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摘要
背景与目的:乳糜泻(CD)的特点是存在抗组织转谷氨酰胺酶(tTG)的自身抗体，内膜自身抗原。本研究旨在测定纯化的自身抗体对tTG酶活性的影响。
方法:从未治疗的乳糜泻患者和对照组血清中分离出总IgA和IgG类抗体以及纯化的抗ttg自身抗体。抗体对tTG活性的抑制能力是通过在酪蛋白中掺入单丹酰尸胺和通过tTG催化的生物素化尸胺与麦胶蛋白交联的荧光测定来检查的。
结果:5名CD患者和3名对照组的IgA和IgG富集部分对酶活性的抑制没有显著差异。相比之下，与对照组免疫球蛋白相比，12例CD患者使用亲和纯化抗tTG自身抗体导致tTG活性的剂量依赖性降低(n=6)。然而，剩余的活性足以使尸胺与麦胶蛋白交联，只有高浓度的单克隆抗体才能完全阻断tTG酶的活性，该单克隆抗体指向tTG的活性中心。
结论:尽管从CD患者中分离出的抗ttg自身抗体具有部分抑制作用，但剩余的酶活性仍然足够高，使人怀疑它们在体内的相关性。
- 自身抗体
- 的抑制作用
- 组织转谷氨酰胺酶
- 肠道
- 腹腔疾病
- ab抗体
- 乳糜泻，乳糜泻
- 酶联免疫吸附试验
- SDS-PAGE，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
- tTG，组织转谷氨酰胺酶
数据来自Altmetric.com
乳糜泻(CD)是一种麸质敏感的肠道疾病，由摄入小麦麦胶蛋白或相关的黑麦和大麦储存蛋白引起。1，2乳糜泻的特点是存在针对病因剂麦胶蛋白的抗体3.4特别是组织转谷氨酰胺酶(tTG)，在乳糜泻中被确定为肌内膜自身抗原。5tTG通常通过催化分子间键的形成来交联蛋白质，但当主要谷氨酰胺受体缺失时，也可以使谷氨酰胺残基脱氨。6，7
自身抗原tTG在乳糜泻发病机制中起着重要作用，因为它能够在明确的谷氨酰胺处去酰胺化麦胶蛋白肽。这些修饰过的麦胶蛋白肽表现出更好的与HLA-DQ2或-DQ8分子结合，从而导致更有效的T细胞增殖。8 -16
tTG在CD发病机制中的核心作用被进一步强调，tTG的自身抗体与活性CD的高度关联达到近100%的特异性和敏感性。17 -22tTG自身抗体也被认为是观察到的乳糜泻肠道损伤的工具，因为它们有可能干扰tTG依赖的转化生长因子β的激活，从而影响肠上皮分化和细胞基质相互作用。23由于关于乳糜泻患者抗体的直接抑制潜力的发现存在争议，24日,25我们旨在进一步确定抗tTG自身抗体阻断其催化活性的能力。根据我们的数据，我们认为这些自身抗体在体内的作用有限。
方法
抗体隔离
对于IgA类抗体，5个活检证实为活跃性CD患者的血清和3个健康对照用0.1 M磷酸钠(pH 7.0) 1:2稀释，并用Kaptiv-AE琼脂糖(Tecnogen, Piana di Monte Verna，意大利)在室温下孵育1小时。清洗琼脂糖，用0.1 M乙酸(pH 4.0)释放保留的抗体，用1/10体积的1 M Tris-HCl (pH 9.0)迅速中和。为了分离IgG抗体，将蛋白A Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)在0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)中肿胀，并在室温下与5名未治疗的CD患者和3名对照组的血清孵育1小时，通过添加1/10体积1 M Tris-HCl (pH 8.0)调节到pH 8.0。用0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)和0.01 M Tris-HCl (pH 8.0)洗涤后，结合的抗体用0.1 M甘氨酸(pH 2.5)洗脱，并立即用1/5体积的1 M Tris-HCl (pH 8.0)中和。
人tTG自身抗体的分离
