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摘要
背景与目的:基质金属蛋白酶-7 (MMP-7)在上皮-基质相互作用的正常和病理重塑中起重要作用，在胃癌中表达上调。幽门螺杆菌感染是胃癌发生的第一阶段，因此我们的目的是确定是否H幽门胃MMP-7表达上调，是否受菌株毒力影响。
方法:我们在内窥镜下取了胃活检标本H幽门感染(n = 17)和未感染(n = 18)患者，并通过ELISA、实时聚合酶链反应(PCR)和免疫组化(集中于增殖区的上皮细胞)评估MMP-7的表达。我们进行PCR鉴定H幽门为笼子里而且vacA．我们进行了H幽门/细胞系共培养与野生型致病性和非致病性研究H幽门带CagE的应变−和VacA−同基因的突变体。
结果:胃活检标本H幽门+患者在前庭和语体中表达较高水平的MMP-7蛋白和mRNA(例如，通过ELISA:H幽门+ 0.182 OD单位vH幽门−0.059;P = 0.009鼻窦)。上皮细胞H螺杆菌+与未感染患者相比，患者MMP-7染色更强烈，包括在含有多能细胞的增殖区(p<0.03胃窦，p<0.04体)。MMP-7在上皮细胞中被证实在蛋白和mRNA水平上调H幽门共培养。这些实验还表明，MMP-7的上调依赖于一个完整的H幽门cag致病性岛，但不对液泡细胞毒素。
结论:我们推测MMP-7的表达增加H幽门胃炎可能促进胃癌的发生。
- 幽门螺杆菌
- 矩阵metalloproteinase-7
- Cag致病性岛
- 胃癌
- 基质金属蛋白酶
- 基质金属蛋白酶-7(基质溶素)
- FCS，胎牛血清
- PCR，聚合酶链式反应
- 甘油醛-3-磷酸脱氢酶
- Ct，阈值周期
- SDS-PAGE，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
- 酶联免疫吸附试验
- 肿瘤坏死因子α
数据来自Altmetric.com
- 基质金属蛋白酶
- 基质金属蛋白酶-7(基质溶素)
- FCS，胎牛血清
- PCR，聚合酶链式反应
- 甘油醛-3-磷酸脱氢酶
- Ct，阈值周期
- SDS-PAGE，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
- 酶联免疫吸附试验
- 肿瘤坏死因子α
消化性溃疡和胃MALT淋巴瘤的主要原因是幽门螺杆菌，1，2而且H幽门是发生远端胃腺癌的最强危险因素。3.的结果H幽门感染依赖于宿主，4环境、5还有细菌因素。6，7具有cag致病性岛编码IV型细菌蛋白分泌系统，8 -11更容易引起炎症和疾病，6那些产生VacA活性形式的细胞也是如此，VacA是一种在体外诱导细胞质空泡形成的孔隙形成毒素。12 -15
基质金属蛋白酶(MMPs)是一个不同的锌依赖蛋白水解酶家族，在维持和重塑上皮细胞和基底膜之间的相互作用中起重要作用。16它们具有多种底物，包括胶原蛋白和弹性蛋白，在促进癌细胞侵袭和转移中发挥重要作用。基质金属蛋白酶还裂解细胞表面结合的底物(“sheddase”活性)，如膜结合细胞因子、细胞因子受体和粘附分子，释放可溶性或非活性形式。MMP-7(基质溶素)是MMP家族中最小的成员，也是基质溶素亚类的一部分。在胃癌上皮细胞中表达上调。17 -21MMP-7降解各种基质底物，包括蛋白多糖、明胶和弹性蛋白，并从细胞表面非基质底物中裂解，包括e -钙粘蛋白、促肿瘤坏死因子α (TNF-α)和Fas配体。22日-26越来越多的证据表明，MMP-7在结直肠癌的肿瘤发生中起早期作用。MMP-7缺失的Min小鼠结肠肿瘤形成明显减少，27MMP-7转录本在人类和小鼠模型中90%以上的结肠腺瘤的肿瘤上皮中发现。27，28
在这里，我们检查了MMP-7是否在H幽门胃炎，因为这是胃癌发展的第一阶段。我们证明了H幽门在mRNA水平上调MMP-7的表达，MMP-7在炎症细胞和上皮细胞中表达上调，后者在含有多能性细胞的增殖区表达上调至关重要。我们发现这种上调是由致病性菌株引起的H幽门，并且依赖于cag致病性岛，但不上毒素，VacA。
