肠肌层的神经元。没有数据可供人类结肠,首先我们的调查是针对确定的模式发射机胆碱乙酰转移酶(聊天),VIP、SP co-localisation人类结肠肌间神经丛的健康。阶段不同种群的改变被调查在UC患者结肠发炎和非(或轻微)发炎段进行了比较。
材料和方法
标本的正常结肠
控制组织获得八个患者(平均年龄70.3(4.7)年)接受手术切除结肠腺癌远离肿瘤(表1)。没有一个患者结肠肠阻塞或其他疾病。
标本与溃疡性结肠炎结肠
组织样本取自10例(平均年龄40.0(4.1)年)接受proctocolectomy活跃的加州大学,他的疾病被诊断之前2.8(1.2)年临床数据(见表1)。除了一个之外,所有的病人都接受类固醇治疗,六人在免疫抑制药物。宏观上发炎段和非(或轻微)发炎段结肠的移除,除了三个pancolitis患者(患者10号、16、18;表1)。所有患者组织学上使用分级评估组织规模由弋波和他的同事们。14炎症组织报告的分数表2。大部分的宏观上至少发炎地区分2(后来被称为“non-inflamed领域”)。大部分的宏观发炎地区有5分(后来被称为“发炎”)。根据这一规模,组织控制患者都有得分为0。
组织准备
标本的正常和病变结肠获得病人手术和病理部门立即处理。组织是放置在4°C含氧无菌克雷布斯解决方案包含(毫米):117氯化钠,氯化钾的4.7,1.2 MgCl26小时21.2啊,不2阿宝425 NaHCO32.5 CaCl22 h2啊,和11个葡萄糖。然后迅速运往实验室实验。
了一块扁平粘膜在解剖盘包含冰冷无菌含氧克雷布斯解决方案,改变了每10 - 15分钟。准备从intertaenial地区在圆周方向4 - 7厘米,4 - 5厘米在纵向方向。组织与无菌柠檬酸溶液洗4 - 6倍,固定在一个无菌培养皿Sylgard涂布前的无菌培养基(40毫升)。培养基(杜尔贝科修改鹰的媒介/ F12;σ,圣路易斯,密苏里州,美国)补充10%热灭活胎牛血清(σ),100国际单位/毫升青霉素,链霉素100μg /毫升、两性霉素B 1.1μg /毫升、20μg /毫升庆大霉素(σ)、谷氨酰胺和2.1 g / l NaHCO3。增强肽的免疫反应性神经细胞体,秋水仙碱(40μM)被添加到培养基中。然后组织维持在37°C在包含5%的湿润孵化器有限公司2和空气,摇摆托盘,不断搅拌。
免疫组织化学
文化、组织固定后4 - 6小时0.1磷酸缓冲盐(PBS)含有4%多聚甲醛在室温下。在PBS几个洗之后,组织被困在解剖盘。在解剖显微镜下,圆形肌肉被暴露的肌间神经丛。薄的纤维和结缔组织的浆膜也被删除。肌间神经丛/纵肌当时permeabilised PBS /南1 - 2小时3马血清含有0.5% Triton X 100和4%。
组织孵化了以下主要抗体稀释PBS /南3,马血清,4%和0.5% Triton X 18 - 20小时在室温下:兔子anti-ChAT (1:20 0017),鼠anti-substance P (1:1000;菲茨杰拉德,康科德,美国),和鼠标anti-VIP (1:1000;英国生物起源)。孵化原发性抗血清后,组织被PBS和孵化为2 - 3小时驴antirabbit免疫球蛋白结合到carboxymethylindocyanine(1:50 0),驴antirat免疫球蛋白结合7-amino-4-indodicarbocyanin(1:50 0),和驴antimouse免疫球蛋白结合7-amino-4-methyl-coumarin-3-acetate(1:50)(从杰克逊实验室,从Euromedex购买,法国)。在以下步骤中,组织与兔子anti-NSE标签(1:3000;Polysciences,德国,德国)18 - 20小时。孵化原发性抗血清后,组织被PBS和孵化为2 - 3小时驴antirabbit免疫球蛋白共轭,异硫氰酸荧光素(1:200)。
VIP的特异性抗血清检查是因为preabsorption鼠标anti-VIP 10μM人类VIP导致完全丧失组织免疫反应性。聊天的特异性抗血清和单克隆抗体SP评估。15