表达人tTG的质粒pJLP4(由JL Piper和Ch Khosla, Stanford, USA提供)在大肠杆菌调谐器DE3。重组人tTG的纯化如所述进行，略有变化。26在结合缓冲液(0.1 M碳酸氢钠，0.5 M NaCl, pH 8.3)透析后，重组tTG按照制造商的说明与cnbr激活的CL4B-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech)共价偶联。为了分离抗tTG的自身抗体，将12名不同的活动性乳糜泻患者的血清在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中1:5稀释，并与tTG偶联的Sepharose孵育。几个洗涤步骤之后，用0.1 M甘氨酸(pH为2.5)洗脱抗ttg自身抗体，立即用1/5体积1 M Tris-HCl (pH为8.0)中和。采用酶联免疫吸附法检测tTG滴度。17
所有抗体对0.05 M Tris-HCl, 0.15 M NaCl, pH 7.5进行深度透析，蛋白含量采用Bradford (Bio-RAD, Munich, Germany)方法测定。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测IgA和IgG抗体的纯度。
对于额外的对照实验，使用了多克隆山羊抗豚鼠肝脏谷氨酰胺转胺酶抗体(Biomol，汉堡，德国)和抗豚鼠谷氨酰胺转胺酶单克隆抗体(CUB 7402, Quartett，柏林，德国)。
体外tTG活性试验
生物素化尸胺与麦胶蛋白的结合
由于麦胶蛋白被认为是tTG的良好谷氨酰胺供体底物，因此通过将麦胶蛋白(谷氨酰胺供体)与生物素化尸胺(谷氨酰胺受体)交联来检测tTG的酶活性。因此，将1µg粗麦胶蛋白(Sigma, Taufkirchen，德国)与200ng生物素化尸胺(CovalAb, Lyon，法国)和0.5-1µg人重组tTG在0.1 M Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 5 mM氯化钙中孵育2， pH 7.5，总体积为100 μ l。在37°C下允许交联2 h。对于抑制研究，不同数量的相应抗体与tTG在37°C下预孵育10分钟，并通过添加麦胶蛋白和尸胺开始反应。在4°C下过夜，加入最终浓度为10%的三氯乙酸，停止测定。沉淀蛋白在SDS-PAGE还原条件下运行，并转移到硝化纤维中。用3%牛血清白蛋白在0.1 M Tris-HCl, 0.15 M NaCl, pH 7.5中阻断印迹，并进一步用共价偶联链霉素-碱性磷酸酶缀合物(Sigma)孵育。用5-溴-4-氯-3-吲哚酰磷酸盐和硝基蓝-四唑(SIGMA FAST片，SIGMA)显色。
动力学活性测定
tTG在抗体存在时的酶活性通过测定单丹酰尸胺(谷氨酰胺受体)与α-酪蛋白(谷氨酰胺供体)的掺入量来量化。如所述，在牛α-酪蛋白中掺入单丹酰尸胺(N-(5-氨基戊基)-5-二甲氨基-1-萘磺酰胺)(Sigma)会增加丹酰基团的荧光强度。27虽然醇溶蛋白也是本实验的合适底物，但我们使用α-酪蛋白作为tTG的底物，因为它在中性缓冲液中具有更好的溶解度。α-酪蛋白(17µM)与30µM monoddanyl cadaverine在100µl 0.1 M Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 5 mM CaCl的总体积中孵育2pH值7.5。在抑制研究中，以0.5-5.5 μ g的不同浓度添加抗体。在37°C下加入0.5µg人重组tTG开始反应。激发在360nm，荧光增加在550nm用荧光分光光度计测量(光子技术国际，加拿大)。由于人体tTG在37°C时迅速失去活性，在添加tTG后仅测定了2分钟的斜率。tTG活性计算为与对照实验相关的剩余活性的百分比，不添加抗体。
统计:
采用Mann-Whitney U检验分析CD患者抗ttg抗体抑制能力与对照组免疫球蛋白抑制能力的差异。
结果
血清对tTG活性的影响