方法
体内研究
患者和活检样本
患者从诺丁汉大学医院的日常内窥镜病例列表中招募。如果患者在过去四周内服用了质子泵抑制剂、抗生素或含铋化合物，则不包括在内。这项研究得到了诺丁汉大学医院伦理委员会的完全伦理批准。患者人口统计资料详见表1。胃活检标本取自胃窦和胃体，立即冷冻于液氮中，用于RNA提取和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析。相邻活检置于福尔马林中进行常规组织学分析和MMP-7免疫组化。前庭和身体的进一步邻近活检用于快速脲酶检测(Clotest;Ballard Medical Products, Draper, Utah, USA)，并置于添加5%胎牛血清(FCS)的等敏培养基(Oxoid, Basingstoke, UK)中H幽门文化。
MMP-7 ELISA
使用Quantikine人MMP-7(总)酶联免疫吸附测定试剂盒(R&D Systems, Abingdon, UK)评估前10例胃窦活检中的总MMP-7H幽门阳性患者11例H幽门消极的病人。活检组织在液氮中快速冷冻，使用Ultra-Turrax T50均质器(Becton Dickenson, Oxford, UK)在1 ml 20 mM HEPES中均质30秒，并添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒(P8340, Sigma Aldrich, Dorset, UK)。使用重组人MMP-7根据制造商的说明制备标准曲线。在运行样本之前进行的加标试验表明，在活检中存在的浓度没有明显的干扰。所有ELISA评分均按A280最初的活检匀浆。
RNA提取
使用Qiagen RNeasy试剂盒(Crawley, UK)和额外的DNAse消化从胃窦和胃窦活检中提取总RNA(26例患者)。活检最初与ELISA一样均质。RNA产量和纯度使用GeneQuant pro RNA/DNA计算器(Biochrom;Amersham Pharmacia-Biotech, Chalfont St Giles, Bucks，英国)。
实时半定量PCR和分析
RNA使用Qiagen Omniscript逆转录酶试剂盒，附加RNase抑制剂(10个单位/反应)和1 μM pdN6盐随机六聚体引物(Pharmacia, Amersham, UK)进行逆转录。在37°C下进行逆转录1小时，然后在93°C下进行5分钟，使逆转录酶失活。每个样本均采用阴性对照(不含Omniscript逆转录酶和随机六聚体引物)。实时聚合酶链式反应(PCR)使用quantitative SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen)进行，使用GeneAmp 5700序列检测系统(Applied Biosystems, California, USA)，每次反应0.5单位尿嘧啶- n -糖基化酶和MMP-7 (5 ' AGCCAAACTCAAGGAGATGC3 '和5 ' ACTCCACATCTGGGCTTCTG3 ')和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH) (5 ' GGTGAAGGTCGGAGTCAACGGA3 '和5 ' GAGGGATCTCGCTCCTGGAAGA3 ')的特异性核苷酸引物。PCR条件如下:50°C持续2分钟，95°C持续15分钟，94°C(15秒)，56°C(30秒)，72°C(1分钟)，40个循环。MMP-7 cDNA扩增相对表达量，ΔCt (vGAPDH)用公式2计算Ct (GAPDH) - Ct (MMP-7)其中Ct(阈值周期)表示荧光通过固定阈值的分数周期数。29日,30.在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，确定了正确的PCR产物尺寸。
