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摘要
背景和目的:尽管在了解腹腔疾病(CD)发病机制的免疫学方面取得了进展，但让麦胶蛋白通过肠道屏障的早期步骤仍在很大程度上未知。本研究的目的是确定麦胶蛋白是否激活了佐宁蛋白依赖的肠细胞胞内信号通路，导致肠通透性增加。
方法:在大鼠肠上皮(IEC-6)细胞培养物上，通过荧光显微镜和荧光光谱法研究麦胶蛋白对肠细胞肌动蛋白细胞骨架的影响。采用酶联免疫吸附法测定细胞培养上清液中佐诺霉素的浓度。在Ussing腔内安装体外肠组织，测定经皮上皮肠耐药(Rt)。
结果:与麦胶蛋白孵育的细胞导致可逆蛋白激酶C (PKC)介导的肌动蛋白聚合与佐宁蛋白释放暂时一致。在Ussing腔安装的兔肠粘膜上加入麦胶蛋白后，观察到Rt显著降低。用佐诺蛋白抑制剂FZI/0进行预处理可消除麦胶蛋白诱导的肌动蛋白聚合和Rt减少，但不影响佐诺蛋白的释放。
结论:麦胶蛋白在体外诱导肠上皮细胞释放佐诺霉素。通过PKC介导的细胞骨架重组和紧密连接打开激活佐曲蛋白通路，导致肠通透性迅速增加。
- 醇溶蛋白
- 肠上皮细胞细胞骨架
- 紧密连接
- 肠道通透性
- 腹腔疾病
- CD,腹腔疾病
- Rt，经上皮电阻
- Zot，闭塞带毒素
- tj,紧密连接
- PKC，蛋白激酶C
- 牛血清白蛋白，牛血清白蛋白
- PBS，磷酸盐缓冲盐水
- CV，变异系数
来自Altmetric.com的统计
乳糜泻(CD)是基因易感个体因摄入含谷物麸质而引发的自身免疫肠道病。小麦面筋中的麦胶蛋白部分代表了导致该疾病典型肠道损伤发展的环境因素。1虽然近年来我们在乳糜泻发病机理的免疫学方面取得了重大进展，2在了解麦胶蛋白通过肠上皮屏障被肠免疫系统识别的早期步骤方面，尚未取得重大成就。3.经证实，组织转谷氨酰胺酶对麦胶蛋白的脱酰胺作用可增强遗传易感性受试者HLA DQ2/DQ8 T细胞对麦胶蛋白肽的识别，并可能启动级联自身免疫反应，最终通过细胞因子和基质金属蛋白酶的产生导致黏膜破坏。3.4这些反应表明，麦胶蛋白和/或其分解肽以某种方式穿过肠上皮屏障，到达肠黏膜的固有层，并在那里被抗原提呈细胞识别。在生理条件下，肠上皮屏障被描述为大分子几乎无法穿透。5然而，乳糜泻的特征是通过肠上皮细胞的细胞旁通透性增强——也就是“漏肠”，这种情况允许大分子通过细胞旁间隙。6 -8我们最近报道了紧结(tj)渗透率调节剂zonulin，9在CD急性期上调。10在与其表面受体结合后，佐霉素诱导蛋白激酶C (PKC)介导的细胞内肌动蛋白丝聚合，这些蛋白直接连接到tj的结构蛋白，从而调节上皮通透性。9 -11已知肠细胞复杂的肌动蛋白细胞骨架网络通过与tj结构蛋白的直接相互作用参与细胞内分子的运输以及调节细胞旁通透性。12 -14本研究旨在建立麦胶蛋白与肠细胞之间的相互作用，特别强调麦胶蛋白对佐诺霉素释放的影响，以及随后激活导致细胞间tj分解的细胞内信号。
方法
IEC-6细胞培养
大鼠肠上皮细胞(IEC-6细胞)在细胞培养烧瓶(Falcon Labware, Reston, Virginia, USA)中培养，温度37°C，空气浓度95%，CO浓度5%2。培养基由Dulbecco的改良Eagle’s培养基(Gibco, Rockville, Maryland, USA)组成，含4500 mg/ld-葡萄糖，盐酸吡哆辛，5%热灭活(56°C, 30分钟)胎牛血清，0.1 U/ml牛胰岛素，4 mMl-谷氨酰胺，50 U/ml青霉素，50 μg/ml链霉素。
