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结肠
磷脂酰肌醇3-kinase调节肠上皮细胞增殖的信号
免费的
  1. H盛,
  2. J邵,
  3. 小C M汤森,
  4. B M埃弗斯
  1. 外科学系和肠胃研究跨学科项目,德克萨斯大学医学分支,301大学大道,加尔维斯顿,德州77555,美国
  1. 通信:
    H博士,外科学系,德克萨斯大学医学分支,301大学大道,加尔维斯顿,德州77555年,美国;
    hosheng在}{utmb.edu

文摘

背景和目的:测定细胞内信号通路调节肠上皮增殖是基本的理解肠道的完整性和功能在正常和病变的条件。磷酸肌醇的3-kinase PI3K / Akt途径能传感信号由生长因子,参与细胞增殖和分化。在这项研究中,我们评估的角色PI3K / Akt在肠上皮细胞增殖信号转导。

方法:大鼠肠上皮细胞株(RIE)和人类大肠癌HCA-7和ls - 174细胞系作为体外模型。Balb / cJ老鼠体内模型。

结果:PI3K激活G1细胞周期进程的关键是肠道上皮细胞。异位表达活跃p110α或Akt-1 RIE细胞增殖增加。体内实验表明,PI3K激活与肠粘膜的增殖活动密切相关。治疗小鼠PI3K抑制剂阻止诱导PI3K活动和减毒肠粘膜增殖与口服摄入有关。表皮生长因子、转化生长因子α刺激PI3K激活所需生长因子诱导的细胞周期蛋白D1的表情。

结论:PI3K / Akt通路能传感促有丝分裂的信号从生长因子受体细胞周期机械和发挥了至关重要的作用调节肠上皮细胞增殖。

  • 磷酸肌醇3-kinase
  • 肠上皮细胞
  • 扩散
  • 信号转导
  • PI3K,磷酸肌醇3-kinase
  • RIE,大鼠肠道上皮
  • PCNA增殖细胞核抗原
  • 表皮生长因子、表皮生长因子
  • 表皮生长因子受体、表皮生长因子受体
  • TGF-α转化生长因子α
  • PDK-1,磷酸肌醇激酶1的依赖
  • DMSO(二甲亚砜
  • PBS,磷酸缓冲盐
  • 胎牛血清的边后卫
  • IPTG, isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside
  • MEK MAPK / ERK激酶
  • Cdk,细胞周期蛋白依赖激酶

http://dx.doi.org/10.1136/gut.52.10.1472

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    肠道上皮是一种最快速增生组织。肠上皮细胞持续增殖的高速度与连续保持平衡细胞通过机械摩擦损失和终端分化。1,2表皮生长因子(EGF)的家庭,包括表皮生长因子、转化生长因子α(TGF-α)及其受体(EGFR)在肠上皮增殖发挥关键作用。1,3,4绑定表皮生长因子受体的配体导致激活相关的受体酪氨酸激酶磷酸化酪氨酸残基的细胞信号蛋白。5许多信号通路参与从表皮生长因子受体信号转导细胞核。其中,Ras / MAPK通路,磷酸肌醇3-kinase PI3K / Akt通路,和磷脂酶C /蛋白激酶C通路是重要的调节细胞生长、迁移、分化和凋亡。5,6

    类IA pi3k (PI3Kα、PI3KβPI3Kδ),由一个85 kDa调节亚基,110 kDa催化亚基(p110α、p110βp110δ)传送受体酪氨酸激酶的信号耦合和促有丝分裂的信号中扮演关键的角色。7p110α和p110β表达组织而p110δ主要是白细胞中表达。8p110α参与EGF诱导促有丝分裂的反应;9相比之下,p110β对于胰岛素诱导的促有丝分裂的反应是必要的。10PI3K催化亚基磷酸化的D3羟基磷酸肌醇;产品包括PtdIns (3, 4) P2和PtdIns (3、4、5) P3。PI3K D3磷酸化生成磷酸肌醇的PH值绑定到域依赖蛋白激酶B(一种蛋白激酶)和磷酸肌醇激酶1 (PDK-1)和诱导他们的易位的质膜PDK-1磷酸化和Akt激酶。7,11三种亚型的一种蛋白激酶(Akt1、Akt2 Akt3)由三个不同的基因编码,具有守恒的苏氨酸和丝氨酸残基(T308和S473 Akt1)由PI3K Akt激活的关键。12尽管所有三种亚型的一种蛋白激酶可以通过生长因子被激活,13在大多数组织中Akt1是主要的同种型。14我们已经表明,异位表达积极的英国皇家空军和Akt1结果转换的鼠肠上皮(RIE)细胞,表明同种型的关键作用Akt在肠道上皮细胞生物学。15