当CD患者的血清以1%、5%或10%的浓度添加到荧光活性测定时，注意到tTG活性的浓度依赖性抑制作用。tTG活性的抑制率在25-58%之间，血清浓度在1% - 10%之间(数据未显示)。然而，对照血清也发现了相同的值，因此说明血清对tTG活性总体上具有非特异性抑制作用。
分离出的IgA和IgG抗体的效果
在IgG特异性抗ttg ELISA和IgA特异性抗ttg ELISA检测中，IgG与IgA的杂质可以忽略不计(数据未显示)。
当使用5名CD患者纯化的IgA和IgG组分时，tTG活性受到广泛的抑制，在某些血清中高浓度时(相对于tTG的4.5-5.5倍摩尔抗体过量)达到60% (IgA平均22%，IgG平均35%)。然而，与三组非腹腔对照组的总IgA或IgG分数相比，无显著差异(数据未显示)。这表明血清总IgA或IgG对tTG活性的抑制不是特异性的，而是非特异性的相互作用。
纯化抗ttg自身抗体的效果
尽管市上可获得的山羊抗豚鼠tTG多克隆抗体在荧光测定中未显示出对tTG活性的相关抑制，但应用12例未经治疗的CD患者的亲和纯化抗tTG自身抗体(其中属于IgA和IgG类的数量大致相等)对tTG活性产生了明显的浓度依赖性抑制。虽然在抗体与酶比为5.5:1(mol/mol)时，抑制率可达80%，但tTG活性永远不能被完全阻断，且与抗tTG滴度没有正相关(表1)。尽管来自腹腔血清的不同纯化tTG自身抗体之间的抑制能力范围很广，但抑制效果明显高于六个非腹腔对照的免疫球蛋白组分。剩余的活性达到特定值，当抗体浓度低时(0.5-2倍摩尔过量)，平均为66%，当抗体浓度高时(4.5-5.5倍摩尔过量)，剩余活性达到46%，从而表明抗tTG自身抗体对tTG活性有明显的抑制作用(图1)。
乳糜泻(CD)患者(n=12)的亲和力纯化抗组织转谷氨酰胺酶(tTG)自身抗体和单克隆抗体(ab) CUB 7402在低抗体浓度(比tTG多0.5-2倍摩尔)和高抗体浓度(比tTG多4.5-5.5倍摩尔)与非乳糜泻对照组(n=6)纯化免疫球蛋白相比的抑制作用。数据计算为剩余活性相对于基础活性的百分比。指出了平均值显著差异的p值。
tTG在钙离子存在时发生构象变化。28为了确定抗tTG自身抗体的抑制作用程度取决于结构变化，我们将tTG与5mm氯化钙在冰上预孵育5分钟。然而，这一过程对抗体抑制没有影响(数据未显示)。
小鼠单克隆抗ttg抗体的抑制作用
CUB 7402抗体定位tTG的氨基酸(aa) 447-478并抑制其活性。因此，抗体明显抑制tTG活性，导致在低抗体浓度下(抗体比tTG多出2倍摩尔)平均剩余活性为62%，在高抗体浓度下(抗体比tTG多出4.5-5.5倍摩尔)使用荧光测定时，平均剩余活性为33%。尽管抗体识别的区域包括两个潜在的钙结合位点(aa 450和470)29tTG与钙离子的预孵育并没有改变动力学测试的结果。
体外测定残余tTG活性的影响
荧光测定法对量化自身抗体抑制程度最有帮助。我们观察到，在37°C下无抗体酶预孵育5-15分钟后，tTG活性自发下降高达50%。在无钙缓冲液中预孵育时，这一影响更为明显(数据未显示)。因此，我们在没有将tTG与抗体预孵育的情况下进行了测试，在加入tTG后仅测定了2min的酶活性，因为在此时间范围内荧光强度与时间呈线性关系。然而，该试验不能产生关于剩余酶活性的信息。
因此，在自身抗体存在的情况下，tTG催化生物素标记尸胺与麦胶蛋白结合。tTG与抗体在37℃预孵育10 min后，在37℃预孵育2 h。在这里，尸胺与醇溶蛋白交联的结果是SDS-PAGE中分子量覆盖在30 kDa以上的蛋白质复合物。无论是否在37°C下将tTG在测试缓冲液中预孵育10分钟，交联醇溶蛋白的模式都没有差异，而不考虑是否存在增加数量的抑抑性抗体(图2)。这表明，当允许交联反应足够长时间时，剩余的tTG酶总体活性在未抑制和部分抑制酶之间没有区别。