标本被认为在奥林巴斯IX 50荧光显微镜下观察配备足够的过滤数据集。照片是黑白摄像机(Mod。4910;Cohu Inc . SL industrial,德国Jena)连接到一个麦金塔计算机通过抓帧器卡(Scion形象,SL industrial)。
识别的神经细胞群
确定的一般编码肌间神经丛,总共20肠肌ganglia分析在每一个准备。anti-NSE抗体是用作一般神经元标记来确定细胞体的总数在肌间神经丛。确定聊天的比例、VIP和SP免疫反应性的人群肠肌层的神经元,四免疫组织化学进行同样的准备。表达阶段确定人口的比例相对于每神经节了无阳性神经元的数量,代表100%的神经元。例如,“聊天/−神经元”的代码是归因于这些免疫反应性的聊天,和“聊天/ SP /−神经元”的聊天和SP免疫反应性的,但不是贵宾。
统计数据
数据表达意思是(SEM)当正态分布或中位数百分位数(25 - 75%),非正态分布的。成对或未配对t测试和单向方差分析(方差分析)采取Bonferroni紧随其后t测试进行比较不同人群。方差分析排名紧随其后的是邓恩的测试执行时数据不是正态分布。相关性进行使用皮尔逊积矩相关。差异p < 0.05时被认为是重要的。
结果
通用编码人类结肠肌间神经丛
坐骑的肌间神经丛和获得与抗体分析了无同时贴上标签,聊天、VIP、SP。这使得描述精确的神经编码的肠肌层的神经元控制组织(图1),以及在组织non-inflamed(图2)和炎症(图3)。
免疫组织化学检测发射机人类控制患者肌间神经丛的编码。四标签与抗体神经元特异性烯醇酶(研究)、胆碱乙酰转移酶(聊天)、P物质(SP)和——血管活性肠肽(VIP)在肠肌神经节显示不同的亚种。神经节与了无标记确定肠肌层的神经元(A)。聊天神经元(B)形成确定的人口最多,通常不是co-localised SP和VIP(箭头)。没有SP阳性神经元(C)和一些VIP阳性神经元(D)被确定在这个神经节。VIP阳性神经元和聊天或没有co-localised SP(箭头)。比例尺:25μm。
免疫组织化学检测发射机在溃疡性结肠炎患者的肌间神经丛non-inflamed地区。四对神经元特异性烯醇酶免疫组织化学(研究)(A)、胆碱乙酰转移酶(聊天)(B)、P物质(SP) (C),和——血管活性肠肽(VIP) (D)透露,类似的聊天阳性神经元的比例被immunorective SP(箭头)或不含SP和VIP(箭头)。此外,VIP阳性神经元和聊天或没有co-localised SP(箭头)。比例尺:25μm。
免疫组织化学检测发射机在溃疡性结肠炎患者的肌间神经丛在发炎的地区。四对神经元特异性烯醇酶免疫组织化学(研究)(A)、胆碱乙酰转移酶(聊天)(B)、P物质(SP) (C),和——血管活性肠肽(VIP) (D)透露,大部分聊天阳性神经元immunorective SP(箭头所指)。一些聊天阳性神经元不包含SP和VIP(箭头)。此外,VIP阳性神经元和聊天或没有co-localised SP(箭头)。比例尺:25μm。
了无阳性神经元的平均数量/ ganglia相似控制患者(21 (3);n = 8)和non-inflamed发炎地区加州大学(17 (3)(n = 6)v21 (2)(n = 9),分别)。
聊天阳性神经元的平均数是35.0(3.0)%了无阳性神经元控制组织(n = 8)。这个比例是类似于观察non-inflamed和发炎地区加州大学(表3)。VIP阳性神经元被发现在同等比例控制样品和来自non-inflamed和发炎的区域(表3)。SP免疫反应性的神经元形成5.9(0.7)%了无阳性神经元的控制。在加州大学,有一个重要的SP阳性神经元的比例增加四倍non-inflamed区(n = 6;p < 0.0001),显著增加三倍发炎区(n = 9;p < 0.0001)与控制(表3)。
为控制和UC患者中,没有发现显著相关病人的年龄和神经化学代码之间聊天,SP、VIP的人口。同样,之间不存在相关性疾病持续时间、炎症级,和比例的人口免疫反应性的聊天、SP、VIP。
亚种群的阶段识别神经元