    PI3K / Akt通路是致癌,参与改变了肠道上皮细胞的增殖。15日,16另一方面,抑制PI3K活动导致HT-29和Caco-2细胞的分化。17这些结果表明,改变了肠道上皮细胞的增殖需要PI3K的本构激活。据我们所知,PI3K / Akt的作用在正常肠上皮增殖并没有进行了广泛的调查。在目前的研究中,细胞内的信号通路调节肠上皮增殖被阐明。使用老鼠的RIE细胞,人类HCA-7和ls - 174细胞、小鼠模型,我们表明,PI3K活动必不可少的肠上皮细胞增殖在体外和体内。我们还发现EGF和TGF-α治疗快速诱导PI3K的活动,这是所需的细胞周期蛋白D1表达式,表明PI3K / Akt通路能传感增殖生长因子受体和细胞周期机械之间的信号在肠道上皮细胞。

    材料和方法

    材料

    LY 294002、渥曼青霉素和pd - 98059买来Calbiochem(美国加州拉霍亚)。antiphosphorylated Akt抗体购自细胞信号(美国马萨诸塞州贝弗利)。Antiactive ERK1/2抗体来自Promega(美国威斯康辛州麦迪逊)和圣克鲁斯生物技术(美国加州Santa Cruz)。Anticyclin D1抗体购自北部生物技术(美国普莱西德湖,纽约)。抗体的增殖细胞核抗原(PCNA)免疫染色从圣克鲁兹购买。EGF和TGF-α购买σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。

    动物实验

    所有的动物治疗的方式,符合国家卫生研究院实验室动物保健和使用指南和机构批准的动物保健和使用委员会。三个月大的Balb / cJ老鼠从杰克逊实验室购买(美国缅因州巴尔港),被安置在一个动物存贮室光,控制温度和湿度。对饮食控制肠道上皮增殖,老鼠被安置在铁丝笼子和接收触底透明液体Pedialyte(罗斯,哥伦布,俄亥俄州,美国)与5%葡萄糖表示。颗粒状Prolab 2500啮齿动物饮食(PMI营养国际,LLC布伦特伍德,密苏里州,美国)然后继续随意。ly - 294002是溶解在50%二甲亚砜(DMSO)在磷酸缓冲盐(PBS)和由腹腔内注射(10毫克/公斤体重)。18日,19渥曼青霉素是溶解在甲醇4%生理盐水并给予(1.5毫克/公斤体重)orogastric填喂法。17日,19空肠粘膜(1厘米远的韧带Treitz)和回肠(3厘米近端回盲瓣)是制备蛋白质溶解产物报废。全厚度肠免疫组织化学固定在4%多聚甲醛。

    细胞培养

    人类结肠癌细胞系分化良好,ls - 174,购买从写明ATCC(马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。分化人类直肠癌HCA-7细胞S博士的礼物科克兰德(伦敦大学,伦敦,英国)。细胞系都保存在本人的5中含10%胎牛血清的边后卫。RIE细胞的礼物KD布朗博士(英国剑桥),生长在杜尔贝科的修改鹰中含有10%的边后卫。在细胞生长研究中,细胞被播种在12孔板(104细胞/)和指定的治疗时间。细胞被trypsinised计数前和彻底混合在PBS。四个样本统计使用血球计。

    (3H]胸腺嘧啶核苷掺入

    估计了DNA合成(3H]胸腺嘧啶核苷掺入,如前所述。20.细胞从一个额外的数量受到了类似的待遇是计算和使用规范(3H]胸苷。结果表示为cpm / 50 000细胞。

