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摘要
背景:粘液层保护胃肠道粘膜免受机械、化学和微生物的挑战。黏蛋白2 (Mucin 2)是肠上皮细胞分泌的最主要的黏蛋白。越来越多的证据表明，上皮下肌成纤维细胞调节肠上皮细胞功能，是前列腺素(PG)的重要来源。PG可促进黏液蛋白分泌，是保护黏液的关键分子。细菌发酵产物在这些过程中的作用值得进一步关注。
目的:因此，我们确定短链脂肪酸(SCFA)对muc2表达的影响是否涉及中间PG的产生。
方法:通过上皮细胞和肌成纤维细胞的单培养和共培养，研究了SCFA对muc2表达和PG合成的影响。细胞培养上清液用于确定肌成纤维细胞来源的前列腺素在增加上皮细胞muc2表达中的作用。
结果:前列腺素E1(铂族元素1)被发现比PGE更有效2刺激muc2的表达。SCFA支持粘膜保护PG，反映为PGE增加1/铂族元素2在单培养和共培养中，肌肉成纤维细胞上清液的比例和muc2表达的增加。与吲哚美辛孵育后发现后者由PG介导。
结论:SCFA可差异调节PG的产生，从而刺激肠道上皮细胞muc2的表达。这种涉及肌成纤维细胞和上皮细胞功能相互作用的机制可能在细菌发酵产物的粘液保护作用中发挥重要作用。
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- 粘蛋白
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- IBD，炎症性肠病
- 考克斯cyclo-oxygenase
- 非甾体抗炎药
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- MC,单一
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- 短链脂肪酸
- muc2黏蛋白2
- BLU，光单位
数据来自Altmetric.com
慢性复发性粘膜炎症是炎症性肠病(IBD)的一个标志。IBD患者肠黏膜促炎细胞因子浓度显著升高。1 -3.局部产生促炎细胞因子可能损害肠屏障的完整性(例如，增加上皮的通透性和改变粘液的产生和质量)。4 -8黏液层在肠管腔与固有层之间的上皮层上形成物理-化学屏障，具有清除膳食抗原和微生物抗原的重要功能。上皮细胞分泌粘液可受多种生理和免疫介质的影响，如前列腺素(PG)。9，10现在已经证实，上皮细胞的功能(例如，增殖、分化、分泌和运动)是由肌成纤维细胞调节的，肌成纤维细胞在上皮细胞下形成一层薄薄的细胞。11 -15这些肌成纤维细胞是PG的重要来源，因此可能在粘膜保护中发挥关键作用。肌成纤维细胞组成性地表达环加氧酶(COX)-1，而在炎症期间，COX-2被诱导，这些酶负责前列腺素E1(铂族元素1)和PGE2生产。12，13，16，17使用非甾体抗炎药(NSAIDs)抑制COX可导致有害的副作用，如诱导胃肠道病变。18，19PGE的管理1这方面的类似物被认为支持粘膜保护。20.21肠道菌群中的某些细菌对肠道健康有益。除了免疫调节能力外，这些细菌还可以改善粘膜屏障的完整性。22肠道菌群代谢产物的黏膜保护作用值得进一步研究。短链脂肪酸(SCFA)是微生物发酵不可消化的碳水化合物的最终产物，据报道可以增加粘液分泌。23日,24短链脂肪酸被远端回肠和结肠吸收，尤其是丁酸盐是上皮细胞的重要营养来源。23日,25丁酸盐因其促进粘膜修复、诱导分化、抑制炎症和肿瘤生长而受到广泛关注。25日,26因此在本研究中，我们确定了SCFA对PGE的影响1和铂族元素2并评估了上皮粘蛋白2 (MUC-2)表达的意义。为此，我们使用共培养模型来表示上皮细胞和间充质细胞之间的空间相互作用。8日,14，27
材料与方法
细胞培养
将肠上皮细胞T84(传代57-64)和LS174T(传代110-120)(ATCC, Manassas, USA)细胞或肠肌成纤维细胞CCD-18Co(传代10-14)的单层(MC)培养于24孔或96孔组织培养板(Corning BV, Acton, USA)中。与MC平行，共培养(CC)通过直接在CCD-18Co细胞融合层上培养上皮细胞建立，如前所述。8简单地说，CCD-18Co细胞以两倍稀释的浓度在培养板中播种，并在一周内融合生长。T84和LS174T细胞以五倍稀释的浓度添加在CCD-18Co层(CC)上或在单独的平板(MC)中。细胞用DMEM/F12谷氨酰胺I (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, USA)、青霉素(100 IU/ml)、链霉素(100 μg/ml) (Invitrogen Life Technologies)和5%热灭活胎牛血清(Invitrogen Life Technologies)培养。Medium每两天更新一次。当上皮细胞层生长融合时使用CCD-18Co单层，而当上皮细胞层生长未融合时使用CC和MC。