免疫组织化学
胃活检标本在甲醛盐水中固定24小时，随后进行处理并石蜡包埋。每个活检组织以4 μM进行切片，有足够的切片以允许一个阴性对照，并以1:80稀释的MMP-7特异性单克隆抗体进行染色(癌基因研究产品公司，剑桥，英国;猫No OM71)。切片在Dako ChemMate显微镜载玻片(间隙75 μM)上提取，以便在Dako TechMate 500 Plus自动染色机上进行免疫过氧化物酶染色(Dako, Ely, Cambs, UK)。先前对每个抗体进行了染色优化(包括预处理)，并使用标记链霉亲和素生物素技术，以二氨基苯为显色剂检测抗原的定位。阴性对照采用相同的程序(包括前处理)，但仅用稀释剂替换一抗。
简单地说，该过程需要用10 mM柠檬酸缓冲液(pH值6.0)进行微波抗原提取。所有染色均在室温下进行，一抗孵育1小时。
染色评估
两名观察员(AZ，一位经验丰富的组织病理学家和JB)评估了MMP-7染色强度。初步观察表明，不同活检区域的染色强度不同，取决于距离表面上皮的深度。我们对增殖区的染色特别感兴趣，所以我们对这里，浅层和深层的染色强度进行了分级。通过将浅表细胞和基质细胞之间的区域分成三份来定义区域。染色强度分为0(未染色)到4(强烈染色)。两个观察者都对H幽门个体状态和他们分别评分玻片:初始评分达到95%的一致性。不一致的结果是通过联合审查解决的，同样，两个评分者都不知道H幽门的地位。每个视野视图(跨越所有三个区域)还计算了多达200个炎症细胞(存在的地方)，并计算了表达MMP-7的百分比。
H幽门培养和PCR分型笼子里而且vacA
胃活检在1小时内被镀上5%马血琼脂板，并在5% CO中放置5天237°C恒温箱。殖民地的H幽门经形态学、革兰氏染色和脲酶检测鉴定，并在−80°C冷冻前进行克隆扩增。基因组DNA提取如前所述31并对菌株进行PCR分型笼子里，是存在的可靠标志cag致病性岛(5 ' AAGGGTAAAGAAATGGGACTGAAT 3 '和5 ' GGAAGCGTGATAAAAGAGCAATGT 3 '，条件为95°C 2分钟，95°C 1分钟，56°C 2分钟，72°C 4分钟，72°C 5分钟)和vacA(信号和中间区域，如前所述32岁的33)．所有PCR反应均在Hybaid热循环仪上进行。
的定义H幽门状态
为了本研究的目的，患者被认为感染了H幽门如果培养呈阳性，或者在培养呈阴性的情况下，如果组织学显示有特征性生物，并且Clotest快速脲酶试验呈阳性。
体外研究
H幽门菌株
共培养实验采用以下菌株:60190 (ATCC 49503，cagPaI+，vacAs1m113)， Tx30a (ATCC 51392，cagPaI−，vacAs2 / m213), 60190笼−（笼−60190的插入等基因突变体vacAs1 / m1) 60190 vaca−（cagPaI+,中断vacA−插入突变体6019034)．突变株60190CagE−是由笼子里（picB突变体84-183:pMT3:公里．35一个包含中断的3.4 kb片段笼子里84 ~ 183位点PCR扩增pTM3:公里并克隆到pGEM T-Easy(从Promega Corp.， Southampton, UK)中创建pRT1。染色体笼子里将60190株的基因替换为被破坏的基因笼子里通过pRT1进行基因自然转化，然后进行等位基因交换和卡那霉素标记挽救。PCR分析和Southern blotting证实置换笼子里被破坏的等位基因。我们证实突变株表型为零cag编码IV型分泌系统，结果表明，与野生型相比，它刺激上皮细胞系表达白细胞介素8的能力显著降低，并且不诱导上皮细胞中的CagA磷酸化(数据未显示)。突变株60190VacA−已经在前面描述过。34
细菌coculture