的不同阶段确定数量如表4所示。根据他们的神经编码,五个不同神经元数量被确定在控制。聊天/−神经元形成了显著的人口最大的胆碱能分组人口了无标记神经元(27%)。/ SP /−聊天,聊天/贵宾/−,VIP /−和SP /−亚种群有相同的比例。没有肠肌层的神经元免疫反应性的聊天/ SP /贵宾或SP /贵宾出席在控制组织。
在加州大学non-inflamed地区确定了七个不同的亚种群。聊天/聊天/ SP /−−神经元和神经元形成最大的亚种群,显示相似的比例。聊天/贵宾/−,VIP /−和SP /−亚种群有相同的比例。很少神经元免疫反应性的聊天/贵宾/ SP和VIP / SP /−。
发炎的地区的加州大学段,聊天/聊天/ SP /−−和神经元形成最大的亚种群,显示比例相等。聊天/贵宾/−,VIP /−和SP /−亚种群形成同样小比例的神经元。聊天/ SP / VIP、SP /贵宾/−亚种群也确定了。
加州大学的亚种群表现出塑性
我们的研究显示比例显著变化的三个阶段确定的亚种。首先,聊天的比例/−non-inflamed地区人口减少了41%和30%在发炎的地区相比,控制组织(表4、图4)。此外,没有观察到的差异在这个人口non-inflamed和炎症之间的区域。其次,聊天/ SP /−人口增加约两个non-inflamed和发炎的加州大学与控制(表4、图4)。对于这个族群,没有发现差异在non-inflamed比例和发炎的地区。第三,SP /−神经元的比例显著增加non-inflamed地区的加州大学:4.2%(第75百分位数(25 - 1.8 - -7.2);p < 0.01;n = 6)和2.4%(第75百分位数(25 - 1.3 - -4.3);p < 0.05;n = 9)发炎地区与控件(0.4%(25 - 75百分位数0.1 - -0.9);n = 8)。
直方图的比例聊天/聊天/ SP /−−和控制和溃疡性结肠炎患者的肠肌神经元non-inflamed和发炎的地区。* * * p < 0.05, p < 0.01与控制。值意味着(SEM)。聊天、胆碱乙酰转移酶;SP, P物质;分析了无,神经元特异性烯醇酶。
讨论
这项研究中,进行整个人类肌间神经丛的坐骑,确定了发射机co-localisation模式神经元控制,UC患者。在加州大学,改变发生在的比例/−聊天,聊天/ SP /−, SP /−人口与控制组织。这些变化是类似的比例在UC发炎和non-inflamed地区。
使用抗体的结合聊天、VIP、SP允许我们描述发射机co-localisation在结肠肠肌层的神经元,显示五个不同的亚种(/−聊天,聊天/ SP、VIP /−聊天,VIP /−和SP /−)和抗原non-immunoreactive神经元的比例进行了研究。最大的神经元数量确定是聊天免疫反应性的(35%),因此可能是胆碱能。这一比例低于报道了波特和他的同事们16他们发现,64%的了无积极肠肌层的神经元在正常的人类结肠免疫反应性的聊天。这些作者维护组织器官型培养四天来增强免疫反应性可能解释这种差异。最大的发现胆碱能群聊天/−肌间神经丛。VIP形成了无总人口的9%,这一比例在人类小肠(类似报告5%17)。多数SP神经元co-localised聊天,也是在人类的直肠黏膜下神经丛12和豚鼠的肌间神经丛。13虽然聊天和VIP标签绝大多数神经元在人类黏膜下神经丛,12日,18这不是真正的人类肌间神经丛(本研究)或豚鼠肠肌丛。13
在加州,有肠肌层的神经元的比例增加三倍,对SP免疫反应性的而聊天和VIP阳性神经元的比例并没有受到影响。因为年龄差异控制病人和UC患者,可以把部分改变观察年龄相关的现象。但是,这是不太可能在控制患者年龄之间没有相关性,观察SP阳性神经元的比例。尽管这种观点必须被小心由于相对较低的患者数量,它是进一步支持约翰逊和他的同事们的工作19谁也没有发现随着年龄的变化在聊天和贵宾的人口。此外,在研究中执行控制和UC患者相同的年龄,显著增加SP在加州大学的内容。20.相比之下,在CD患者年龄相仿的UC患者,没有观察到SP人口的变化。这些观点强烈建议SP在这项研究中观察到的增加和其他是加州大学的一个特点。此外,由于大多数的UC患者皮质类固醇治疗下,我们不能排除这种治疗诱导神经可塑性的事实。然而,这也似乎不太可能最近的一项研究描述表达SP受体信使rna没有发现相关的皮质类固醇治疗和幼稚的UC患者。21日,22
