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条文本gydF4y2Ba

菜单条gydF4y2Ba
上皮细胞生物学gydF4y2Ba
谷氨酰胺缺失通过肠细胞燃料底物的消耗促进肿瘤坏死因子诱导的Caco-2细胞细菌易位gydF4y2Ba
免费的gydF4y2Ba
  1. E C克拉克gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  2. S D帕特尔gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  3. P R查德威克gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  4. G WarhurstgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  5. 一个咖喱gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  6. G L卡尔森gydF4y2Ba1gydF4y2Ba
  1. 1gydF4y2Ba肠屏障研究小组，外科，曼彻斯特大学，希望医院，曼彻斯特，英国gydF4y2Ba
  2. 2gydF4y2Ba英国曼彻斯特大学希望医院微生物学系gydF4y2Ba
  3. 3.gydF4y2Ba肠屏障研究小组，曼彻斯特大学，希望医院，曼彻斯特，英国gydF4y2Ba
  4. 4gydF4y2Ba英国曼彻斯特皇家医院电子显微镜部gydF4y2Ba
  1. 通信:gydF4y2Ba
    G L Carlson医生，英国索尔福德埃克尔斯老路M6 8HD希望医院临床科学大楼;gydF4y2Ba
    gcarlson在{}fs1.ho.man.ac.ukgydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

背景和目的:gydF4y2Ba损伤后诱导肠内细菌穿越肠上皮的因素仍不清楚。本研究的目的是研究谷氨酰胺代谢、能量供应和炎症介质之间的相互作用，以确定非致病菌在培养肠细胞中的易位。gydF4y2Ba

方法:gydF4y2Ba肿瘤坏死因子α (TNF-α)对肿瘤转位的影响gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba在谷氨酰胺代谢产物和抑制剂存在的情况下，研究Caco-2上皮单分子层的C25。同时测量经上皮电阻(TEER)和荧光黄通量来评估对细胞旁通路的影响。乳酸脱氢酶释放量监测肠细胞完整性。在这些实验条件下，用透射电子显微镜对单层膜进行成像。gydF4y2Ba

结果:gydF4y2Ba暴露于基底外侧肿瘤坏死因子-α (20 ng/ml) 6小时可诱导易位gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba但仅在同时伴有谷氨酰胺耗竭时(p<0.01)。添加谷氨酰胺2小时可抑制易位(p<0.01)，但不含非谷氨酰胺氨基酸的等氮混合物则不能。抑制谷氨酰胺向α-酮戊二酸的转化，但不阻断谷胱甘肽或多胺的合成，也可诱导TNF-α存在的易位。诱导细菌易位的操作与肠细胞ATP水平的显著降低相关。未观察到这些处理对细胞旁通透性或乳酸脱氢酶释放的影响。易位发生的条件与肠细胞空泡内细菌的存在有关，而与细胞旁间隙无关。gydF4y2Ba

结论:gydF4y2Ba在炎症条件下，谷氨酰胺作为肠细胞燃料底物的有效性对于保护微生物的功能屏障是必不可少的。在急性谷氨酰胺耗竭的情况下，细胞因子介导的细菌易位似乎主要是一个跨细胞过程。gydF4y2Ba

  • 肠屏障gydF4y2Ba
  • 败血症,细胞因子gydF4y2Ba
  • Caco-2细胞gydF4y2Ba
  • 谷氨酰胺gydF4y2Ba
  • 肿瘤坏死因子gydF4y2Ba
  • Gln,谷氨酰胺gydF4y2Ba
  • TNF-α，肿瘤坏死因子αgydF4y2Ba
  • DMEM，杜尔贝科改良的鹰培养基gydF4y2Ba
  • FCS，胎牛血清gydF4y2Ba
  • 菌落形成单位gydF4y2Ba
  • HBSS，汉克的平衡生理盐水gydF4y2Ba
  • AOA, aminooxyacetategydF4y2Ba
  • BSO, buthionine sulphoximinegydF4y2Ba
  • 爱科技,α酮戊二酸gydF4y2Ba
  • DFMO, difluoromethylornithinegydF4y2Ba
  • 经上皮电阻gydF4y2Ba
  • LY,路西法黄色gydF4y2Ba
  • LDH,乳酸脱氢酶gydF4y2Ba