H幽门菌株60190,Tx30a和CagE−和VacA−60190的等基因突变体13日,34用5%的马血琼脂板(Oxoid)在5%的CO237°C恒温箱。HT29细胞(一种人类结肠腺癌细胞系，从欧洲组织培养集合中获得)保存在添加了5% FCS的Dulbecco改良Eagle培养基中。共培养48小时H幽门在75 cm2组织培养瓶使最终活菌:上皮细胞的比例约为100:1。组织培养瓶置于5% CO中237°C孵育24小时。然后抽吸上清，用于免疫印迹和酶谱，细胞球用于RNA提取。
免疫印迹和酶谱分析上清液
用免疫印迹和酪蛋白酶谱分析等量未处理(培养基)和细菌处理的上皮细胞上清液中MMP-7的存在。对于免疫印迹，样品与十二烷基硫酸钠(SDS)运行缓冲液混合，煮沸并离心，然后应用于12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。用于印迹，SDS-PAGE凝胶在150 mA的PVDF膜上印迹1小时，在磷酸盐缓冲盐水-0.5% Tween和5%脱脂奶粉(Oxoid)中堵塞1小时，然后用一抗(单克隆抗mmp -7;癌基因研究产品公司，诺丁汉，英国)过夜，用过氧化物酶偶联山羊抗鼠IgG抗体(Sigma-Aldrich)清洗和孵育，清洗，然后使用ECL系统(Amersham Pharmacia-Biotech)开发。对于酪蛋白酶谱，样品与SDS样品缓冲液(Novex;Invitrogen, Paisley, UK)，应用于4-16%蓝色酪蛋白酶谱凝胶(Invitrogen)，并使用制造商推荐的缓冲液运行。运行后，将凝胶放置在恢复缓冲液中，并在显像缓冲液中孵育一夜(两种缓冲液均来自Invitrogen)。蛋白酶活性区域呈现为蓝色背景上的白色条带，并使用数码相机拍摄。
RNA提取和实时PCR分析
RNA提取、定量和实时PCR分析以与体内研究相同的方式进行。
统计分析
所有统计分析均使用GraphPad Prism统计包。采用Mann-Whitney U检验比较组织学分级的中位数评分。T检验用于比较mRNA ΔCt值和ELISA值。
结果
我们首先旨在评估MMP-7在胃粘膜中的表达是否被上调H幽门感染。为此，我们对胃活检标本匀浆进行了总MMP-7的特异性ELISAH幽门感染病人和未感染对照病人MMP-7在感染和未感染的胃粘膜中均有表达，在感染和未感染的胃粘膜中均有表达H幽门感染患者(平均ELISA评分(SEM):H螺杆菌+(n = 10) 0.182 (0.045)vH螺杆菌−(n = 11) 0.059 (0.016);P = 0.009，未配对t测试)。确认这些结果并评估是否H幽门感染在转录水平上调了MMP-7的表达，我们从活检标本中提取总RNA，逆转录，并使用实时PCR定量水平。活检的H幽门感染患者的两种胃窦均表达较高水平的mmp - 7mrna (ΔCt (SEM):H幽门+ 0.038 (0.01) (n = 12)vH螺杆菌−0.008 (0.003) (n = 13);P = 0.007，t测试)和语料库(H幽门+ 0.044 (0.021) (n = 12)vH螺杆菌−0.005 (0.002) (n = 13);P = 0.07)。我们有更多的样本用于RNA分析，而不是ELISA，因为RNA提取是首先进行的，如果这是不成功的，则使用原本用于ELISA的活检。
我们对MMP-7上调的主要兴趣在于其对胃腺癌发病机制的影响。因此，我们的目标是首先评估上调是否发生在上皮细胞，其次是否发生在增殖区，其中包含胃干细胞。为此，我们使用一种特异性抗MMP-7单克隆抗体对胃窦和胃体的活检标本进行了MMP-7免疫组化，并评估了增殖带上皮细胞的上皮染色强度。在胃活检标本中，增殖区上皮细胞的染色强度评分明显较高H幽门感染患者比未感染患者(中位数评分(四分位范围):上颌窦H幽门+ 3 (3 - 4)，H幽门−3 (2-3);语料库H幽门+ 3 (2-3.5)，H螺杆菌−2(2 - 2.5))，在前庭(p = 0.03 Mann-Whitney U检验)和主体(p = 0.04)(图1A, B)。