醇溶蛋白肽
麦胶蛋白(Sigma, St Louis, Missouri, USA)是在70%乙醇溶液(20 mg/ml)中新鲜制备的，并在细胞培养基中进行一系列稀释，稀释范围从1:20(最终浓度:麦胶蛋白1 mg/ml;乙醇3.5%)至1:200稀释(最终浓度:麦胶蛋白0.1 mg/ml;乙醇0.35%)。必要时用1 M NaOH缓冲液将pH调至7.4。在最终浓度的牛血清白蛋白(BSA)和玉米玉米醇溶蛋白(Sigma)中加入类似浓度的乙醇作为阴性对照。为了避免乙醇对培养细胞的任何直接影响，最终溶液中的乙醇浓度从不超过3.5%。还获得了合成肽31-55和22-39(生物聚合物实验室，马里兰大学，巴尔的摩，美国)，在Ussing室试验中测试其渗透活性。
细胞内f -肌动蛋白的荧光显微镜分析
细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤，然后在0.25%胰蛋白酶、1 mM EDTA溶液(Gibco brl)中暴露2-3分钟，轻轻分离细胞。细胞(2×104细胞/ml)悬浮在培养基中，并播种到8个腔载玻片(Nalge Nunc International)上24小时。添加的麦胶蛋白浓度(0.1-1.0 mg/ml)和暴露时间(15,30,45,60分钟)不断增加。然后在PBS中洗涤两次，在室温下3.7%多聚甲醛PBS (pH 7.4)中固定15分钟，在室温下用0.5% TritonX-100 PBS (Sigma)透化10分钟，在37℃的PBS中用0.3 μM荧光素phalloidin (Sigma)孵育30分钟。再洗两次后，在pH 8.0条件下用甘油- pbs(1:1)固定盖玻片。用荧光显微镜(蔡司，Thornwood，美国纽约)对结果进行分析。在选定的实验中，用最终浓度为0.1 mg/ml的玉米醇溶蛋白取代麦胶蛋白。
荧光光谱法定量f -肌动蛋白
细胞内F-actin用荧光光谱法进行荧光测定。按照上述方法分离细胞后，IEC-6细胞(0.2×106细胞/ml培养基)接种到24孔板上，培养72小时(37°C, 5% CO2）;用麦胶蛋白(0.1 mg/ml)孵育，在37°C和4°C下进行不同暴露时间(15、30、45、60分钟);细胞骨架稳定缓冲液(KCl 75 mM, MgSO4 3 mM，乙二醇四乙酸1 mM，咪唑10 mM, DTT 0.2 mM，抑肽酶10 μg/ml, PMSF 0.1 mM)洗涤2次，3.7%甲醛/缓冲液固定15分钟，透化(0.2% Triton X-100/缓冲液，5分钟)，洗涤2次，室温下NBD-phallacidin 0.3 μM染色30分钟;两次洗涤后，加入冰冷高压液相色谱级甲醇开始提取NBD-phallacidin，在−20°C下继续提取一夜。
荧光测量使用SLM型8000荧光光谱仪(Spectronic Instruments, Inc.， Rochester, New York, USA)进行。激发在464 nm处，发射在536 nm处。激发和发射狭缝设置在8 nm处。
夹芯酶联免疫吸附法(ELISA)测定佐诺林定量