    流式细胞术

    ETOH细胞被固定在70%,治疗1毫升0.1%核糖核酸酶(σ),和彩色propidium碘(σ)。DNA是由一个流式细胞分析仪分析;细胞周期配置文件被表示为细胞的比例在每个细胞周期阶段。

    免疫印迹分析

    肠道粘膜细胞或细胞溶解30分钟在裂解缓冲(50毫米磷酸甘油,10毫米玫瑰,pH值7.4,1% Triton x - 100, 70毫米氯化钠,1毫米Na3签证官425μg /毫升抑肽酶10μg亮抑酶肽/毫升、和1μM phenylmethanesulphonyl氟化物),用近20秒钟。明确完整的细胞溶解产物被钠十二烷基变性和分馏sulphate-polyacrylamide凝胶电泳。蛋白质被转移到PVDF膜(Bio-Rad,赫拉克勒斯,加州,美国)抗体孵育表示,由增强化学发光体系(Amersham,阿灵顿高地,伊利诺斯州,美国)。

    PI3K的异位表达

    表达p110α或Akt1 RIE细胞,诱导表达系统,LacSwitch(美国加州拉霍亚,Stratagene)受雇。21日,22Myristoylated p110α(北部生物技术)或HA标记Myristoylated Akt1 (PN Tsichlis博士的礼物,托马斯·杰斐逊大学)被插入到真核Lac运营商包含向量,pOPRSVI / MCS。这些向量是转染到RIE细胞以前转染真核Lac repressor-expressing向量,pCMVLacI。选择双转染RIE细胞与潮霉素(150µg /毫升)和geneticin(600µg /毫升)两周。插入基因的表达被压抑,直到一个诱导物(IPTG;isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)补充道。

    PI3K调节亚基的显性负突变,Δp85α(B Vanhaesebroeck博士的礼物,路德维希癌症研究所),缺乏催化亚基p110α的结合位点23是插入到lzr逆转录病毒系统(加里·诺兰博士的礼物,斯坦福大学)。指定的构造,LZRS-Δp85α,转染到凤凰包装细胞(写明ATCC)。新鲜RIE细胞感染病毒的上层清液中含有空向量或者LZRS-Δp85α,选择4毫克/毫升嘌呤霉素为10天,和被称为RIE / lzr和RIE /Δp85α细胞,分别。

    免疫组织化学

    小肠在4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片。内源性过氧化物酶活动就熄了孵化的部分0.3%过氧化氢在室温下20分钟。后部分被封锁在1.5%正常血清在PBS一小时,主要抗体是添加到部分和孵化一夜之间在4°C。部分被孵化与生物素化的二次抗体和ABC-AP试剂(Vectorstain ABC-AP装备,向量实验室,伯林盖姆,加利福尼亚,美国)。过氧化物酶活动证明了应用3 3′-diaminobenzidine包含0.02%的过氧化氢为10分钟。部分与甲苯胺蓝O复染色。

    统计分析

    结果表示为手段(SD)。所有统计分析进行StatView 5.0.1的个人电脑软件(SAS研究所有限公司卡里,北卡罗莱纳,美国)。分析多个组之间由方差分析(方差分析)。事后方差分析测试是由费雪的保护有显著差异。分析两组之间进行了使用未配对的学生的t测试。差异p值< 0.05被认为是具有统计学意义。

    结果

    抑制RIE细胞增殖抑制PI3K活动

    探讨PI3K在肠上皮细胞增殖的作用,我们研究了抑制PI3K活动对扩散的影响的RIE细胞来源于正常大鼠小肠隐窝细胞和显示非转换上皮细胞的性质。24治疗选择性PI3K抑制剂,ly - 294002(20μM),减少了80%的RIE细胞生长(图1),而选择性MAPK / ERK激酶(MEK)抑制剂,pd - 98059,抑制细胞生长∼20%。(3H]胸腺嘧啶核苷掺入试验证明了ly - 294002抑制DNA合成RIE细胞浓度依赖的方式(图1 b)。治疗10μM ly - 294002 24小时几乎完全阻塞在RIE细胞DNA合成。流式细胞术显示,抑制PI3K活动ly - 294002导致积累RIE G1期细胞的细胞周期和pd - 98059没有明显改变细胞周期剖面(图1 c)。