图2清楚地说明了这一点H幽门感染患者(图2A)，而非感染患者(图2B)。浅层和深部染色强度有增加的趋势H幽门感染患者，但这些没有达到统计学意义(数据未显示)。炎症细胞MMP-7的表达也具有潜在的重要性，因为炎症细胞释放的MMP-7可能对邻近的上皮细胞产生旁分泌作用。因此，接下来我们评估了MMP-7在炎症细胞染色中的比例H幽门+和H螺杆菌−活检标本。在H幽门+活检标本，大多数炎症细胞MMP-7阳性H幽门−大多数活检标本未染色(平均(SEM) %炎症细胞MMP-7染色阳性:胃窦，H幽门+ 87.4 (2.8)vH螺杆菌−29.9 (4.1)， p<0.01t测试;语料库,H幽门+ 80.4 (2.7)vH幽门−38.6 (4.4)，p<0.01)。
上颚腔(A)和下颚体(B)增殖区上皮细胞染色等级(0-4)的点状图幽门螺杆菌+和H幽门−病人。成绩更高的是H幽门胃窦感染(p = 0.03 Mann-Whitney U检验)和体部感染(p = 0.04)。
胃窦活检检测基质金属蛋白酶-7 (MMP-7)幽门螺杆菌感染患者(A)和未感染患者(B)。注意上皮细胞内MMP-7的强烈染色(特别是在增殖区，箭头所示)和炎症浸润(A)。
由于MMP-7之间表达水平的差异H幽门+活检标本，特别是在上皮细胞表达方面，我们接下来询问不同毒力的菌株是否与不同水平的MMP-7表达相关。为此，我们进行了评估笼子里地位和vacA类型的H幽门从胃窦活检标本中培养的分离株与MMP-7表达相关。不幸的是，只有三种菌株笼子里但通过MMP-7 ELISA检测，笼子里阳性菌株诱导较高水平的MMP-7表达笼子里负应变(平均(SEM):笼子里+ 0.218 (0.06)， n = 7;笼子里−0.099 (0.019)，n = 3;P = 0.25，未配对t测试)。之间无明显差异笼子里+和笼子里-菌株实时PCR或免疫组化。vacA基因分型结果为2 s1/m1、6 s1/m2、1 s2/m2和1 s2/m1 (ELISA和real - time PCR)。不足为奇的是，鉴于数量较少，MMP-7的表达没有显著差异。
准确定义细菌毒力因子在诱导MMP-7表达中的作用，并确认毒力因子的作用H幽门对上皮细胞MMP-7表达的影响，我们接下来使用一组小鼠进行了一系列共培养实验H幽门等基因突变株和上皮细胞系HT29。我们选择了HT29细胞系，因为已知它在适当的刺激下表达MMP-7。36首先，我们分析了致病性和非致病性的影响H幽门MMP-7表达的影响。后HT29上清的免疫印迹分析H幽门与mmp -7共培养后，共培养显示了29 kDa的免疫活性条带(pro-MMP-7的预测大小)cag空泡呈阳性的菌株60190，与菌株共培养后无条带cag非空泡化菌株Tx30a阴性，或为无细菌共培养的对照细胞。接下来，我们定义了空泡细胞毒素VacA的贡献cagPAI编码IV型分泌系统，通过比较其VacA−等基因突变体(不表达全长或截断的VacA)和CagE−等基因突变体(不表达功能性的VacA)对野生型60190 HT29细胞MMP-7表达的影响cag编码IV型分泌系统)。我们发现VacA -突变体与亲本菌株具有相同的效果，表明VacA对该效果不需要。相比之下，与CagE共培养−突变体未诱导MMP-7表达，表明该效应依赖于cagPAI编码IV型分泌系统(图3A)。为了证实这些结果，并证明29 kDa proMMP-7带具有MMP-7活性，我们对相同的样品进行了酪蛋白酶谱分析。酶谱显示在相同大小的蛋白质下酪蛋白溶解活性，菌株60190及其VacA的活性增加−与等基因突变株相比，两株缺乏完整的突变株cag致病性岛(Tx30a和60190CagE−)(图3B)。最后，为了进一步证实我们的结果，并评估MMP-7是否在转录水平上上调(与我们的体内研究一样)，我们对共培养HT29细胞的RNA制剂进行了实时PCR。与预期的一样，在与拥有完整基因的菌株共培养后，MMP-7 mRNA的表达达到最高水平cagPAI, 60190, 60190VacA−(图4)。