http://dx.doi.org/10.1136/gut.52.2.224gydF4y2Ba

来自Altmetric.com的统计gydF4y2Ba

    请求的权限gydF4y2Ba

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    谷氨酰胺是人体内最丰富的游离氨基酸gydF4y2Ba1gydF4y2Ba并在肠细胞、免疫系统细胞等快速分裂细胞的中介代谢中起关键作用。虽然肠道所需的大部分能量来自谷氨酰胺氧化，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba谷氨酰胺也是肠道合成抗氧化剂谷胱甘肽的关键前体gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba此外，它还能刺激肠内多胺的合成，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba在控制肠细胞增殖和修复中起着重要作用。长期的全肠外营养导致的小肠黏膜萎缩是可以预防的gydF4y2Ba5gydF4y2Ba或逆转gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在静脉喂养方案中加入谷氨酰胺。谷氨酰胺被认为是有条件地必需的，因为在应激条件下，包括创伤、败血症和缺血再灌注损伤，对谷氨酰胺的需求可能超过体内其他组织提供它的能力。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba

    胃肠道的屏障功能已被证明在压力或炎症后受损。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba有人认为，这可能在细菌和细菌产物在肠壁的易位中发挥作用，导致败血症、长时间的全身炎症反应和多器官衰竭。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α (TNF-α)是全身炎症反应的关键介质，在严重疾病状态下会全身释放gydF4y2Ba10gydF4y2Ba在肠道局部。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba此外，TNF-α已被证明对体外细胞间连接的通透性有显著的调节作用。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba给药谷氨酰胺已被证明可减少多发性受伤患者的脓毒性并发症gydF4y2Ba13gydF4y2Ba并显著减少肠道屏障功能和细菌易位在体内的损伤gydF4y2Ba14日,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba和体外gydF4y2Ba16gydF4y2Ba危重症和肠道损伤模型。谷氨酰胺产生这些效应的机制目前还不清楚。在应激条件下肠细胞提供主要燃料底物可能是谷氨酰胺在肠道屏障功能障碍中的潜在治疗作用的基础。然而，防止细菌易位可能同样与谷氨酰胺在维持肠道谷胱甘肽或多胺水平方面的作用有关，甚至与对免疫系统的刺激作用有关，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba而不是胃肠道。gydF4y2Ba

    本研究的目的是检验细胞谷氨酰胺有效性在肠道细胞调节细菌易位中起关键作用的假设，并确定哪些谷氨酰胺代谢途径参与了这一作用。建立了细胞因子介导的细菌易位体外模型，可以直接研究肠细胞、TNF-α、谷氨酰胺和易位细菌之间的相互作用，而不受免疫细胞、肠道运动、肠道血流、细菌-细菌相互作用和肠道黏液层等潜在混杂因素的影响。gydF4y2Ba

    材料和方法gydF4y2Ba

    Caco-2单分子膜的制备gydF4y2Ba

    Caco-2细胞(ATCC, Manassas USA，传代100-120)在2×10进行种子培养gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞/厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba到24毫米Transwell(康宁Costar，美国)双胞体系，聚碳酸酯膜(3 μm孔径，4.7厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表面积)。单分子膜生长在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中，添加10%胎牛血清(FCS，含0.1 mM谷氨酰胺(Gln))、2 mM谷氨酰胺和2 mM非必需氨基酸，5 IU/ml青霉素和5 μg/l链霉素(Gibco, Paisley UK)。细胞在37°C的5% CO中培养gydF4y2Ba2gydF4y2Ba/95%空气气氛，每3-4天更换一次介质。在每次实验开始时，将含有2mm Gln的DMEM替换为实验介质，具体如下。gydF4y2Ba

    测量电阻和细胞旁渗透性gydF4y2Ba

    通过使用欧姆计(Evometer World Precision Instruments, Sarasota, USA)连续测量上皮间电阻(TEER)来确定单层的完整性。播种后18 - 24天使用单分子膜，TEER为219 (2)Ω/cmgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(平均(SD), n = 124)。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba用透射电镜排除Caco-2细胞的多层结构(数据未显示)。记录不同实验介质处理前后各实验的TEER。gydF4y2Ba