先前的研究已经报道SP免疫反应性的纤维的密度的增加和SP含量在加州大学。这一增长主要是观察在固有层。5,6,20.增加肠肌层的神经元投射到粘膜SP水平可以在一定程度上解释这个观察。在豚鼠肠肌聊天/ SP和聊天阳性神经元的比例预计粘膜23日,24和运作内在感官神经元响应拉伸和各种化学刺激。25日,26因此,肠肌层的神经元投射到人类回肠粘膜被确定。27
未来的研究应该解决的问题SP肠肌层的神经元中观察到的变化是否转录的结果,post-transductional,甚至改变肽运输。事实上,尽管改变运输肽沿着纤维可以解释SP的增加在UC肠肌层的神经元中,似乎不太可能。事实上,SP加州大学和控制患者之间的差异观察孵化后组织16小时在秋水仙碱块轴突运输肽。信使rna水平变化对SP受体已经观察到加州大学22但尚不清楚是否SP mRNA增加肠肌层的神经元或退化的SP是否退化隔间是加州大学的改变。
加州大学的变化在我们的研究中观察到不同的CD。VIP阳性神经元在CD的比例增加(与控制)发炎地区的肌间神经丛11在网站远离炎症的粘膜下神经丛。12此外,没有观察到变化在CD的人口黏膜下神经元对SP免疫反应性的12在神经纤维对SP免疫反应性的。3
增加的SP阳性神经元在加州大学主要发生在聊天/−神经元的人口控制患者的检测。事实上,聊天的总比例阳性神经元不是在加州大学与控制相比,修改和增加的比例聊天/ SP /−神经元相当于减少聊天/−人口的比例在加州大学。神经跟踪方法显示的比例提升肠肌神经元正常结肠环形肌聊天/聊天/ SP /−−和积极和运动神经元函数。28因此,它很容易推测,至少有些神经元兴奋性肌肉运动神经元。事实上,乙酰胆碱和SP刺激小肠蠕动在健康志愿者。29日,30.聊天/聊天/ SP /−−和神经元也可能是内在的初级传入神经元投射到粘膜。25
什么可能是SP增加加州大学的临床意义?首先,SP可能扮演重要的角色在炎症性肠病的病理生理学。31日在加州大学有增加SP结合位点的表达和CD21以及增加神经激肽1受体信使rna (NK-1)。22NK-1卡哈尔上发现的受体细胞,他们可以参与运动性的规定,32在血管和淋巴结构。33在结肠炎动物模型诱导硫酸葡聚糖,NK-1拮抗剂减少结肠炎症。34在同一种动物模型中,炎症诱导SP在肠肌层的神经元合成的增加。35此外,减少中性肽链内切酶(EC 3.4.24.11)活动(降解SP)被观察到旋毛虫感染肠与SP含量增加。36这些组合的影响,增加了SP肽链内切酶的差别水平和对这些活动会导致净增长SP可能有助于控制炎症。
一个令人惊讶的发现是,改变肠肌的神经化学代码神经元发生在类似的比例在发炎和non-inflamed地区。然而,这个结果是一致的数据获得的实验结肠炎动物模型显示类似的功能改变在交感神经支配发炎和non-inflamed网站。37此外,改变能动性在远程观察non-inflamed站点和发炎的地点在UC患者或IBD动物模型。38 -40在UC患者禁食能动性增加与控制。41这可能是由于部分SP增加肠肌层的神经元,它已经表明,有意识的狗增强SP的结肠炎症刺激巨大的迁移宫缩而控制。42SP感应在UC non-inflamed和发炎的地区可能是由于增加炎症细胞因子白介素- 1β等已被观察到在肠道炎症性肠病。1事实上,白介素- 1β诱导大鼠SP表达增加肠肌层的纤维。43
总之,我们的研究表明,显著改变肠肌的神经编码神经元发生在加州大学。聊天/−神经元被确定为假定的神经元人口表现出神经可塑性表达SP。因此,这种改造在加州发生转变,从主要是胆碱能更多的肽能的神经支配。类似的神经编码也被观察到的变化影响最小的网站。这种效应可能构成的一部分改变运动性神经基础干扰加州大学期间观察到的。
确认
这项工作是支持部分由IRMAD (de矫揉造作的des疾病研究所de l 'Appareil餐后酒;阿斯特拉捷利康、法国)和地区委员会的des支付德卢瓦尔河。作者感谢提供的宝贵帮助外科病理学团队和部门。
引用
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