(A) HT29细胞上清液与幽门螺杆菌60190株、Tx30a株及60190株CagE−和VacA−等基因突变体共培养后的代表性基质金属蛋白酶-7 (MMP-7)免疫印迹。与60190和60190VacA−共培养时，可以看到约29 kDa的带。这与pro-MMP-7的预测大小相对应。未处理的细胞、非致病性菌株Tx30a和CagE−等基因突变体60190均未见条带。等体积的上清液加载到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(n = 4)。(B)具有代表性的酪蛋白酶谱显示60190和60190VacA−的强度带增加。这条29 kDa的条带对应于pro-MMP-7的酪蛋白溶解活性。
通过实时聚合酶链反应获得的HT29细胞裂解物的基质金属蛋白酶-7 (MMP-7) mRNA值(平均(SEM)阈值循环(ΔCt)，校正甘油醛-3-磷酸脱氢酶)幽门螺杆菌菌株。未处理的对照组将未接种的培养基添加到HT29细胞中(每次实验n = 3-5)。株间差异没有达到常规的统计学意义，但与蛋白质数据有相似的趋势。
讨论
我们已经证明了H幽门在体内和体外，感染导致上皮细胞中MMP-7的上调，这依赖于一个完整的cag致病性岛。MMP-7是一种重要的金属蛋白酶，在胃癌中表达上调。它通过降解细胞外基质促进各种癌症的组织侵袭和转移。有趣的是，它最近也被证明具有潜在的促癌作用，通过其“sheddase”活性，可能导致恶性转化。最近描述的MMP-7脱落酶活性底物包括E-cadherin, Fas配体和tnf -α前体。e -钙粘蛋白是一种重要的细胞粘附分子，是上皮细胞间粘附连接的重要组成部分。37E-cadherin在种系和体细胞水平的变化与肠道和弥漫性胃癌相关。38 -40Fas配体在细胞凋亡中起重要作用，是其发生机制之一H幽门被认为是通过破坏细胞增殖和凋亡之间的平衡而诱发胃癌的。41 -43TNF-α是一种促炎细胞因子，在体内被诱导H幽门．44慢性炎症状态的诱导易导致胃萎缩和胃上皮癌前病变。41通过激活或改变这些重要的致癌或炎症分子H幽门可能对胃癌的发生很重要。
我们使用等基因突变体的工作清楚地证明了完整的cagMMP-7上调中的致病性岛。MMP-7基因表达上调的机制可能是复杂的，因为启动子区域容易受到许多控制;45MMP-7的转录依赖于各种信号通路，包括β-catenin信号通路36岁,46以及Ets转录因子的PEA3成员的激活。47CagA的易位和磷酸化刺激MAP激酶cag编码IV型分泌系统本身刺激核因子κB活化和白介素8转录。48岁的49需要进一步的工作来确定哪些途径是负责任的幽门螺旋杆菌cag介导的MMP-7诱导。我们的大多数患者菌株都是笼子里+，但活检中MMP-7的表达存在相当大的异质性，因此明显存在其他因素cag状态可能是MMP-7上调的重要因素，体内情况可能与体外情况不同。
一些研究小组检测了MMP-7在胃癌中的表达，但对MMP-7在正常(非恶性)组织中的表达有相互矛盾的报道。17 -20.我们使用明确的针对重组人MMP-7的单克隆抗体，清楚地证明MMP-7在发炎的胃粘膜中表达，在非发炎的非恶性胃粘膜中表达程度较低，我们通过mRNA分析证实了这些发现。重要的是，对于在癌发生中的潜在机制作用，我们还表明在细胞间的增殖区存在主要差异H幽门感染者和未感染者对这一多能区域内细胞的影响可能是癌变所必需的。
有相当多的证据支持MMP-7在结直肠癌早期阶段的作用。27，50诱导MMP-7H幽门诱导性胃炎是胃腺癌发病途径的初始阶段，41可能具有重要的致病性。未来治疗和预防胃癌的策略可能包括使用金属蛋白酶抑制剂。了解是什么刺激这些致癌促炎蛋白增加了我们目前在这一领域的知识。H幽门MMP-7介导的刺激是细菌潜在的重要致癌作用。
致谢
J Bebb获得了威康信托基金(入门级)和医学研究理事会(临床培训奖学金)的资助。John Atherton是医学研究委员会的高级临床研究员。