    图1

    磷酸肌醇的作用3-kinase (PI3K)活动在大鼠肠道上皮细胞增殖(RIE)。(一)RIE细胞生长。细胞(104)被播种在12孔板和处理20μM LY - 294002 (LY), 25μM PD - 98059 (PD),或LY - 294002 + PD - 98059四天。细胞在磷酸缓冲盐然后trypsinised混合。细胞数量从四个样本统计。值意味着(SD)的细胞数量/从一井。* p < 0.05。结果是代表三个独立的实验。(B) (3在RIE细胞H]胸腺嘧啶核苷掺入。细胞治疗ly - 294002或pd - 98059浓度表示的24小时。(3H]胸腺嘧啶核苷掺入三个小时后测量的脉搏。结果意味着(SD) cpm / 50 000细胞从四倍的井。* p < 0.05。这个实验是独立重复三次。(C)细胞周期。RIE细胞接受二甲亚砜,ly - 294002(20μM), pd - 98059(50μM),或pd - 98059 + ly - 294002 48小时。DNA是由一个流式细胞分析仪分析;比例的细胞G0 / G1期和S期。值意味着从三个实验(SD)。* p < 0.05。

    PI3K RIE细胞增殖活动是至关重要的

    作为PI3Kα和Akt1参与EGF诱导促有丝分裂的信号,9日,13我们检查了他们的角色在RIE细胞增殖。RIE细胞被感染的特征主要负突变主要PI3K调节亚基,Δp85α,缺乏催化亚基的结合位点,p110α,抑制PI3K的激活。23异位表达Δp85αpAkt水平显著降低,细胞周期蛋白D1(图2)。DNA合成下降了50%在Δp85α表达RIE细胞与细胞感染了向量(lzr)。此外,我们建立了一个稳定转染的RIE细胞系中表达myristoylated p110α(myr-p110α)可以通过IPTG诱导。15磷酸化水平的一种蛋白激酶(pAkt)反映PI3K的活动11增加以下myr-p110α感应;DNA合成的速度也增加(图2 b)。稳定转染RIE细胞系,HA标记myristoylated Akt1 (HA-Akt-myr)可以通过IPTG诱导生成。诱导Akt-myr也表达HA DNA合成显著增加(图2 c)。综上所述,这些数据显示,PI3Kα同种型中扮演着一个关键的角色在肠上皮细胞增殖和Akt是一个重要的下游效应PI3K的这个动作。

    Ectopic expression of phosphoinositide 3-kinase (PI3K) in rat intestinal epithelial (RIE) cells. (A) Overexpression of dominant negative p85α. RIE cells were infected with LZRS viral vector or LZRS containing Δp85α cDNA, as described in the methods section. Total cell lysates were harvested and analysed for levels of pAkt and cyclin D1 (CcnD1) proteins. [3H]-Thymidine incorporation assay was performed in RIE/LZRS and RIE/Δp85α cells. Results are expressed as cpm/50 000 cells. Values are means (SD) of relative cpm (versus LZRS control) from three experiments. *p<0.05. (B) Conditional expression of p110α. Stably transfected RIE-imyr-p110α cell line was established, as described in the methods section. Expression of myr-p110α was induced by addition of 5 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG). Levels of pAkt were determined by western analysis at the indicated time points. [3H]-Thymidine incorporation was assessed after the cells were treated with vehicle (CTR) or IPTG for 48 hours. Values are means (SD) of relative cpm (versus control) from three experiments. *p<0.05. (C) Conditional expression of active Akt1. Stably transfected RIE-iHA-Akt-myr cells were treated with IPTG and induction of HA-Akt was measured by western analysis using anti-HA antibody. [3H]-Thymidine incorporation was assessed after the cells were treated with vehicle (CTR) or IPTG for 48 hours. Values are means (SD) of relative cpm (versus control) from three experiments. *p<0.05.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    磷酸肌醇的异位表达3-kinase (PI3K)在大鼠肠道上皮细胞(RIE)。(一)占主导地位的消极p85α超表达。RIE细胞感染lzr病毒载体或lzr包含Δp85αcDNA、方法部分中描述。总细胞溶解产物是收获和分析pAkt水平和细胞周期蛋白D1 (CcnD1)的蛋白质。(3H]胸腺嘧啶核苷掺入试验进行的RIE / lzr和RIE /Δp85α细胞。结果表示为cpm / 50 000细胞。值意味着(SD)的相对cpm(与lzr控制)从三个实验。* p < 0.05。(B) p110α条件表达式。稳定转染RIE-imyr-p110α细胞系建立,部分中描述的方法。表达myr-p110α被添加诱导5毫米isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG)。pAkt水平取决于西方分析指定的时间点。(3H]胸腺嘧啶核苷掺入后评估细胞处理车辆(CTR)或IPTG 48小时。值意味着(SD)的相对cpm(或控制)从三个实验。* p < 0.05。(C)活动Akt1的条件表达式。稳定转染RIE-iHA-Akt-myr细胞治疗和IPTG诱导HA-Akt使用anti-HA抗体被西方分析测量。(3H]胸腺嘧啶核苷掺入后评估细胞处理车辆(CTR)或IPTG 48小时。值意味着(SD)的相对cpm(或控制)从三个实验。* p < 0.05。