    在细菌易位的同时，通过测量荧光黄(LY;Sigma-Aldrich, Poole, UK)从Transwell的顶部到基底腔。LY是一种荧光染料，在这些实验中被用作细胞旁渗透性的标记物gydF4y2Ba18gydF4y2Ba因为它不会被代谢gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba，与甘露醇等其他渗透性标记物形成对比。初步研究(数据未显示)证实，在所用浓度下与LY共孵育不会影响生长特性或活力gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba和接种LY溶液，最多10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba菌落形成单位(CFU)/mlgydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba不影响LY分析的精密度。在接种细菌的同时，在根尖腔中加入LY (50 μM)。4小时后，用LS 50B发光光谱仪(perkins - elmer, Cambridge, UK)根据标准浓度曲线(激发430 nm，发射535 nm)测量基底外侧腔内的LY浓度。gydF4y2Ba

    制备的细菌gydF4y2Ba

    大肠杆菌gydF4y2BaC25，之前已经被证明可以在Caco-2单分子层中转运，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba由E Deitch博士(UMDNJ，美国新泽西州)慷慨提供。用2号营养肉汤(实验室M, Bury, UK)接种gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaC25和孵育12小时至平台期，产生浓度为~ 10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba菌落形成单位(CFU)/ml，在血琼脂平板上连续稀释培养。然后以5000转/分钟的速度离心5分钟。除去上清液，细菌重新悬浮在Hank的平衡生理盐水中(HBSS;Gibco，佩斯利，英国)，添加10mm碳酸氢钠和180 mg/dl葡萄糖，pH平衡为7.4。gydF4y2Ba

    细菌易位的测定gydF4y2Ba

    所有易位测量都在HBSS中进行，以尽量减少细菌生长对易位细菌计数的影响。HBSS降低了gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba与DMEM相比，C25增加了约1000倍，这可以从加倍时间的显著增加(在DMEM中为21(3)分钟)得到证明gydF4y2BavgydF4y2Ba74(6)分钟HBSS;n = 12)。初步研究(数据未显示)表明，HBSS中单分子TEER和LY通透性至少6小时内保持不变。在每个孵育期结束时，用37°C的HBSS洗涤单分子膜两次，取出实验培养基。然后让单分子膜在HBSS中平衡30分钟。去除实验介质前TEER未恢复到10%以内的单分子层被丢弃。然后在Transwell的尖室接种gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaC25到最终浓度为10gydF4y2Ba8gydF4y2BaCFU /毫升。将细菌与LY一起加入，以便同时估计细菌通量和细胞旁渗透性。经过4小时的潜伏期(37°C;5%的公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba/95%室内空气)，在此过程中，允许细菌从Transwell的顶部腔室转移到基底腔室，浓度gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba在Transwell的基础室中，用HBSS进行连续稀释，然后在血琼脂上镀膜，在5% CO中培养过夜gydF4y2Ba2gydF4y2Ba气氛在37°C。易位的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba在基础腔内以log CFU/ml表示。gydF4y2Ba

    显微镜检查gydF4y2Ba

    用于显微镜检查的样品的制备gydF4y2Ba

    孵育结束时，用0.1 mol/l碳酸氢钠缓冲液中2.5%戊二醛固定具有粘附性肠细胞单分子膜。固定后，将膜切成5mm的切片，再次在0.1 mol/l碳酸钙酸钠蔗糖中洗涤，用1%四氧化锇固定。然后在0.1 mol/l碳酸氢钠中再次洗涤单层膜，在100%乙醇中脱水，并通过环氧丙烷嵌入琼脂100树脂(琼脂科学，英国埃塞克斯)。聚合后，用超显微切片(Reichert Ultracut, Vienna, Austria)对合成块进行超薄(60纳米)切片。切片安装在200目铜网格上，用醋酸铀和柠檬酸铅染色，并使用AEI EM801(曼彻斯特，英国)或Philips CM10(埃因霍芬，荷兰)电子显微镜检查。显微摄影使用柯达电子显微镜胶片4489 (Anachem Ltd，卢顿，英国)。gydF4y2Ba

    试验协议gydF4y2Ba

    谷氨酰胺有效性对细菌易位的影响gydF4y2Ba

    研究谷氨酰胺的有效性和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)对大鼠肝细胞易位的影响gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaC25、Caco-2单分子膜被转移到含有2mm Gln (ConGln)或不添加Gln (GlnF)的DMEM中6小时。因此，GlnF培养基中只含有0.1 mM来自FCS的Gln。对于TNF-α的研究，在实验培养基(见下图)中培养单层细胞，加入TNF-α (20 ng/ml;Sigma-Aldrich, Poole, UK)到基底外侧腔。在六个小时的潜伏期结束时，细菌易位的测量如上所述。gydF4y2Ba

