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背景:自身抗体与转谷氨酰胺酶2 (TG2)被认为是人肌内膜(EMA),负责网状(ARA),空肠的抗体(牛仔裤)组织约束力腹腔患者的血清样本但TG2的排斥作用在这些染色模式尚未建立。
目的:评价抗原是否除了TG2有助于EMA / ARA /牛仔裤的反应。
病人:血清样本61 EMA / ARA /牛仔裤腹腔疾病患者积极治疗,40疱疹样皮炎患者,34 EMA / ARA /牛仔裤- non-coeliac控制测试。
方法:TG2淘汰赛(TG2−−)和野生型老鼠食管空肠,肝脏和肾脏部分,和TG2−−/部分涂上人类重组TG2被用作基质在单引号和双immunofluorescent研究患者IgA绑定和组织本地化TG2,纤连蛋白,肌动蛋白和calreticulin。
结果:没有一个病人血清样本引起EMA, ARA,或牛仔裤绑定TG2−−形态正常组织。相比之下,96年101年的谷蛋白敏感患者样本(95%)与野生型小鼠组织和所有101年EMA / ARA /工装裤的反应模式与TG2−−/鼠标组织人类TG2涂上。/血清IgA绑定TG2−−平滑肌细胞中观察到低滴定度在31.1%,27.5%,和20.5%,和TG2−−上皮在26.3%,5.0%,和8.8%的腹腔,疱疹样皮炎,分别与控制样本。这些主动性与肌动蛋白部分colocalised calreticulin但不是TG2或纤连蛋白。
结论:EMA / ARA /牛仔裤抗体绑定模式是专门TG2依赖在腹腔和疱疹样皮炎患者。肌动蛋白抗体是负责一些主动性,不属于EMA / ARA /工装裤的反应。
- 腹腔疾病
- 疱疹样皮炎
- endomysial抗体
- 转谷氨酰胺酶2
- 基因敲除小鼠
- ARA, R1类型网状抗体
- ELISA,酶联免疫吸附测定
- 人肌内膜抗体教育津贴,
- 牛仔裤,空肠的抗体
- TBS,三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐
- TG2,转谷氨酰胺酶2型或组织转谷氨酰胺酶
来自Altmetric.com的统计
在一群个体hla dq2或DQ8等位基因,谷物蛋白摄入诱发腹腔疾病,这是伴随着循环某些细胞外基质结构的自身抗体。1这些自身抗体高度pathognomic未经处理的腹腔疾病,主要是IgA类的,消失在面筋免费饮食治疗。他们也发生在例疱疹样皮炎谷蛋白敏感性表现为肠道和皮肤疾病。2根据所使用的组织抗原和典型的绑定模式观察,腹腔自身抗体已经被评为R1人肌内膜(EMA)型网状(ARA),和空肠(牛仔裤)抗体。1
只有1997年以来它发现EMA与酶反应转谷氨酰胺酶2 (TG2组织转谷氨酰胺酶),一个目前已知的八转谷氨酰胺酶酶形成epsilon-gamma蛋白质谷氨酰胺和赖氨酸残基的蛋白质之间的联系。3,4随后,TG2基于酶联免疫吸附试验(ELISA)的高开发了用于腹腔疾病的诊断价值。5单克隆抗体TG2也绑定到组织部分EMA, ARA,牛仔裤在间接immunofluorescent测试模式类似条件下用于临床诊断。5 -7此外,豚鼠加入组织纤连蛋白的可溶性TG2人肌内膜目标抗原可以替代化学删除似乎必将纤连蛋白。7然而,问题是,是否还有人肌内膜和相关组织自身抗原为绑定腹腔血清样本的模式。肌动蛋白的自身抗体,calreticulin、肌间线蛋白和90 kDa真皮糖蛋白也被描述在腹腔患者。8 -11此外,Uhlig等报道称,并不是所有的腹腔抗体结合位点与TG2匹配。12
在目前的研究中我们旨在建立腹腔疾病和疱疹样皮炎病人血清,是否给典型的coeliac-type组织染色模式在正常灵长类动物和啮齿动物组织,包含结构除了TG2自身抗体。我们利用TG2最近发展的淘汰赛(TG2−−)老鼠,这些老鼠是可行的和没有重大器官异常。13使用这种TG2缺乏组织部分,所有抗体绑定其他比TG2引起的应该是可见的。