为了使用亲和纯化的抗闭塞带虫毒素(Zot)抗体(如前所述)测量细胞培养上清液中的佐奈林浓度，开发了一种夹心ELISA。9在PBS- t (PBS中的0.05% Tween-20)中制备了5种不同的200 μg/ml Zot溶液(0.7、3.1、12.5、50和200 ng/ml)的连续稀释倍数，并用于生成标准曲线。首先，在96孔微孔板的每孔(100 μl/孔)中加入10 μg/ml PBS抗zot IgG溶液。在+4℃孵育48小时后，用PBS-T洗涤三次，用含1% BSA的PBS-T (300 μl/孔)封堵过夜。排去阻塞液后，加入5个Zot系列标准品和细胞培养基样品一式两份(100 μl/孔)，室温下连续摇匀孵育2小时。PBS-T洗涤三次后，每孔加入PBS-BSA1%-PEG 4%的生物素化抗zot抗体溶液0.5 μg/ml (100 μl/孔)，室温振荡孵育1小时。在PBS-T中洗涤6次后，用0.1 M Tris-HCl, 1 mM MgCl中1:16 000稀释的外渗蛋白(Sigma)孵育15分钟2，室温下pH值7.3时BSA 1%。用PBS-T再次洗涤三次，在37℃下，用0.1 ml对硝基苯磷酸盐底物在甘氨酸缓冲液(pH 10.7，含0.1 M NaCl, 0.1 mM ZnCl)中孵育30分钟2， 1 mM MgCl2)。用microplate autoreader (Molecular Devices thermoax microplate Reader, USA)测量405 nm处的吸光度。为了确定ELISA夹心法的分析内和分析间精密度，使用两个含有不同浓度的zoonulin的样品连续3天进行3次重复，计算变异系数(CV)。ELISA夹心法的分析间检验产生的变异系数(CV)值为9.8%。第1天检测内CV为4.2%，第2天为3.3%，第3天为2.9%。
抑制剂
为了探索导致细胞骨架重排的麦胶蛋白激活途径(s)，我们使用特定抑制剂(包括蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺(50 μg/ml)和PKC特异性抑制剂CGP41251 (1 μM))进行了荧光光谱法实验。14在合成肽FZI/0 (1 μg/ml;生物聚合物实验室，马里兰大学，巴尔的摩，美国马里兰州)，专门竞争佐农霉素与受体的结合。11
我们房间
实验如前所述进行。14简单来说，成年雄性新西兰白兔(2-3公斤)颈椎脱位牺牲。取出一段20厘米的回肠段，冲洗掉肠内容物，沿肠系膜边界打开，剥离肌肉层和浆膜层。然后将制备好的8片粘膜安装在有机玻璃Ussing腔中，连接到电压钳装置(EVC 4000;World Precision Instruments, Saratosa, Florida, USA)，用新鲜制备的缓冲液(mM)浸泡:NaCl 53;氯化钾5;Na2所以430.5;甘露醇30.5;Na2HPO41.69;不2阿宝40.3;CaCl21.25;MgCl21.1;NaHCO3.25.浸泡液保持在37°C，水套储液器连接到恒温循环泵，并使用95% O进行充气2和5%的公司2。测量电位差，如前所述计算短路电流和组织电阻(Rt)。14
将组织暴露于麦胶蛋白(在存在或不添加终浓度为1 μg/ml的唑奴林抑制剂合成肽FZI/0的情况下)或两种麦胶蛋白衍生合成肽(无毒肽AA 22-39或有毒肽31-55，终浓度0.1 μg/ml)中，每10分钟监测一次电参数。
统计分析
学生的t， Test用于配对和非配对分析。当p值小于0.05时达到统计学显著性。