PG或SCFA刺激CC和MC
CCD-18Co单分子膜或MC/CC T84或LS174T在乙酸、丙酸或丁酸(VWR International, West Chester, USA)浓度范围(0.025-4.0 mM)中孵育24小时。为确定PG对muc2表达的影响，将MC/CC T84与0.01 ~ 100 ng/ml PGE孵育24小时1或铂族元素2(溶解于100%乙醇，稀释至1mg /ml的磷酸盐缓冲盐水，并储存在−80°C, Sigma-Aldrich BV，圣路易斯，密苏里州，美国)。此外，用丁酸刺激24小时的CCD-18Co上清液在有无10−6吲哚美辛(阻断前列腺素产生;Sigma-Aldrich BV)转移到MC T84。收集上清液和/或细胞，检测PG浓度或muc2表达。
斑点印迹muc2
我们使用点印迹技术来确定muc2在细胞培养中的表达，因为黏蛋白是非常大的糖蛋白(超过500 kDa)，这使得它们很难在西方印迹技术中处理。28，29我们使用抗hcm(人结肠粘蛋白)抗体，对抗从粘膜刮片中纯化的粘蛋白，它可以识别结肠杯状细胞中muc2的肽表位。28我们的方法通过免疫前血清(T84染色阴性)、阴性对照细胞(CCD-18Co)和牛血清白蛋白进行验证。细胞样本在laemmli(蛋白质分离缓冲液)中收集，蛋白质测定使用DC蛋白测定法(Biorad, Hercules, California, USA)，根据制造商的方案进行少量修改。样品(0.3 ~ 0.7 ~ 1.0 μg/2 μl)分布在硝化纤维膜上(Schleicher and Schuell, Riviera Beach, USA)。膜在TBST/5% Protivar (Nutricia Roetermeer，荷兰)中被阻断，然后用抗muc -2抗体(由荷兰鹿特丹伊拉斯谟大学Einerhand博士慷慨捐赠)孵育一小时。清洗后，用山羊抗兔-山葵过氧化物酶(Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, USA)培养印迹，并使用ECL (Roche Diagnostics Indianapolis, Indiana, USA)进行底物检测。使用Lumi-Imager (Roche Diagnostics)进行密度测量，信号以光单位(BLU)表示。BLU相对于对照孵育也有表达(%BLU)。SCFA与MC和CC同时孵育，在同一个斑点印迹中分析muc2的表达。为了比较SCFA对MC和CC中muc2表达的刺激作用，我们扣除了muc2的基础表达水平。
PGE的测量1和铂族元素2
用elisa法分析CCD-18Co的上清液用于PG生产1(R&D，美国明尼阿波利斯;21%与PGE交叉反应2)和PGE2(Biotrak Amersham生物科学公司，皮斯卡塔韦，美国;4%与PGE交叉反应1）.30.SCFA培养期间测量的浓度相对于基础分泌物表示。的铂族元素1/铂族元素2计算比例，以确定向更具粘膜保护作用的PG剖面的转变。
生存能力的测量
由于SCFA已被报道在高剂量下具有细胞毒性，我们使用WST-1法测定了CCD-18Co、MC和CC的活力(罗氏诊断)。培养24小时后，更新培养基，用WST-1培养细胞。MC和CC 1小时后，CCD-18Co 3小时后，在分光光度计(Biorad)上清液中，用A450-A655测定100 μl样品。
数据分析
所有数据均以均值(SEM)表示。采用spss10软件进行单因素方差分析。
结果
PG作用后MC/CC T84 muc2的表达
T84或CCD-18Co匀浆的蛋白质滴定显示T84 muc2阳性，而正如预期的那样，CCD-18Co在斑点杂交分析中呈阴性(图1A)。PGE的差异效应1和铂族元素2CC T84对muc2表达的影响在代表性斑点印迹中显示(图1B)。密度测定结果显示PGE可刺激MC和CC T84中muc2的表达1而不是PGE2(图1 c)。PGE孵育24小时后，MC和CC T84中muc2的表达均呈剂量依赖性升高1(1 - 100 ng / ml;p<0.002)而PGE2在CC T84培养物中，最高剂量(10-100 ng/ml;p < 0.01)。