    PI3K / Akt激活与肠粘膜增殖有关

    腔的内容显著调节肠道粘膜扩散。25日,26描绘PI3K的作用在体内肠粘膜增殖,Balb / cJ小鼠受到液体饮食72小时。废弃的内脏导致显著减少的数量每隐窝细胞增殖;增殖指数回到控制水平16小时后恢复固体饮食(图3)。液体饮食pAkt水平降低;迅速恢复固体食物诱导pAkt,暗示PI3K的监管活动腔的内容(图3 b)。PCNA合成在S期的细胞周期和增殖细胞作为一个优秀的标志。增殖细胞核抗原和pAkt同时监管的水平在小鼠肠道上皮细胞。相比之下,水平的磷酸化ERK1/2 (pERK1/2)增加液体饮食和没有与肠上皮细胞增殖的活性。

    图3

    磷酸肌醇3-kinase增殖小鼠肠上皮(PI3K)活动。(一)增殖指数。Balb / cJ小鼠受到正常饮食(C), 72小时的液体饮食(L),或恢复固体16小时(S),空肠是应用细胞增殖核抗原(PCNA)。手动PCNA阳性细胞数。酒吧是意味着(SD)的增殖细胞/地下室从90年代表三个老鼠肠道隐窝(30隐窝/鼠标)。* p < 0.05。(B)西方分析pAkt、活跃和PCNA。Balb / c小鼠受到正常饮食(c), 72小时的液体饮食(L),或固体的恢复时间。pAkt、活跃和PCNA蛋白在回肠粘膜由西方分析。这个实验是独立重复三次。

    PI3K活动对肠粘膜增殖至关重要

    ly - 294002和渥曼青霉素是PI3K的选择性抑制剂27和可以用来阻止体内PI3K活动。17日,18日,19确定感应PI3K的活动对肠粘膜增殖至关重要,较低剂量的ly - 294002(10毫克/公斤腹腔内)是体内使用。ly - 294002治疗完全阻塞固体食物诱导PI3K激活和减毒诱导细胞核抗原(图4)。Orogastric管理渥曼青霉素也阻止固体饮食诱导pAkt激活和PCNA表达(图4 b)。免疫组织化学显示72小时液体饮食显著降低增殖细胞核抗原在空肠粘膜隐窝的免疫反应性(图4 c)。重新喂料两个小时导致增殖细胞核抗原在地下室很大一部分的阳性染色细胞。ly - 294002的政府几乎完全废除饮食诱导PCNA的表达。