    为了评估Gln效应的可逆性和特异性，单分子膜首先与基底外侧TNF-α (20 ng/ml)在GlnF DMEM中培养6小时。随后在Transwell的根尖腔内更换Gln (2mm)。在一个单独的实验中，为了确定Gln介导效应的特异性，添加了2 mM的非Gln含氨基酸的异氮混合物(非必需氨基酸;Gibco, Paisley UK:丙氨酸0.89 mg/ml，天冬酰胺1.32 mg/ml，天冬氨酸1.30 mg/ml，谷氨酸1.47 mg/ml，甘氨酸0.75 mg/ml，脯氨酸1.15 mg/ml，丝氨酸1.05 mg/ml)。在每一种情况下，继续孵育两个小时后，去除实验培养基，在HBSS中洗涤单层膜，并测量如上所示的HBSS中的细菌易位。gydF4y2Ba

    谷氨酰胺对细菌易位影响的代谢途径gydF4y2Ba

    为了确定Gln对细菌易位影响的生化机制，在存在Gln代谢关键步骤的抑制剂的情况下，重复向根尖腔添加Gln。氨基乙酸酯(AOA)是一种转氨酶抑制剂，通过阻断Gln向α-酮戊二酸(AKG)的转化，阻止其在柠檬酸循环中的氧化代谢。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba丁硫氨酸磺酰亚胺(BSO)是一种谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂，可阻止谷氨酰胺转化为抗氧化的谷胱甘肽。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba二氟甲基氯鸟氨酸(DFMO)是一种鸟氨酸脱羧酶抑制剂，可阻止谷氨酰胺刺激的多胺合成。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba

    在这些研究中，单分子膜首先与基底外侧TNF-α (20 ng/ml)在GlnF DMEM中孵育6小时。随后，将分离的2 mM Gln，或与600 μM AOA、3.2 mM BSO (Sigma-Aldrich, Poole, UK)或5 mM DFMO (Calbiochem, Nottingham, UK)加入根尖室，持续孵卵2小时，然后测量细菌转位。gydF4y2Ba

    为了排除AOA的毒性作用，另一组单分子膜在GlnF DMEM中与基底外TNF-α (20 ng/ml)孵卵6小时。随后，将600 μM AOA与2 mM Gln或2 mM AKG (Sigma-Aldrich)一起添加到尖腔中，继续孵育2小时，然后用HBSS清洗单分子膜，并按上述方法测量细菌易位。gydF4y2Ba

    最后，评估了AOA、BSO和DFMO在缺乏TNF-α的情况下对细菌易位的影响。在用HBSS取代培养基并进行细菌易位研究之前，将每种试剂添加到ConGln DMEM中培养的单分子膜中6小时。gydF4y2Ba

    乳酸脱氢酶释放(LDH)gydF4y2Ba

    从Caco-2单分子层中释放乳酸脱氢酶作为细胞完整性的标志进行测量。将肠细胞单层暴露于上述处理，收集细胞外液并在15 000℃下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟。然后使用比色Boehringer Mannheim LDH细胞毒性检测试剂盒(Roche, Welwyn Garden City, UK)在thermoax微板读取器(Molecular Devices, wkingham, UK)中以490 nm的吸光度对上清液进行检测。用2% Triton X100 (Sigma-Aldrich, pool, UK)培养细胞，并测量所得细胞裂解液中的LDH，从而获得细胞内总LDH水平。乳酸脱氢酶释放量以对照单分子层Triton可溶性细胞内水平的百分比表示。gydF4y2Ba

    细胞ATP水平gydF4y2Ba

    为了确定Gln有效性变化和暴露于TNF-α对细胞ATP含量的影响，在HBSS中洗涤单层两次，然后用体细胞ATP释放缓冲液裂解(Sigma-Aldrich, pool, UK)。用ATP测定试剂盒(Molecular Probes, Cambridge, UK)测量细胞裂解液中的ATP水平，使用已知ATP浓度的标准曲线，在1450 Microbeta发光计(perkins - elmer, Cambridge, UK)中以560 nm发射。使用BCA蛋白测定法(Pierce公司，Rockford, USA)在570 nm下测定细胞蛋白含量，对照已知白蛋白浓度的标准曲线。ATP水平以pmol ATP/μg蛋白表达。gydF4y2Ba