方法
患者样本
IgA类EMA阳性血清样本61例未经治疗的腹腔疾病(0.9 - -57.8岁;5.6)和中值40治疗疱疹样皮炎患者(2.5 - -26.1岁;中值9.3),根据当前的标准诊断的空肠切片和皮肤immunofluorescent研究中,被调查。30 4 EMA -血清样本non-coeliac患者正常空肠的形态学(-60 - 1.2岁;中位数6.8)被用作控制。7这些控制血清样本IgA麦胶蛋白抗体阳性。血清样本的许可使用海姆朋友儿童医院的伦理委员会,布达佩斯。
Immunofluorescent研究
食管空肠,肝脏和肾脏组织从TG2−−/ C57BL / 6基因敲除小鼠13和相应的野生型小鼠(TG2 + / +)被临时冻结,保持在−70°C到测试。不固定的冻结部分被用作基质在间接immunofluorescent研究病人IgA的单引号和双标签(绿色)和单克隆抗体鼠标IgG1类anti-TG2抗体CUB7402和TG100(红色)(美国加州弗里蒙特,NeoMarkers),如前所述。7绑定病人IgA抗体检测与异硫氰酸荧光素共轭二次抗体(Dako A / S,斯特鲁普、丹麦;稀释1:120)。老鼠组织束缚老鼠anti-TG2抗体检测与兔子antimouse IgG1(从淀粉微球研究抗体诊断AB,乌普萨拉,瑞典)和罗丹明共轭猪兔抗体免疫球蛋白(Dako),稀释1:10 0,减少背景染色。
血清样本病人最初测试在1:5稀释和1:50,如果有必要,滴定在串行两倍稀释,直到终点。在双重免疫染色,五腹腔,三个疱疹样皮炎和五个控制样本与商业单克隆抗体anti-TG2一起使用。
EMA绑定模式评估食道的肌肉层和空肠血管,ARA绑定模式在肝脏和肾脏,对空肠绒毛和牛仔裤绑定模式,描述了其他地方。7
在控制双染色实验中,兔多克隆抗体纤连蛋白(Dako;稀释1:120)、calreticulin (Alexis生化药剂,圣地亚哥,加州,美国;稀释1:200),鼠标IgG2a单克隆抗体平滑肌肌动蛋白(ms - 113;NeoMarkers;稀释1:400 +兔抗体鼠标IgG2a;病菌,旧金山,加利福尼亚,美国)承认与罗丹明共轭antirabbit抗体由红色组件和人类IgA绑定之前被认为是绿色的。在其他控制实验中,TG2−−/组织在孵化前间接immunofluorescent研究人类重组可溶性TG2(法玛西亚),在0.05米三2μg /毫升,0.15 M氯化钠,pH值7.4(三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐(TBS)) 0.005 CaCl230分钟。
血清抗体也对灵长类动物的研究组织,猴食道,正常的人类空肠,和人类的阑尾,分别,如前所述。14日,15
ELISA检测
IgA血清抗体醇溶蛋白和自然人类TG2抗原纯化从正常红细胞被ELISA测定,所描述的其他地方。16日,17TG2抗体积极性的切断水平是先前建立的10%国际参考样品的吸光度。5,18IgA抗体calreticulin调查如下:0.2μg /好纯化calreticulin(σ化学品,圣路易斯,密苏里州,美国)一夜之间被涂在4°C ELISA板(Nunc-Immuno Maxisorp, Nunc,鲁开德那样,丹麦)在0.03 M NaHCO3缓冲区,pH值9.6。三洗后与含有0.1%渐变20的TBS,患者样本稀释1:10 0在TBS孵化为一个小时。广泛的洗涤后,绑定IgA与过氧化物酶抗体测定共轭兔抗体人类IgA (Dako),类似于TG2抗体检测。商业calreticulin抗体(Alexis)被用作积极控制。
统计学习小组之间的差异估计使用学生的t测试和χ2测试中,有两个跟踪概率。中位数是用来描述不连续在免疫荧光抗体滴定度。
结果
Coeliac-type积极性