    Inhibition of phosphoinositide 3-kinase (PI3K) activity in the liquid diet/solid diet mouse model. (A) LY-294002 treatment. Balb/cJ mice were subjected to a normal diet (C), 72 hours of a liquid diet (L), or two hours resumption of solids with (+) or without (−) LY-294002 treatment. LY-294002 (10 mg/kg body weight) was administered intraperitoneally 15 minutes prior to resumption of a solid diet. Levels of pAkt and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in the jejunal mucosa were determined by western analysis. This experiment was repeated twice (total of six mice per time point). (B) Wortmannin treatment. Balb/c mice were subjected to a normal diet (C), 72 hours of a liquid diet (L), or two hours of resumption of a solid diet with (+) or without (−) wortmannin (W) treatment. Wortmannin (1.5 mg/kg body weight) was administered by orogastric gavage 30 minutes prior to refeeding. Levels of pAkt and PCNA in the ileal mucosa were determined by western analysis. This experiment was repeated twice (total of four mice per time point). (C) PCNA immunostaining. The immunoreactivity of PCNA was demonstrated in the jejunal mucosa (×400) from mice treated with: (a) control diet, (b) 72 hour liquid diet, (c) two hour resumption of solid diet, and (d) two hour resumption of a solid diet with LY-294002 treatment. Arrows indicate representatives of positively stained cells. Bars are means (SD) of proliferating cells/crypt from 90 representative crypts of three mouse intestines (30 crypts/mouse). *p<0.05.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    抑制磷酸肌醇3-kinase (PI3K)液体饮食活动/固体饮食小鼠模型。(一)ly - 294002治疗。Balb / cJ小鼠受到正常饮食(C), 72小时的液体饮食(L),或两个小时恢复固体(+)或没有(−)ly - 294002治疗。ly - 294002(10毫克/公斤体重)是腹腔内接种前15分钟重启一个坚实的饮食。pAkt水平和增殖细胞核抗原(PCNA)在空肠粘膜被西方分析确定。这个实验被重复两次(每个时间点共有六个老鼠)。(B)渥曼青霉素治疗。Balb / c小鼠受到正常饮食(c), 72小时的液体饮食(L),或两个小时的恢复固体饮食(+)或没有(−)渥曼青霉素(W)治疗。渥曼青霉素(1.5毫克/公斤体重)是由orogastric填喂法重新喂料前30分钟。pAkt水平和PCNA在回肠粘膜由西方分析。 This experiment was repeated twice (total of four mice per time point). (C) PCNA immunostaining. The immunoreactivity of PCNA was demonstrated in the jejunal mucosa (×400) from mice treated with: (a) control diet, (b) 72 hour liquid diet, (c) two hour resumption of solid diet, and (d) two hour resumption of a solid diet with LY-294002 treatment. Arrows indicate representatives of positively stained cells. Bars are means (SD) of proliferating cells/crypt from 90 representative crypts of three mouse intestines (30 crypts/mouse). *p<0.05.

    PI3K在人类肠道上皮细胞增殖

    我们接下来阐明PI3K的作用在人类肠道上皮细胞的增殖。人类结肠癌细胞系分化良好,不断增殖并进行差异化在某些情况下提供了重要的人类肠道干细胞实验模型。28在目前的研究中,我们使用两个分化良好结直肠癌细胞系,HCA-7和ls - 174。29日,30.HCA-7和ls - 174细胞增殖在组织培养和分化在细胞外基质成分(基底膜基质)形成crypt-like结构(图5)。积极阿尔新蓝染色表明ls - 174年殖民地包含结肠黏液型。这些细胞的增长很大程度上是依赖PI3K活动(图5 b)。抑制PI3K活动ly - 294002(20μM)导致强烈的DNA合成减少而抑制MEK活动治疗pd - 98059对DNA合成影响不大(图5)。细胞周期分析显示,ly - 294002治疗积累了ls - 174和HCA-7细胞细胞周期G1期的(图5 d)。相比之下,pd - 98059没有明显改变这些细胞的细胞周期配置文件。同意结果RIE细胞和小鼠肠道黏膜,PI3K途径似乎是至关重要的对人类肠道上皮细胞增殖。