    统计分析gydF4y2Ba

    除非另有说明，结果以平均值(SD)表示，每组中至少有6个单分子膜。对数据进行方差分析，并酌情采用Dunnett检验或Bonferroni检验。gydF4y2Ba22gydF4y2Bap值≤0.05为统计学显著性水平。所有分析均使用Graphpad Prism软件(Graphpad Prism Inc, San Diego, California, USA)进行。gydF4y2Ba

    结果gydF4y2Ba

    TNF-α和谷氨酰胺耗竭导致细菌易位协同增加gydF4y2Ba

    用ConGln DMEM培养单分子膜与低的易位率相关gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaC25到基房，相当于小于原根尖接种量的0.01%。急性在根尖腔中提取Gln 6小时(GlnF)不影响细菌易位率(图1)，也不影响单分子膜的完整性，如LDH释放量、LY通透性和TEER(表1)所示。gydF4y2Ba

    把这个表:gydF4y2Ba
    表1gydF4y2Ba

    培养培养基对单分子膜完整性和细胞ATP含量标记物的影响gydF4y2Ba

    图1gydF4y2Ba

    谷氨酰胺有效性和肿瘤坏死因子α (TNF-α)对肿瘤转位的影响gydF4y2Ba大肠杆菌这件gydF4y2Ba在Caco-2单层膜。ConGln，杜尔贝科改良Eagle培养基(DMEM)含有2mm谷氨酰胺;GlnF，无谷氨酰胺DMEM;TNF，与Transwell基底腔20 ng/ml TNF-α共孵育;GlnF+TNF+Gln，两个小时替代Gln或其他氨基酸的等氮混合物(AA)。结果是6个独立实验的平均值(SEM)。除GlnF+TNF+AA外，其余各组比较**p<0.01;与GlnF+TNF和GlnF+TNF+AA相比，††p<0.01。gydF4y2Ba

    基础外侧向ConGln单分子层中添加6小时TNF-α也没有影响细菌易位(图1)、LDH释放、LY通透性或TEER(表1)。基底侧向在GlnF培养基中培养的单分子膜中添加TNF-α，细菌易位率显著增加(100倍)，从3.38(0.25)增加到5.48 (0.43)log CFU/ml (p<0.01)(图1)。然而，这些变化与单分子膜完整性的改变无关(表1)。在GlnF DMEM中与TNF-α单分子膜孵育后发生的细菌易位增加被添加Gln两小时完全抑制。这种效应似乎是针对Gln的，因为添加其他氨基酸未能阻止细菌易位的增加(图1)。在这两种情况下，细菌易位的变化与单分子膜完整性的改变都没有关联(表1)。发生细菌易位的单分子膜的电子显微镜一致显示肠细胞内液泡中有细菌(图2)。gydF4y2Ba

    图2gydF4y2Ba

    Caco-2单分子膜的透射电子显微图。(A)微绒毛(1)和紧密连接复合体(2)。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(3)在单层顶端表面清晰可见，单层覆盖在聚碳酸酯膜(4)上。刻度如图所示。(B) Caco-2细胞显示gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(箭头)在细胞内液泡内。规模表示。gydF4y2Ba

    谷氨酰胺损耗对C-25易位影响的代谢途径gydF4y2Ba

    在没有添加TNF-α的情况下，单独将AOA、BSO或DFMO添加到ConGln的单分子膜中，不能诱导细菌易位增加(图3)。然而，在添加AOA(但不添加BSO或DFMO)后，在ConGln和TNF-α的单分子膜中孵卵会导致细菌易位显著增加，其程度与在GlnF DMEM中暴露TNF-α引起的细菌易位增加相似(图3)。gydF4y2Ba

    图3gydF4y2Ba

    谷氨酰胺代谢抑制剂对小肠转位的影响gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaC25在2 mM谷氨酰胺(ConGln)存在下通过Caco-2单分子膜，伴或不伴TNF-α 20 ng/ml (TNF)。AOA aminooxyacetate;BSO, buthionine sulphoximine;DFMO difluoromethylornithine。结果是四个独立实验的均值(SEM)。**p<0.01与其他组比较。gydF4y2Ba