组织转谷氨酰胺酶(tTG)催化生物素标记尸胺(谷氨酰胺受体)与麦胶蛋白(谷氨酰胺供体)交联，证明tTG活性。所示为SDS-PAGE分离后Western blot检测尸胺醇溶蛋白复合物(12%)。实验在tTG与不同数量的纯化抗tTG自身抗体(比tTG多0.5-5.5倍摩尔)(来自乳糜泻(CD)患者(cd1, cd5)或单克隆抗体CUB 7402在37℃下预孵育10分钟后进行2小时。除了CUB 7402染色模式相同外。考察了tTG预孵育后对剩余酶活性的影响。即使tTG在37°C下预孵育10分钟(+)或不(−)，对照实验也产生了相同的染色模式。
相比之下，单克隆抗tTG抗体CUB 7402显著降低了tTG的催化活性，并且在比tTG高出5.5倍摩尔时几乎完全灭活了酶(图2)。这可以解释为，在本试验中，tTG与CUB 7402预孵育10分钟似乎足以识别抗体-表位，而荧光测定显示33%的剩余活性反映了没有预孵育的初始情况。
讨论
由于tTG被确定为CD自身抗原，一些研究强调了这种酶在疾病发病机制中的重要性。因此tTG在上皮下固有层表达上调，8，30.其中ttg诱导的某些麦胶蛋白肽的去酰胺化可以通过HLA-DQ2或-DQ8的提呈增强其对T细胞的刺激能力。8 -16日,31
在这种情况下，自身抗体对tTG的潜在抑制能力是主要的兴趣。既往研究表明，乳糜泻患者血清总IgA阻止ttg诱导的转化生长因子β的激活，导致上皮细胞分化紊乱，这可能与CD的病理损伤有关。23最近，用转染tTG的Madin-Darby犬肾细胞粗裂解物作为tTG的来源，强调了血清总IgA和IgG以及抗tTG重组单克隆抗体的酶抑制能力。25相反，另一项研究在用纯化的人tTG测试CD患者血清总IgA和IgG时，未能证明有任何抑制作用。24我们的数据证实了这些结果与总IgA和IgG类抗体。
因此，CD抗tTG自身抗体是否抑制tTG酶活性从而具有重要生理意义的问题仍未解决。首先，使用不同的tTG源。其次，在测量tTG活性时，通常用于分离抗体的缓冲试剂，如甘氨酸或乙酸，必须完全去除，因为即使少量的这些试剂也会强烈抑制tTG活性。第三，生物活性tTG是一种非常不稳定的蛋白质。因此，在37°C下孵育会导致酶活性显著降低，特别是在无钙缓冲液中(数据未显示)。在这种情况下，必须强调的是，乳糜泻患者和非腹腔对照组的IgA和IgG富集部分以及总血清都阻断了tTG活性(在特定情况下高达60%，可能是由于底物竞争)。我们可以排除人血清白蛋白作为抑制剂，但不能确定(非特异性)抑制血清成分。
然而，当使用敏感的荧光测定法和亲和纯化的抗tTG自身抗体时，我们可以显示出tTG活性的明显和特异性抑制，这些抗体属于IgA和IgG类，比例几乎相等。这种抑制作用是剂量依赖性的，当使用最高自身抗体浓度(比tTG多4.5-5.5倍摩尔)时，平均剩余活性为46%。当tTG在冰上的含钙缓冲液中预孵育时，我们得到了类似的结果，但纯化的抗tTG自身抗体永远无法实现完全抑制。这与一篇报道一致，该报道表明tTG的催化区域只有轻微的抗原性，并且大多数自身抗体都针对非催化的氨基和羧基末端区域。32其中一个原因可能是在体内，酶通常与底物结合，因此催化中心对免疫系统是隐藏的。因此，仅将tTG与定向到tTG催化中心的单克隆抗体CUB 7402预孵育，tTG活性几乎完全被阻断。
纯化的自身抗体的结果似乎与体内的情况相关，因为在固有层中预期没有显著的高分子血清成分。因此，我们认为抗ttg自身抗体的抑制作用在体内的生物学意义不大。tTG活性的不完全抑制在较长时间内仍能使尸胺高效地掺入到麦胶蛋白中，这一事实强调了这一结论。黏膜tTG活性的增加似乎在CD的发病机制中起着核心作用，由于CD中这种增强的酶活性不能被患者的抗tTG自身抗体完全阻断，因此寻找和使用有效的抑制剂来降低病病性tTG活性的增加可能是一种可行的新的CD治疗方法。31
致谢
我们感谢Chaitan Khosla博士赠送的重组tTG质粒，以及德国埃尔兰根-纽伦堡大学第三医学部的Norbert Blank博士介绍的荧光PTI仪器。
参考文献
脚注
本研究由德国科学研究院Schu 646/11-2资助，欧洲共同体委员会资助，Celiac欧盟集群项目“生活质量和生活资源管理，QLRT-1999-00037”，以及美国国立卫生研究院资助DK063158。