在野生型小鼠组织,腹腔和疱疹样皮炎患者的血清样本而不是控制显示EMA -, ARA -, JEA-type IgA绑定(表1)。组织分布的积极性明显colocalised TG2单克隆TG2特定抗体所示(图1 a、2 a)。相反,在TG2基因敲除小鼠组织,没有教育津贴,ARA -或JEA-type绑定在腹腔,疱疹样皮炎,或控制样本,即使在低血清稀释1:5。类似的结果与IgA免疫球蛋白抗体腹腔患者(数据未显示)。没有见过组织积极性与CUB7402(图1 b 2 b)或TG100单克隆TG2特定抗体TG2−−/基因敲除小鼠,从而确认他们缺乏TG2。组织TG2−−/老鼠的正常形态、小肠粘膜,显示绒毛height-crypt深度超过5的比例。
人肌内膜(EMA), Coeliac-type网状(ARA),空肠的抗体的血清样本(牛仔裤)绑定蛋白敏感和控制患者转谷氨酰胺酶2基因敲除(TG2−−)和相应的野生型老鼠(TG2 + / +)组织
插入腹腔患者IgA(绿色)和特定单克隆抗体CUB7402转谷氨酰胺酶2 (TG2,红色插入)绑定到野生型老鼠食管在人肌内膜模式合并相同的黄色colocalisation(一个),但没有特定的绑定TG2敲除老鼠食管(B)。如果人类TG2插入TG2淘汰赛组织,绑定的抗体是类似于野生型组织(C)。(20μm栏。)
野生型(A, D)和转谷氨酰胺酶2基因敲除小鼠(B, C, E, F)与腹腔病人空肠双染色IgA(绿色)和特定单克隆转谷氨酰胺酶2 (TG2)抗体(红色)(A, B, C)和腹腔患者IgA(绿色)和纤连蛋白抗体(D, E, F)。腹腔IgA绑定完全colocalised组织TG2 (A)和部分colocalised纤连蛋白(D)在野生型空肠和TG2基因敲除小鼠与人类重组组织孵化TG2 (C、F)。腹腔IgA TG2单克隆抗体并没有绑定到TG2淘汰赛空肠(B),纤连蛋白(E)通常是礼物。(Bar = 30μm。)
纤连蛋白,细胞外基质的主要蛋白锚定TG2,被发现在TG2 + / +和TG2−−/组织(图2 d, E)。然而,在TG2缺陷小鼠没有绑定IgA腹腔或疱疹样皮炎患者的血清(图2 E)。
进一步确认EMA积极性引起腹腔疾病的血清样本和疱疹样皮炎患者TG2依赖,我们孵化TG2−−/组织与重组人类TG2 TG2插入空纤连蛋白结合位点。7当这些TG2涂层部分被用作基质,腹腔和疱疹样皮炎患者样本,以及单克隆TG2特定的抗体,显示典型的EMA -, ARA -和JEA-type绑定(图1 c,图2 c、F)。
共有57个(93.4%)的61腹腔样品和39(97.5%)的40个疱疹样皮炎样本显示清楚coeliac-type积极性与所有四个啮齿动物TG2 + / +器官。两个额外的腹腔血清样本只积极食管。然而,所有101个样本反应EMA, ARA,牛仔裤模式TG2−−/鼠标组织涂有人类与自然TG2 TG2也反应人类红细胞在ELISA(表1)。这些发现证明一些腹腔患者只有人类TG2特定的抗体。
其他immunofluorescent绑定模式在老鼠TG2缺乏组织
调查的频率结构除了肌内膜抗体/网状发生在腹腔或疱疹样皮炎患者,我们评估(甚至低滴定度)主动性在TG2−−/组织和比较结果和non-coeliac控制。
结合患者IgA平滑肌细胞或空肠上皮细胞经常被观察到TG2−−/组织与腹腔和疱疹样皮炎(1:5)低血清稀释样品但迅速消失,进一步稀释(表2)。滴定度中值这两个绑定类型是1:5的滴定度中值具体腹腔积极性TG2 + / +组织是1:400相同的样本。平滑肌细胞的反应是在non-coeliac同样普遍控制血清样本(表2),有相当大的重叠,95%可信区间(CI):腹腔样品19.4 - -42.9%;疱疹样皮炎样品13.5 - -41.5%;和控制:6.7 - -34.4%。