    图5

    磷酸肌醇3-kinase (PI3K)活动在人类肠道上皮细胞增殖。(一)HCA-7和ls - 174细胞的分化。细胞在基底膜基质被播种了14天。殖民地被固定,石蜡包埋,切片,阿尔新蓝染色(×200)。(B) HCA-7和ls - 174细胞生长。HCA-7或ls - 174细胞(104)被播种在12孔板和处理20μM LY - 294002 (LY)或50μM PD - 98059 (PD)四天。细胞数量清点,值意味着从一式三份(SD)井。* p < 0.05。结果是代表三个独立的实验。(C) (3H]胸腺嘧啶核苷掺入在人类肠道上皮细胞。HCA-7或ls - 174细胞被播种在24孔板和对待ly - 294002(20μM)或pd - 98059(50μM)为24小时。(3H]胸腺嘧啶核苷掺入三个小时后测量的脉搏。结果表示为cpm / 50 000细胞从四倍的井。* p < 0.05。结果是代表三个独立的实验。(D)细胞周期。HCA-7和ls - 174细胞接受二甲亚砜(DMSO), ly - 294002(20μM), pd - 98059(50μM),或pd - 98059 + ly - 294002 48小时。DNA流式细胞分析仪和细胞周期分析概要提出了比例的细胞在细胞周期的每个阶段。值意味着从三个实验(SD)。

    从表皮生长因子受体PI3K / Akt通路介导信号细胞周期进程

    解决机制PI3K介导肠上皮细胞增殖,我们确定的角色在生长因子刺激PI3K / Akt通路细胞周期蛋白D1的表情。进展到中期到后期的哺乳动物细胞周期G1期依赖周期蛋白D1介导的激活细胞周期蛋白依赖激酶4(到)或相关Cdk6。31日细胞周期蛋白D1和pAkt蛋白质都是在成长中发现RIE细胞。不足72小时血清的细胞周期蛋白D1和pAkt程度都有所降低。与EGF刺激或TGF-α迅速增加了水平的细胞周期蛋白D1和pAkt,保持在高水平至少24小时(图6)。ly - 294002减毒EGF的存在或TGF-α诱导pAkt和周期蛋白D1的表达式。

    图6

    调节细胞周期蛋白D1。(一)细胞周期蛋白D1 (CcnD1)在大鼠肠道上皮细胞(RIE)。RIE细胞生长在剥夺血清培养基(−S)为72小时。细胞被重新刺激与表皮生长因子(EGF 100 ng / ml), EGF + ly - 294002(20μM)(上半部分)、转化生长因子α(TGF-α100 ng / ml),或者TGF-α+ ly - 294002(20μM)表示时间(下图)。表达的细胞周期蛋白D1、pAkt和细胞周期蛋白依赖激酶4(到)是由西方的分析。S =细胞生长在含血清培养基。所有的西方分析重复三次。(B)在ls - 174细胞周期蛋白D1的监管。细胞生长在剥夺血清培养基72小时(−S)然后重振EGF (100 ng / ml)或EGF + ly - 294002的显示时间。表达的细胞周期蛋白D1, pAkt,到是由西方的分析。 (C) Cyclin D1 regulation in mouse intestinal mucosa. Balb/c mice were subjected to a normal diet (C), 72 hours of a liquid diet (L), two hours resumption of solid food (S), or resumption of solid food plus wortmannin (W) or LY-294002 (LY). Levels of cyclin D1 and pAkt in jejunal mucosa (upper panel) and ileal mucosa (lower panel) were determined by western analysis.

    进行了类似的实验在人类ls - 174细胞。刺激与EGF诱导表达的细胞周期蛋白D1和pAkt(图6 b)。ly - 294002治疗完全减毒EGF诱导表达的细胞周期蛋白D1和pAkt。

    细胞周期蛋白D1蛋白检测在正常小鼠肠道粘膜。废弃的内脏回肠粘膜的细胞周期蛋白D1水平下降。恢复固体食物刺激的表达细胞周期蛋白D1在空肠(图6 c上面板)和回肠(图6 c下半部分)和pAkt恰逢感应。管理渥曼青霉素或ly - 294002减毒固体食物诱导表达的细胞周期蛋白D1和pAkt。

    讨论

    我们研究了PI3K / Akt信号通路的作用在调节肠道上皮细胞增殖。我们发现PI3K / Akt是一个重要信号通路介导增殖信号在肠道上皮细胞在体外和体内。阻塞PI3K酶活性药理和分子方法抑制RIE细胞株的增殖,非转换老鼠肠道上皮细胞系。此外,人类大肠癌细胞增殖分化良好的,已被认为是人类肠道干细胞的典范,28很大程度上取决于PI3K的活动。此外,我们的体内实验是第一个证明PI3K / Akt通路的重要作用在正常肠粘膜增殖。我们已经表明,PI3K活动,细胞周期蛋白D1蛋白和PCNA在肠道上皮细胞迅速增殖的同时监管。这些观察结果从三个独立的体外和体内模型显示中央PI3K活动参与肠道上皮细胞增殖的信号。