    2 mM Gln恢复2小时抑制了在GlnF DMEM和基底外侧TNF-α单分子膜孵育后观察到的增加的易位(图4)。Gln逆转与Gln缺失和TNF-α暴露相关的增加的细菌易位的能力被与AOA共孵育所阻断，但与BSO或DFMO共孵育则没有(图4)。然而，尽管存在AOA，在这些条件下，细菌易位被添加AKG所抑制(图4)。gydF4y2Ba

    图4gydF4y2Ba

    谷氨酰胺代谢抑制剂对谷氨酰胺介导的Caco-2单分子膜细菌易位逆转的影响，在无谷氨酰胺的Dulbecco 's改性Eagle 's培养基(GlnF)中培养，基底侧为20 ng/ml TNF-α，添加:Gln, 2 mM谷氨酰胺;AOA aminooxyacetate;BSO, buthionine sulphoximine;DFMO difluoromethylornithine;爱科技,α酮戊二酸。结果为>4次独立实验的均值(SEM)。**p<0.01与GlnF+TNF+Gln、GlnF+TNF+Gln+BSO、GlnF+TNF+Gln+DFMO比较;p < 0.01组合与GlnF + TNF + Gln +农产品协定的。gydF4y2Ba

    细胞ATP水平gydF4y2Ba

    谷氨酰胺缺失或单独暴露于TNF-α对ATP水平没有影响(表1)。然而，在基底侧添加TNF-α后，GlnF条件下的ATP水平降低了近50%(104.3(17.8))。gydF4y2BavgydF4y2Ba197.3 (11.1) pmol/μg蛋白;p < 0.01)。在ConGln培养基中与AOA和TNF-α孵育，ATP水平也有相似程度的降低。在含有基底外TNF-α的GlnF培养基中添加Gln，可以使细胞ATP控制(ConGln)水平，当AKG添加到同时暴露于AOA和基底外TNF-α的ConGln培养基中培养的单分子膜中也可以观察到这一点。在ConGln培养基中培养并暴露于AOA和基底外侧TNF-α的单分子膜中加入Gln也显著增加ATP浓度(表1)。gydF4y2Ba

    讨论gydF4y2Ba

    尽管细菌易位的假设早在50多年前就已经提出，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba某些细菌通过明显完好的肠上皮细胞的机制和调节这一过程的因素在很大程度上仍不清楚。虽然在将这些体外研究的结果外推到临床环境时应该非常谨慎，因为在临床环境中，大量的混杂因素可能具有同等或更大的重要性，但使用目前的还原方法确实允许在严格控制的条件下详细探索细菌-肠菌素的相互作用。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba

    在基础条件下，非常小的比例(小于0.01%)的根尖细菌接种物转移到基底腔，这一数值与该实验系统之前的报道非常一致。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba从根尖培养基中去除Gln或在基底腔中单独与TNF-α孵育6小时均未显著影响细菌易位率、TEER或LY通量。这些结果与以前的研究结果一致，即Gln消耗至少48小时才能降低TEER或增加易位gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba在回肠循环。gydF4y2Ba25gydF4y2Ba尽管在本研究中使用的短时间的Gln消耗似乎对肠细胞单层屏障功能在基础条件下的功能影响不大，但它确实揭示了单层对TNF-α治疗的显著反应。尽管之前已经证明促炎细胞因子会改变肠细胞单分子层的屏障功能，gydF4y2Ba26日,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba据我们所知，还没有研究过谷氨酰胺可利用性的变化对炎症介质作用下肠细胞功能的影响。gydF4y2Ba