五腹腔血清样本,沿着轴的积极性TG2−−/绒毛发生收缩包对应连接到膜层粘膜肌层(图3 a、B)。这个绑定模式显然是不同于coeliac-type EMA和牛仔裤绑定和显示colocalisation平滑肌肌动蛋白在双疣状(图3 c)。这些肌动蛋白抗体似乎与EMA积极性当合并相同的样本测试野生型小鼠空肠(3 d图,箭头)。然而,纵或横截面的平滑肌束colocalised与肌动蛋白(图3 e)仍然不整合与TG2双疣状(图3)。肌动蛋白束也安排在人类空肠(图3 g),但双染色肌动蛋白和腹腔绑定与腹腔血清样本只包含EMA给分明主动性(图3 g)。这些发现表明,肌动蛋白反应不属于古典coeliac-type积极性。
(A, B)血清样本包含IgA的腹腔患者抗体(绿色)绑定到转谷氨酰胺酶2基因敲除(TG2−−)小鼠空肠绒毛(箭头)的轴线和colocalised与平滑肌肌动蛋白染色黄色红色(C)。注意人肌内膜(EMA)或空肠的缺乏(牛仔裤)抗体染色。在野生型小鼠空肠(D),轴向积极合并的IgA coeliac-type牛仔裤相同的血清样本(箭头所指),与肌动蛋白染色colocalised红(E)但其横截面仍不和谐地绿色(箭头)双重染色后TG2红色(F)。(G)的肌动蛋白束(红色)也同样安排在人类空肠但没有与典型的合并coeliac-type空肠的积极性(绿色)引起的腹腔患者血清样品只包含教育津贴。(酒吧= 30μm。)
IgA抗体绑定到上皮细胞在TG2−−/空肠发生在腹腔样本的26.3% (95% CI 15.1 - -37.4),这一比例显著高于在疱疹样皮炎(5.0%,95%置信区间0 - 11.8;p = 0.002)或控制患者(8.8%,95%置信区间0 - 18.5;p = 0.02)(表2)。这种积极性似乎colocalise calreticulin的免疫反应性。然而,意思是反应性的样品,没有这样的上皮染色时没有什么不同血清抗体calreticulin ELISA测定(光学密度0.235(标准差0.162)v0.197(标准差0.176))。血清样本的控制,只有麦胶蛋白抗体积极性与上皮细胞发生反应,但主要是平滑肌细胞。但是没有显著相关性上皮积极性,calreticulin,醇溶蛋白抗体水平(数据没有显示)。
在TG2−−/组织,我们也寻找附加绑定模式表明可能的腹腔(EMA)抗体交叉反应与其他结构或与其他转谷氨酰胺酶在TG2的缺失。然而,特定的控制和患者之间的差异(子)组,包括疱疹样皮炎患者,也不见了。
讨论
腹腔疾病是一种自身免疫性疾病的特点是生产抗体的组织结构的大阵,矩阵,和细胞抗原。1,3,8 -11日,19根据目前的发现,TG2特定的自体抗体似乎是最重要的。我们的结果与TG2淘汰赛组织首次直接证明诊断相关的教育津贴,ARA,牛仔裤绑定模式血清样本来自腹腔和疱疹样皮炎患者明显和专门TG2自身抗体依赖和目标的纤连蛋白结合细胞外TG2正常的人类和啮齿动物组织。大型系列TG2基因敲除小鼠的血清样品我们测试组织,TG2无关的非特异性EMA主动性没有观察到。补充这些结果,我们也经历了同样的与EMA积极的主题在腹腔疾病仍未经证实的(数据未显示)。因此,典型coeliac-type immunofluorescent积极性对TG2有着杰出的特异性抗体。Non-TG2抗体产生EMA绑定,虽然理论上可行,似乎非常罕见。
腹腔重病患者血清样本从一些经常显示复杂的抗体绑定。由于高背景结合上皮细胞或平滑肌细胞,这样的“困难”样本可能出现负EMA在低血清稀释20.但在ELISA与TG2反应。平滑肌细胞含有大量的TG2。然而,我们的研究结果并不支持这一概念,与平滑肌细胞反应是细胞内抗体TG2,同样观察到在TG2缺乏组织。我们发现了一个亚型平滑肌肌动蛋白抗体抗体。当EMA一起,肌动蛋白抗体绑定到绒毛的收缩包可能修改的外观coeliac-type积极性空肠和可能负责额外non-TG2其他研究者观察到相关组件。12然而,肌动蛋白抗体就不能引起EMA-type积极性没有TG2。