结果
细胞内f -肌动蛋白的荧光显微镜分析
用麦胶蛋白孵育IEC-6细胞会导致细胞内肌动蛋白丝重组，仅在麦胶蛋白孵育15分钟后，荧光显微镜就可以看到这种重组，其特征是f -肌动蛋白重新分布到细胞皮层下腔室(图1A)。当IEC-6细胞暴露于来自玉米(乳糜泻患者的无毒谷物)或BSA阴性对照的相似浓度的玉米醇溶蛋白(图1B)时，未观察到显著变化。麦胶蛋白对肌动蛋白细胞骨架的影响是可逆的，因为停药两小时后，肌动蛋白细胞骨架恢复到基础状态(图1D)。
麦胶蛋白(0.1 mg/ml)对IEC-6细胞骨架的影响。(A)麦胶蛋白暴露的IEC-6细胞的荧光显微镜。将培养的细胞与麦胶蛋白孵育15分钟后，肌动蛋白丝发生重组，其特征是重新分布到细胞皮层下腔室，随后细胞变圆。当细胞暴露在类似浓度的玉米蛋白(B)或牛血清白蛋白阴性对照(C)下时，可以观察到正常的f -肌动蛋白荧光模式。麦胶蛋白对肌动蛋白细胞骨架的影响是可逆的，在从培养基中退出麦胶蛋白两小时后，肌动蛋白细胞骨架恢复到基础状态(D)。放大倍数:40×。
荧光光谱法定量f -肌动蛋白
荧光光谱法定量f -肌动蛋白显示，麦胶蛋白诱导聚合肌动蛋白丝的细胞含量显著增加(图2A)。图2B显示了肌动蛋白聚合的时间剖面，在60分钟达到峰值(p<0.0001)， 2.5小时后回到基线值。+4℃的温度未能抑制麦胶蛋白诱导的f -肌动蛋白变化(数据未显示)，排除了肌动蛋白聚合与麦胶蛋白内吞作用相关的可能性。15
用荧光法定量IEC-6细胞中的f -肌动蛋白。(A)麦胶蛋白(0.1 mg/ml)诱导肌动蛋白丝细胞含量的时间依赖性增加，早在接触蛋白质15分钟后就开始了。荧光作为相对荧光强度单位进行测量。(B) IEC-6细胞暴露于0.1 mg/ml的麦胶蛋白中，在指定的时间间隔提取NBD-phallacidin，并用荧光光谱法测定。肌动蛋白聚合的时间曲线在60分钟时达到峰值。肌动蛋白聚合率以对照组的百分比表示。每个时间点N =4。
麦胶蛋白对肌动蛋白聚合的影响与新蛋白质的合成无关
为了确定麦胶蛋白对肌动蛋白聚合的作用是否依赖于新蛋白的合成，我们在蛋白合成抑制剂环己酰亚胺存在或不存在的情况下进行了实验。用环己酰亚胺(50 μg/ml，在暴露于麦胶蛋白前30分钟和整个1小时)预处理细胞并没有抑制麦胶蛋白诱导的肌动蛋白聚合(图3)。
环己酰亚胺和CGP41251对麦胶蛋白诱导的细胞骨架重排的影响。暴露于麦胶蛋白的IEC-6细胞在暴露于麦胶蛋白前30分钟和整个暴露过程中分别用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺或蛋白激酶C (PKC)抑制剂CGP41251进行预处理。未经过预处理的麦胶蛋白暴露细胞作为阳性对照，而牛血清白蛋白(BSA)暴露细胞作为阴性对照。用环己酰亚胺预处理不影响麦胶蛋白诱导的肌动蛋白聚合，表明这种现象与新蛋白合成无关。相比之下，CGP41251预处理完全阻断了麦胶蛋白诱导的肌动蛋白聚合，这表明麦胶蛋白对细胞细胞骨架的作用是由PKC介导的。结果以BSA暴露细胞中获得的肌动蛋白聚合的百分比表示。与阴性对照相比，*p<0.05， **p<0.01。
PKC抑制剂CGP41251预处理
zonulin和Zot对肌动蛋白聚合的影响都依赖于PKC-α9日,14我们选择建立PKC-α抑制剂CGP41251对麦胶蛋白诱导的肌动蛋白聚合的影响。在麦胶蛋白暴露前30分钟和整个1小时内添加的PKC抑制剂CGP 41251 (1 μM)几乎完全抑制了麦胶蛋白对f -肌动蛋白的作用(图3)。