    本研究检测了TNF-α的作用，因为有证据表明该细胞因子在应激诱导的细菌易位过程中具有致病作用。实验性出血性休克可诱导两种细菌易位gydF4y2Ba28gydF4y2Ba以及肠内TNF-α的产生gydF4y2Ba29gydF4y2Ba这两个过程似乎在时间和解剖学上都有关联。gydF4y2Ba30.gydF4y2BaTNF-α也可由肠细胞细胞系内源性产生gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba11gydF4y2Ba和低氧的压力,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba使用与本研究中使用的剂量相似的TNF-α治疗人类HT-29/B6肠细胞系(尽管使用的时间更长)已被证明可以诱导细胞系中紧密连接的结构变化和屏障功能损伤。gydF4y2Ba12gydF4y2BaTNF-α已被证明能诱导活性氧的产生，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba这可能会损害肠细胞单分子层的屏障功能，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba通过对紧密连接的影响。gydF4y2Ba33gydF4y2Ba在本研究中，短期暴露于TNF-α或Gln耗竭均未诱导细菌易位，但Gln耗竭显著使Caco-2单分子膜对TNF-α的作用敏感。本研究选择2 mM的谷氨酰胺浓度，因为它代表Caco-2细胞系最佳生长和功能所需的正常生理谷氨酰胺浓度。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba由于先前的观察表明，Gln对上皮屏障完整性的影响呈极性，且以顶端作用为主，因此本研究仅检查了单分子膜顶端可用性变化的影响。gydF4y2Ba25gydF4y2Ba需要注意的是，选择本研究中使用的Gln浓度是因为它们反映了Caco-2细胞的正常生理条件。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba尽管从培养培养基中短期停用谷氨酰胺补充剂可能被认为是非生理的，但在本研究中未补充状态下使用的谷氨酰胺浓度(即0.1 mM)此前已被证明不会影响Caco-2细胞的正常生理功能。gydF4y2Ba34gydF4y2Ba

    谷氨酰胺缺失的影响不太可能与细胞损伤有关，因为这种影响被谷氨酰胺快速和特异性地抑制(但不被其他氨基酸抑制)，并且没有观察到乳酸脱氢酶释放增加。虽然Gln是肠细胞的主要燃料底物，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba它也可能是谷胱甘肽的代谢前体，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba35gydF4y2Ba刺激多胺的合成，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba两者都可能在维持上皮屏障的完整性方面发挥作用。gydF4y2Ba36gydF4y2Ba

    然而，本研究中的一些观察结果表明谷氨酰胺防止细菌易位的能力取决于它作为肠细胞燃料底物的使用。AOA(抑制氧化代谢的关键步骤Gln转化为AKG)阻断了Gln介导的TNF-α诱导的细菌易位逆转，而BSO(谷胱甘肽合成的抑制剂)和DFMO(多胺合成的抑制剂)则没有。由于AKG能够复制Gln的作用，即使存在AOA, AOA的毒性作用也不太可能发生。最后，TNF-α介导的细菌易位仅在目前的研究中发生，当谷氨酰胺的停用或AOA对谷氨酰胺代谢的阻断与细胞ATP水平的显著下降相关时。谷氨酰胺已被证明可以防止烧伤啮齿类动物肠上皮细胞能量势的下降，而不会同时增加谷胱甘肽的含量。gydF4y2Ba37gydF4y2Ba目前还不清楚为什么在目前的研究中细胞能量可用性的下降与细菌的易位有关，这些发现似乎在一定程度上与之前的研究相矛盾，在之前的研究中，氧化代谢的抑制剂未能影响的速率gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba在一个类似的实验系统中易位，尽管TEER降低。尽管克鲁兹和他的同事gydF4y2Ba19gydF4y2Ba这些发现表明细胞能量可用性可能不是决定细菌易位率的主要重要因素，细胞因子诱导的易位没有被研究，也没有测量ATP水平。在本研究中，仅通过AOA处理抑制氧化谷氨酰胺代谢也不能增加细菌易位，除非细胞受到额外的应激，这表明在该模型中可能需要多重刺激来诱导细菌易位。gydF4y2Ba

    谷氨酰胺耗竭已被证实可导致两种动物在肠外营养过程中肠道通透性增加gydF4y2Ba38gydF4y2Ba和人类一样,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba而将细胞系暴露于TNF-α可能会引起紧密连接的结构和功能的改变gydF4y2Ba12日,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba和肠上皮细胞凋亡。gydF4y2Ba41gydF4y2Ba虽然在本研究中没有检测到细胞凋亡，但它似乎不太可能是细菌易位增加的原因，因为在培养基中替换Gln后，易位发生了快速(不到2小时)和完全逆转。此外，细胞凋亡导致的肠细胞屏障紊乱可能会导致细胞旁通透性的增加gydF4y2Ba41gydF4y2Ba尽管细菌易位率增加了100倍，但在本研究中没有观察到。最后，在一个类似的实验模型中，Fas诱导的细胞凋亡被证明可以选择性地增加对小分子的通透性，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba而在本研究中则观察到相反的情况。gydF4y2Ba