我们经常发现non-TG2相关抗体在腹腔及疱疹样皮炎患者的血清样本但在人肌内膜自身抗体滴定度低而。除了肌动蛋白抗体,绑定缺乏任何特定的形态外观和他们发生在不到一半的病人。醇溶蛋白抗体在腹腔和相关控制与较高的抗体绑定到空肠上皮细胞。这些特性支持观点,这些抗体可能是中等和不定地引起组织损伤促进增加展示不同的自我抗原免疫系统。19
我们现在观察到,腹腔疾病主要与人类TG2特定的自体抗体反应。交叉反应与鼠标TG2普遍(93.4%)而不是普遍在我们的病人腹腔。稍微不同的腹腔自身抗体主动性在灵长类动物和啮齿动物组织是很长一段时间诊断辩论的一个主题,并导致误解,ARA(啮齿动物特定)和EMA(灵长类动物特定的)组织自身抗体代表不同的抗体种群。21然而,证明人类TG2重组蛋白质插入鼠标组织包括腹腔自身抗原作为自然灵长类动物组织一样好,我们提供额外的证据证明“网状”和人肌内膜”“绑定模式组织类型和不同物种的相关检测方法TG2自身抗体。
我们当前的临床结果差异的理解古典腹腔疾病和疱疹样皮炎,除谷蛋白肠病皮肤IgA存款发生,仍然是不完整的。有人提出,真皮IgA免疫复合物或额外的抗体可能代表皮肤蛋白质。2最近的兴趣都集中在潜在的交叉反应与其他结构相关的转谷氨酰胺酶,其中一些表达表皮(一号、TG3 TG5, TG7)。4,22日,23而来自腹腔及疱疹样皮炎患者的血清抗体不承认一号,它最近已被证明,这两种疾病的交叉反应的一个子集TG3(表皮转谷氨酰胺酶)。23在疱疹样皮炎,病人也开发高活动性抗体特定TG3 TG3是真皮的一个组成部分存款和似乎是主要的自身抗原参与皮肤表现。23然而,疱疹样皮炎患者也产生自身抗体,主要与TG2反应和与肠病。所示,TG3特定抗体不会导致这些血清的EMA积极性需要TG2的目标。
以相似的方式,其他特定的表示类型的腹腔疾病可能与目标TG2和其他转谷氨酰胺酶。研究与mRNA表明TG5 7以及TG3广泛分布于各种组织4,22日,23但蛋白质数量和他们的组织化学的本地化non-dermal组织目前还未知。组织TG2基因敲除小鼠尤其适合自身抗体等寻找目标,因为显然这些老鼠的正常状态是最有可能由其他调节转谷氨酰胺酶。13我们也观察到,这些老鼠不开发空肠绒毛萎缩即使没有TG2函数。然而,与传统immunofluorescent技术,我们没有找到任何染色腹腔及疱疹样皮炎患者样本之间的差异。这不是和以前的结果相比,因为自身抗体在两种情况下可以交叉反应TG3 ELISA和他们唯一的分歧在于它们的相对活动性和特异性23然而,可能不会导致免疫荧光明显差异。我们也无法证明病人和控制染色差异TG2缺乏组织。几种解释是可能的,比如TG3反应自身抗体的一小部分23或TG3的少量蛋白质。事实上,TG3特定兔抗体在免疫印迹或皮肤上的部分工作,也未能在其他研究显示空肠immunofluorescent积极性。22日,23因此,进一步寻找额外的转谷氨酰胺酶的目标将需要更敏感的检测工具或暴露抗原。
总之,我们的研究结果证实EMA的身份,ARA,牛仔裤TG2特定的自身抗体和直接证明TG2的排斥作用的特定和诊断coeliac-type immunofluorescent反应。
确认
作者感谢Gerry Melino (IDI-IRCCS生物化学实验室,实验医学和生化科学,罗马大学“Tor Vergata”,罗马,意大利)的慷慨的捐赠TG2淘汰赛和野生型老鼠。腹腔疾病研究小组支持Paivikki和萨卡里Sohlberg基金会,该基金会的朋友大学儿童医院在芬兰坦佩雷大学医院的医学研究基金,和健康,芬兰科学院研究委员会资助决定73489号。Ilma Korponay-Szabo接受者的差旅补助从欧洲科学基金会转谷氨酰胺酶和Protein-Cross连接项目和芬兰腹腔的社会。本研究也由欧洲经济共同体委员会,具体RTD计划“的生活质量和生活管理资源”,qlrt - 1999 - 00037,“评价腹腔疾病的患病率及其遗传因素在欧洲人口”。它并不反映其意见和无法预计这个地区委员会的未来政策。