扭扭蛋白在麦胶蛋白诱导的肌动蛋白聚合中的作用
由于麦胶蛋白对细胞细胞骨架的作用与之前看到的左旋霉素及其原核类似物Zot相似，16日,17我们决定确定麦胶蛋白诱导的肌动蛋白聚合是否由佐诺蛋白介导。
麦胶蛋白诱导肠细胞释放佐农蛋白
用夹心ELISA法测定麦胶蛋白暴露细胞培养液中佐诺林的浓度，间隔时间增加。用0.1 mg/ml麦胶蛋白孵育15分钟后，细胞培养上清液中就可检测到佐诺蛋白，30分钟时达到峰值，60分钟后恢复到基线(图4)。佐诺蛋白的分泌量取决于麦胶蛋白浓度，用1 mg/ml麦胶蛋白孵育细胞时，佐诺蛋白的峰值释放量为2200 pg/ml。在暴露于牛血清白蛋白的细胞中未发现可检测到的佐诺蛋白(图4)。佐诺蛋白的释放暂时先于麦胶蛋白暴露后肌动蛋白聚合的时间分布，在动力学上与之相似(图2B)，这表明麦胶蛋白诱导的肌动蛋白聚合依赖于佐诺蛋白。
麦胶蛋白对IEC-6细胞释放佐宁蛋白的影响。麦胶蛋白0.1 mg/ml诱导细胞培养基中佐小蛋白的释放，在麦胶蛋白孵育后30分钟达到峰值，当细胞与麦胶蛋白孵育60分钟时恢复到基线水平。BSA，牛血清白蛋白。每一个点代表四次测定的平均值。
zonulin抑制剂FZI/0对麦胶蛋白依赖性肌动蛋白聚合的影响
我们最近证明，左管霉素对细胞骨架和tj通透性的影响可以被FZI/0抑制，FZI/0是一种合成肽，它模拟了左管霉素结合域，因此阻断了左管霉素激活的细胞内信号传导。11在实验前和整个实验过程中，用FZI/0 (1 μg/ml)预处理30分钟，抑制了麦胶蛋白诱导的肌动蛋白聚合峰值(106.8±0.5%)(101.8±0.5;p < 0.05)。合成肽FZI/0或PKC抑制剂CGP41251预处理均未抑制麦胶蛋白孵育后的旋毛虫蛋白释放(图5)。这些结果表明，FZI/0对麦胶蛋白诱导的肌动蛋白聚合的抑制作用是由于对旋毛虫蛋白受体的堵塞，而不是对麦胶蛋白暴露后肠细胞的旋毛虫蛋白释放产生影响。
合成肽FZI/0或蛋白激酶C抑制剂CGP41251对麦醇溶蛋白诱导的IEC-6细胞左旋霉素释放的影响。将FZI/0和CGP41251添加到IEC-6细胞后，均未诱导旋流蛋白的分泌。这两种分子都不影响麦胶蛋白介导的佐宁蛋白分泌，这表明它们对麦胶蛋白介导的肌动蛋白聚合的抑制作用发生在IEC-6细胞分泌佐宁蛋白的下游。麦胶蛋白和牛血清白蛋白(BSA)对佐小蛋白释放的影响分别显示为阳性对照和阴性对照。
麦胶蛋白对肠通透性的影响
在Ussing腔安装的兔肠黏膜中添加α-麦胶蛋白可导致Rt的降低，且在孵育30分钟后显著降低。对麦胶蛋白毒性肽31-55也观察到了同样的效果，但对麦胶蛋白无毒肽22-39则没有(图6A)。麦胶蛋白的渗透作用是可逆的，在从粘膜浴液中去除该肽30分钟内，组织Rt恢复到基线水平(数据未显示)。用合成肽FZ1/0 (1 μg/ml;图6B)，提示麦胶蛋白对Rt的作用依赖于佐宁蛋白。
麦胶蛋白对兔肠粘膜组织上皮电阻(Rt)的影响。(A)添加α-麦胶蛋白肽导致Rt显著降低，在孵育几分钟后检测到。麦胶蛋白毒性肽31-55也观察到了同样的效果，但麦胶蛋白无毒肽22-39没有。在没有麦胶蛋白(没有麦胶蛋白)的情况下，Rt没有观察到变化。(B) zonulin抑制剂FZI/0的处理不影响Rt，当组织被FZI/0预处理时，麦胶蛋白对Rt下降的影响被显著抑制。