T84单培养(MC)/共培养(CC)中黏蛋白2 (muc2)表达的前列腺素刺激。(A)斑点杂交分析显示MC T84细胞muc2阳性，而CCD-18Co阴性。(B)前列腺素PGE作用的代表性斑点印迹1和铂族元素2CC T84细胞muc2表达的影响。(C)密度分析显示PGE1增强MC和CC T84中muc2的表达(1 ~ 100 ng/ml;**p<0.002)而PGE2仅轻微影响CC T84 muc2表达(10-100 ng/ml;* p < 0.01)。muc2表达相对于对照(%BLU)。
SCFA对PGE的影响1与铂族元素2
未刺激的CCD-18Co上清中PGE含量较高2比铂族元素1(633 (371)v891 (437) pg/ml;p<0.05, n = 6)，丁酸盐对PGE有明显的增强作用1降低PGE2所有剂量组的浓度(图2A;p < 0.01, p < 002)。醋酸盐和丙酸盐的孵育也有同样的趋势。因此，PGE1/铂族元素2SCFA孵育后比例增加(图2B;p < 0.01, p < 0.002)。培养PGE的培养基水平1和铂族元素2低或无法检测。在添加PG的丁酸盐培养基中测量的PG水平与添加PG的培养基对照无差异。此外，根据WST分析(数据未显示)，没有一种培养会影响细胞活力。
短链脂肪酸(SCFA)增加前列腺素PGE1/铂族元素2CCD-18Co生产的比例。(A)丁酸盐增加PGE1PGE降低2浓度(*p<0.01， **p<0.002);醋酸盐和丙酸盐也有相同的趋势。前列腺素的生产相对于对照组(%对照)。(B) SCFA增加了PGE1/铂族元素2比率(n = 5;*p<0.01， **p<0.002)，导致首选的粘膜保护剖面。
SCFA培养后MC和CC T84或LS174T muc2的表达
T84和LS174T细胞直接在CCD-18Co单分子膜上培养，检测muc2的表达。与MC T84相比，CC T84中muc2的基础表达显著升高，而CC LS174T中muc2的表达与MC相比没有增加(图3;p < 0.05)。
T84共培养(CC)与T84单培养(MC)相比，mucin 2 (MUC-2)表达增加。T84细胞与CCD-18Co共培养时muc2基础表达增加，而LS174T细胞与CCD-18Co共培养时muc2基础表达不明显(n = 4， *p<0.05)。BLU，光单位。
除丙酸对MC/CC T84细胞的影响外，SCFA对CC中muc2表达的增强作用均高于MC (p<0.05)。丙酸和乙酸能有效诱导MC和CC细胞中muc2的表达(图4A, B;p < 0.01, p < 0.002)。丁酸可刺激MC/CC T84和CC LS174T中muc2的表达，但在MC LS174T中无明显影响(p<0.01, p<0.002)。由于肠上皮细胞可能比上皮下肌成纤维细胞暴露于更高水平的SCFA，我们在上皮粘蛋白表达研究中使用了更广泛的浓度范围。WST数据显示，这些SCFA浓度对MC和CC均无毒性(数据未显示)。
短链脂肪酸(SCFA)增加了T84和LS174T单培养(MC)和共培养(CC)中mucin 2 (MUC-2)的表达。(A, B)与单纯的上皮单层膜相比，在CCD-18Co存在时，SCFA对muc2表达的刺激更为明显(p<0.05)。醋酸和丙酸剂量依赖性地增加MC/CC T84 (n = 4)和MC/CC LS174T (n = 3) muc2的表达(*p<0.01， **p<0.002)。丁酸对MC/CC T84和CC LS174T细胞均有效(p<0.01, p<0.002)，但对MC LS174T细胞muc2表达无促进作用。通过对MC或CC的基础表达量进行推导，得到muc2的表达量。
MC T84与CCD-18Co上清孵育后muc2的表达
与MC相比，SCFA在CC中对muc2表达的刺激程度更高。因此，我们测试了共培养中的黏蛋白表达是否受到CCD-18Co衍生PG的调控，方法是用吲哚美痛阻断PG的产生。在存在或不存在消炎痛的情况下，用丁酸刺激CCD-18Co上清液孵育的MC T84中muc2的表达见图5A。密度分析显示丁酸盐可增强MC T84中muc2的表达(图5B;1 mM, p<0.002)。用CCD-18Co上清液培养T84，在低丁酸盐剂量下增加了muc2的表达，这表明CCD-18Co衍生的可溶性介质(0.5-1 mM;p < 0.002)。丁酸效应被发现是由来自CCD-18Co和T84的PG介导的，因为吲哚美痛完全阻断了muc2表达的刺激(0.5-1 mM;p < 0.01)。在另外的分析中，我们证实吲哚美辛降低了丁酸刺激的CCD-18Co培养上清液(PGE)中的PG浓度1(p < 0.02);铂族元素2(p < 0.02);n = 5)。用丁酸、醋酸或丙酸孵育的MC T84中增强的muc2表达也被吲哚美辛取消(数据未显示)。