    本研究的目的是检验谷氨酰胺调节细菌易位的机制，而不是确定易位发生的途径。然而，在本研究的所有实验中，细菌易位的增加与TEER或LY通量的变化之间缺乏显著的相关性，这表明细胞旁途径并不是细菌通过Caco-2单分子膜的主要途径。这一观察结果进一步支持了细菌易位可能涉及跨细胞，gydF4y2Ba19日,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba而不是paracellulargydF4y2Ba44gydF4y2Ba通过细菌。在肠细胞的液泡中而不是在细胞旁空间中发现易位细菌，进一步支持了这一建议。虽然这些观察结果似乎与威尔斯及其同事报告的不同，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba谁注意到各种侵入性病原体在Caco-2细胞中的跨细胞传递，尽管没有gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaC25，在本研究中，细菌仅在肠细胞内可见，在易位增加的情况下(例如，谷氨酰胺耗尽和TNF治疗后)也发生了。正如威尔斯和同事的研究gydF4y2Ba45gydF4y2Ba是在基础条件下进行的，而不是在肠细胞应激期间，似乎细菌-肠细胞相互作用的频率，对于一个具有低固有侵入性的有机体，如gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaC25，太低了，在那些情况下，肠道细胞中看不到细菌，与目前的研究相反gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaC25易位增加100倍。gydF4y2Ba

    在本研究中，增加的细菌易位只发生在观察到ATP消耗的情况下。目前尚不清楚细胞ATP的减少是如何与细菌易位相关的，尽管ATP的消耗不太可能是易位的结果，因为在测量ATP含量的研究中没有使用细菌。相反，我们的观察结果表明，ATP的消耗以某种方式促进了细菌的易位。抑制NagydF4y2Ba+gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba+gydF4y2Ba- atp酶先前已被证明损害侵入性病原体进入上皮细胞的内吞作用gydF4y2Ba46gydF4y2Ba虽然Gln的长期消耗会导致Na的减少gydF4y2Ba+gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba+gydF4y2Ba- atp酶活性，也增加了细菌的胞吞作用。gydF4y2Ba25gydF4y2Ba而Caco-2细胞已被证明具有吞噬活性gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba，它们似乎不具备杀菌活性gydF4y2Ba47gydF4y2Ba虽然菌株、细胞系和所采用的实验条件之间的差异可以解释这些变化的发现，但目前尚不清楚在本研究中观察到的ATP消耗和细菌易位增加之间的关系是否可以用ATP依赖性细胞内杀伤的减少来解释，特别是考虑到在AOA和TNF-α存在的情况下添加Gln会增加细胞ATP水平，但不会阻止易位的增加。此外，尽管细菌胞吞可能是一个能量依赖过程，但细胞能量含量和细菌通量之间的关系尚不清楚。此外，在目前的研究中，细菌的峰值通量到基础通量可能反映了细菌在两个方向上传输的净效应，目前尚不清楚这些途径是否同样需要能量。进一步的研究，以刻画易位的精确机制gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba应激上皮细胞中的C25及其与细胞能量含量的关系可能有助于解释和增强肠内谷氨酰胺补充的潜在临床益处。gydF4y2Ba

    致谢gydF4y2Ba

    这项工作得到了医学研究委员会、英国皇家外科医生学院、皮尔医学研究信托基金和消化障碍和营养研究基金会的支持。gydF4y2Ba

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      Amores-Sanchez MIgydF4y2Ba马,麦地那。谷氨酰胺，作为谷胱甘肽的前身，和氧化应激。gydF4y2Ba摩尔麝猫金属底座gydF4y2Ba1999gydF4y2Ba；gydF4y2Ba67gydF4y2Ba：gydF4y2BaOne hundred.gydF4y2Ba5。gydF4y2Ba
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      掀起EAgydF4y2Ba哈斯克尔Y，克鲁兹N，gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．Caco-2和IEC-18肠道细胞通过氧化剂依赖途径发挥杀菌活性。gydF4y2Ba冲击gydF4y2Ba1995gydF4y2Ba；gydF4y2Ba4gydF4y2Ba：gydF4y2Ba345gydF4y2Ba-50年。gydF4y2Ba
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