讨论
肠上皮是最大的粘膜表面，提供了外部环境和哺乳动物宿主之间的界面。在生理条件下，肠是通过跨细胞途径从肠腔主动运输液体和电解质的主要部位。然而，细胞旁途径是被动的上皮间溶质流动的主要途径。健康成熟的肠道黏膜及其完整的tj是大分子通过的主要屏障。此外，肠道屏障是防御外源抗原、毒素和大分子通过口服/肠道途径进入宿主的主要器官。在这种健康状态下，数量较少但具有免疫学意义的抗原部分会穿过防御屏障。这些抗原通过两条功能途径在黏膜上被吸收。绝大多数被吸收的蛋白质(高达90%)通过跨细胞途径穿过肠道屏障，随后发生溶酶体降解，将蛋白质转化为较小的非免疫原性多肽。蛋白质的其余部分以完整分子的形式运输，导致抗原特异性免疫反应。后一种现象利用了细胞旁途径，其中涉及细胞间tj的微妙但复杂的调节，可促进抗原口服耐受。 When the integrity of the tj system is compromised such as during prematurity or exposure to radiation, chemotherapy, and/or toxins, an immune response to environmental antigens (including autoimmune diseases and food allergies) may develop.18对免疫反应很重要的特定细胞靠近腔内抗原，占体内所有产生免疫球蛋白细胞的80%。19日,20.肠免疫反应性的另一个重要因素是主要组织相容性复合体。HLA I类和II类基因位于第6号染色体上的主要组织相容性复合体位点。这些基因编码糖蛋白，糖蛋白结合多肽并将多肽从细胞质运送到细胞膜，构成hla -多肽复合体，该复合体可被肠粘膜中的某些T细胞受体识别。21 -23
对包括乳糜泻在内的至少50种疾病的易感性与特定的HLA I类或II类等位基因有关。这些疾病的一个共同点是存在几种导致自身免疫过程的先决条件。发展自身免疫过程所需的第一个组成部分是宿主免疫系统识别并可能误解胃肠道内出现的环境抗原的遗传易感性。其次，宿主必须接触到抗原。最后，抗原必须在其从肠腔到肠道粘膜下层的细胞旁通道(通常由tj能力阻止)后呈递到胃肠道粘膜免疫系统。24 -26在所有病例中，通透性增加似乎出现在疾病发生之前，并导致抗原传递异常，从而触发导致自身免疫反应的多器官过程。27
虽然我们对tj超微结构和细胞内信号事件的了解在过去十年中取得了显著进展，11相对而言，对其继发于细胞外刺激的病理生理调节知之甚少。因此，由于我们对tj调控所涉及的细胞外信号的了解有限，tj受影响的疾病的密切致病机制仍未被探索。13的发现霍乱弧菌衍生的Zot已经揭示了肠道细胞旁通路调制的复杂机制11日,14日,19并使我们能够确定一种参与tj调节的肠道哺乳动物类似物。9日,10日,16我们将这种类似物命名为zonulin，它代表了一种新的真核蛋白，可以可逆地打开肠道tj。9我们最近证明了在乳糜泻早期zonulin表达增加，10提示所报道的tj在疾病早期就打开了28日,29可能是zonulin介导。