丁酸对Mucin 2 (Mucin 2)的刺激是由前列腺素介导的。(A)在存在或不存在吲哚美辛的情况下，与丁酸刺激过的CCD-18Co上清液孵育的T84中muc2表达的代表性斑点斑点。(B)四种不同实验的密度分析。丁酸盐对muc2表达的刺激被发现是由CCD-18Co和T84衍生的前列腺素介导的，因为吲哚美辛(indo)阻断了这种效应(0.5-1 mM;组合p < 0.01)。CCD-18Co上清液(sup)在较低丁酸浓度(0.5-1 mM;**p<0.002)与丁酸盐(1 mM;* * p < 0.002)。
讨论
细菌发酵产物可能发挥重要的粘膜保护作用，是肠上皮细胞的能量来源和刺激粘液蛋白分泌。23 -25丁酸灌肠已被发现可减轻溃疡性结肠炎患者的临床症状，结肠中高浓度的丁酸盐可预防结肠癌。31日,32此外，PG与维持粘膜完整性有关，正如观察到的PGE1研究发现类似物可预防非甾体抗炎药诱导的胃十二指肠病变的形成。20.21
我们的数据揭示了PGE的差异效应1和铂族元素2影响muc2在上皮细胞中的表达。铂族元素1和铂族元素2是T84和LS174T细胞和大鼠结肠分泌粘液蛋白的已知刺激物。29日,33岁的34在我们的实验中，PGE1比PGE更有效2增强muc2表达。黏蛋白在细胞内的表达是合成和分泌的净效应。这意味着PGE1而不是PGE2孵育可合成净muc2。据我们所知，PGE的作用1关于粘蛋白合成的研究以前没有研究过;然而，一个PGE1类似物已被报道可增加胃上皮细胞内黏液含量。35我们的铂族元素2数据与dmPGE的研究一致2HT29-18N2细胞的黏液分泌增强，但减少了新合成的黏液的数量，导致细胞内黏液储存减少，即使在24小时。36PGE之间的观察差异1和铂族元素2不能归因于不同的生物活性，因为在我们的实验室中发现它们在抑制细胞因子分泌方面同样活跃。30.
有一致的证据表明丁酸盐诱导细胞分化并下调炎症反应。25日,37我们的数据表明，SCFA增强了PGE1/铂族元素2由上皮下肌成纤维细胞分泌的比例，可能通过增强上皮粘蛋白表达来支持粘膜保护。我们对暴露于细菌发酵产物的上皮下肌成纤维细胞的概念在生物学上是相关的，因为上皮吸收后在血液中发现了SCFA。38
为了研究muc2的表达，我们使用结肠癌细胞株T84(柱状隐窝上皮)和LS174T(杯状细胞型)。29日,39 -41与上皮下肌成纤维细胞共培养时，T84比MC T84表达更多muc2。细胞间接触、细胞外基质和可溶性因子(如转化生长因子β)诱导上皮分化，这可能导致T84细胞增加基础muc2表达。39岁,42CC LS174T的基础muc2表达与MC LS174T相比没有增强，可能是因为LS174T细胞没有进一步分化的能力。
SCFA剂量依赖性地诱导MC/CC T84和LS174T中muc2的表达。SCFA通过激活胆碱能神经诱导大鼠结肠内粘蛋白胞吐。24，43在这些研究中，SCFA输注时间为1小时或更短。我们观察到，与胆碱能激活无关，长时间与SCFA孵卵诱导muc2在上皮细胞中表达，从而使平衡偏向于粘膜保护。我们的发现也得到了一项研究的支持，该研究发现丁酸盐可以增加结肠活检中的粘蛋白合成。44
总的来说，SCFA在CC中比MC中更有效地增强了muc2的表达。单层LS174T细胞甚至对丁酸盐培养无反应，而有效地刺激了共培养。这些数据有力地支持上皮下肌成纤维细胞在调节上皮细胞产生muc2中的作用。
丁酸盐最有效地刺激PGE1当将这些CCD-18Co上清液转移到MC T84中时，与仅用丁酸盐孵育上皮细胞相比，muc2的表达进一步增加。通过CCD-18Co上清或直接由T84(数据未显示)介导的丁酸盐效应被吲哚美辛取消。这意味着SCFA增强的粘蛋白合成是由来自上皮下肌成纤维细胞和肠上皮细胞的PG介导的。后者是由粘膜上皮细胞组成性表达COX-1和事实上上皮细胞已被报道产生PG这一事实支持的。26日,45
综上所述，SCFA增加了PGE1/铂族元素2由上皮下肌成纤维细胞和PGE产生的比例1被发现优于PGE2增强muc2在上皮细胞中的表达。我们的吲哚美辛抑制实验证明，SCFA刺激上皮细胞muc2表达是由上皮下肌成纤维细胞和上皮细胞来源的PG介导的。因此，本研究表明，细菌发酵产物可能通过支持粘膜屏障的完整性而对肠道健康产生有益影响。
致谢
我们感谢Rob Verdooren在统计评估方面的支持。
参考文献
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