    几行调查表明,PI3K / Akt通路控制体内细胞增殖。32Pik3ca,编码类IA PI3K催化亚基p110α,对胚胎发育至关重要。32纯合子基因敲除的Pik3ca结果完全失败的胚胎细胞增殖并没有观察到异常的细胞凋亡。另一方面,肿瘤抑制基因PTEN / MMACI(磷酸酶和tensin同系物删除10号染色体上),可以脱去磷酸PtdIns-3 3位置,4,5,- p3和PtdIns-3 4 - p2PI3K扭转反应催化了。33纯合子的PTEN基因敲除小鼠死亡9.5天(E9.5)的发展。增殖指数(BrdU积极核/总细胞数显著增加PTEN−/−胚胎与野生型相比胚胎。34这些发现表明,PI3K扩散至关重要的各种细胞类型和支持我们观察到PI3K / Akt是一个主要为体内肠道上皮细胞增殖信号通路。

    活跃的一种蛋白激酶的表达增加了细胞周期蛋白D1的表达式35岁,36并促进S期条目。37在我们的实验中,异位表达活跃p110α或Akt1导致DNA合成增加。PI3K可能需要额外的协同刺激细胞增殖的信号。38有趣的是,MEK / ERK活性并不是与肠上皮增殖在所有三个我们的实验模型。水平的活跃在废弃的增加小鼠肠和恢复固体食物没有明显刺激MEK / ERK激活。抑制MEK活动在RIE没有改变细胞周期进展,HCA-7,或ls - 174细胞。精确的MEK / ERK在肠上皮细胞增殖中的作用还不清楚。确定一个协同基本MEK / ERK和PI3K / Akt信号是至关重要的正常肠上皮增殖需要进一步的实验。

    细胞周期蛋白D1扮演着一个重要的角色在肠道上皮细胞细胞周期进程。TGF-β治疗可以抑制大鼠肠道上皮细胞的生长的差别通过对这些基因的细胞周期蛋白D1的水平。39细胞周期蛋白D1被认为扮演重要角色在肠道上皮细胞的正常和肿瘤的增长,和超表达的细胞周期蛋白D1与结直肠肿瘤。40岁,41然而,细胞周期蛋白D1的表达在正常小鼠肠粘膜并没有被发现。41核,细胞质,但不是染色的细胞周期蛋白D1被确定在正常人类结肠粘膜。40在我们目前的研究中,我们表明,细胞周期蛋白D1蛋白表达在正常小鼠肠道黏膜和恢复固体食物显著增加的细胞周期蛋白D1的表达,由西方分析。细胞周期蛋白D1受PI3K / Akt通路在转录36和转录后水平。35此外,Akt稳定细胞周期蛋白D1蛋白通过GSK-3β激酶的抑制。42我们的体外和体内的数据表明,外在刺激诱导表达在肠道上皮细胞周期蛋白D1的;这个表达式被PI3K抑制剂治疗减毒。监管型细胞周期蛋白的表达和功能提供了分子基础的细胞应对外在促有丝分裂的信号。我们的研究结果表明,PI3K / Akt通路可能通过调节功能的可用性控制肠道上皮增殖细胞周期蛋白D1蛋白。

    PI3K活化刺激改变肠道上皮细胞的增长,因此提高了这些细胞的表型转换。15 -17日,43在正常的肠道粘膜,肠上皮细胞增殖是至关重要的维持肠道上皮细胞的体内平衡44和关键改善肠道的完整性和功能患者的肠道损伤和萎缩。4,45我们目前的研究表明,PI3K / Akt通路介导肠上皮细胞增殖的关键信号,有助于肠上皮内稳态的分子机制的理解。我们的研究结果还表明,PI3K / Akt通路可能是一个潜在的目标调节肠道粘膜增生。

    确认

    这项工作是支持的肠胃研究跨学科项目,为生物医学研究约翰•希利纪念捐赠基金,国家卫生研究院的基金RO1DK48498 PO1DK35608。

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