本文报道的研究旨在建立肠细胞麦醇溶蛋白暴露与佐农霉素释放之间的联系。我们的研究结果表明，在体外正常肠上皮细胞中，麦胶蛋白激活了佐宁蛋白信号通路。仅在麦胶蛋白孵育几分钟后观察到的细胞反应的特征是显著的细胞骨架重组，肌动蛋白丝主要在细胞内皮质下腔室重新分布。荧光光谱实验显示，这种细胞骨架重组与细胞内肌动蛋白聚合速率增加所导致的f -肌动蛋白的增加有关。我们可以排除麦胶蛋白诱导的f -肌动蛋白的增加是由于新的蛋白质合成，因为它不受细胞与环己酰亚胺(一种蛋白质合成的有效抑制剂)预孵育的影响。在低温下进行的实验也排除了肌动蛋白丝的内吞依赖性聚合。相反，在用PKC抑制剂预处理后观察到的对麦胶蛋白作用的抑制表明，肌动蛋白聚合依赖于PKC细胞内信号传导。此外，在Ussing室中进行的实验表明，在体外肠粘膜中添加麦胶蛋白多肽会在几分钟内导致Rt的显著降低。我们之前已经证明了30.在与麦胶蛋白诱导的Rt变化幅度相似(从基线值下降20%)之后，大蛋白可以穿过肠道屏障(见图6)。因此，可以假设，通过荧光显微镜和荧光光谱法观察到，麦胶蛋白诱导的细胞骨架重组作用于tj结构蛋白，导致Rt和肠道对包括麦胶蛋白在内的大分子的通透性发生变化。
有趣的是，仅在麦胶蛋白孵育60分钟后检测到的肌动蛋白聚合峰值暂时紧跟在IEC-6细胞释放佐宁蛋白之后，这表明这一事件是继发于麦胶蛋白依赖的佐宁蛋白释放。因此，我们选择研究麦胶蛋白诱导的细胞骨架效应是否由佐诺蛋白介导。我们之前已经证明，在与其特定的表面受体结合后，佐小蛋白诱导肌动蛋白聚合，然后细胞骨架再分配到皮层下细胞室。9zoonulin诱导的细胞骨架改变之后是tj的拆卸，导致肠细胞旁通透性增加。9
实验是用合成的肽FZI/0进行的，该肽可以竞争并阻止zoonulin与其受体的结合，11显示完全抑制了麦胶蛋白诱导的F-actin增量峰值，以及完全抑制了体外肠Rt中麦胶蛋白诱导的降低。然而，合成肽预处理并不能抑制麦胶蛋白诱导的左旋肌蛋白释放。这些结果表明，FZI/0对麦胶蛋白诱导的肌动蛋白聚合发挥抑制作用的途径是阻断麦胶蛋白受体，而不是影响麦胶蛋白的释放。
在这一阶段，我们不知道是否需要麦胶蛋白与特定的肠细胞受体相互作用，还是非特异性反应的结果。然而，观察发现，只有当添加到肠上皮细胞的粘膜部分时，麦胶蛋白才会诱导佐诺蛋白的释放和Rt的变化(数据未显示)，这表明麦胶蛋白的极化效应依赖于与肠细胞刷状边界上的表面受体的相互作用。
考虑到本研究的结果和我们使用缓解期腹腔病人和健康对照者的肠道组织生成的初步数据(S Drago, A Fasano，未发表)，我们可以假设麦胶蛋白可能的作用机制导致了佐宁蛋白介导的肌动蛋白聚合和肠通透性的增加。接触到麦胶蛋白的肠细胞通过在肠腔中分泌旋毛虫蛋白进行生理反应。在正常的肠道组织中，这种分泌在时间上是自我限制的(见图4)，而在乳糜泻的肠道组织中，左管蛋白系统是慢性上调的，10导致肠内对包括麦胶蛋白在内的大分子的通透性持续增加，从管腔到固有层。在这里，麦胶蛋白被组织转谷氨酰胺酶脱酰胺，然后被携带抗原提呈细胞HLA-DQ2/DQ8识别，在基因易感的受试者中触发乳糜泻自身免疫反应的发生。挑战这一假设的实验目前正在我们的实验室进行中。
致谢
这项工作得到了国家卫生研究院DK-48373拨款(AF)的部分支持，以及来自Assessorato Igiene, Sanità e Assistenza Sociale, Regione Autonoma della Sardegna，卡利亚里和Ministero dell 'Università e della Ricerca scientiica e tecnological(配额40%)，意大利罗马(SDV)的拨款。