条文本gydF4y2Ba
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摘要gydF4y2Ba
背景:gydF4y2Ba过氧化物(OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba)通过还原烟酰胺二核苷酸(NADH)或还原烟酰胺二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的活性产生，已在多种细胞类型中被证实，但在人类结肠上皮细胞中没有。gydF4y2Ba
目的:gydF4y2Ba衡量啊gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2BaNAD(P)H氧化酶活性调节剂和O电位抑制剂的产生和作用gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba人结肠上皮细胞培养中产生酶的研究。NAD(P)H氧化酶催化亚基Nox1和gp91的表达gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba(phox，吞噬氧化酶)和膜结合亚基p22gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba被评估。gydF4y2Ba
方法:gydF4y2Ba转染后的结肠上皮细胞系(DLD-1、HT-29和Caco-2)在分流、分流和分化后进行研究。原代结肠上皮细胞从正常人结肠粘膜活检中分离出来。细胞外的啊gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba用细胞色素c还原法或鲁米诺增强发光法测定产量。Nox1, gp91gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba,第22位gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba用逆转录聚合酶链式反应检测结肠上皮细胞和血液中性粒细胞mRNA的表达。gydF4y2Ba
结果:gydF4y2BaO的产量gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba亚融合转化细胞(平均(SEM) 35.8 (4.2) nmol/mg蛋白质/h)和原代细胞(40.4(5.9))高于融合转化细胞(6.0 (0.9);p < 0.01)。氧化还原酶抑制剂二苯基碘对O有明显的抑制作用gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba而NADPH和NADH增加了生产速率。相比之下,阿gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba没有受到肉豆蔻酸酯的影响，gydF4y2BaNgydF4y2BaGgydF4y2Ba硝基-gydF4y2BalgydF4y2Ba-精氨酸甲酯，吲哚美辛或别嘌呤醇。Nox1 mRNA在所有结肠上皮细胞中均有表达，而gp91gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba仅在HT-29细胞和中性粒细胞中检测到。第22位gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba在所有细胞类型中均有表达。gydF4y2Ba
结论:gydF4y2Ba人结肠转化上皮细胞和原代上皮细胞的培养可产生细胞外OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba通过NAD(P)H氧化酶表达Nox1和p22gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba．gydF4y2Ba
- 上皮细胞gydF4y2Ba
- 结肠gydF4y2Ba
- 大肠gydF4y2Ba
- 氧化还原酶gydF4y2Ba
- 过氧化物gydF4y2Ba
- NAD (P) HgydF4y2Ba
- 考克斯环氧酶gydF4y2Ba
- DMEM，杜尔贝科改良的鹰培养基gydF4y2Ba
- DPI,二苯基碘鎓gydF4y2Ba
- lgydF4y2Ba- name,gydF4y2BaNgydF4y2BaGgydF4y2Ba硝基-gydF4y2BalgydF4y2Ba精氨酸甲酯gydF4y2Ba
- MTT，二甲基噻唑二苯基溴化四唑gydF4y2Ba
- NADH，还原烟酰胺二核苷酸gydF4y2Ba
- NADPH，还原烟酰胺二核苷酸磷酸gydF4y2Ba
- 不,一氧化氮gydF4y2Ba
- NOS，一氧化氮合酶gydF4y2Ba
- 氮氧化物,NAD (P) H氧化酶gydF4y2Ba
- phox,吞噬氧化酶gydF4y2Ba
- PMA，肉豆蔻酯gydF4y2Ba
- RT-PCR，逆转录聚合酶链反应gydF4y2Ba
- 草皮,超氧化物歧化酶gydF4y2Ba
来自Altmetric.com的统计gydF4y2Ba
- 考克斯环氧酶gydF4y2Ba
- DMEM，杜尔贝科改良的鹰培养基gydF4y2Ba
- DPI,二苯基碘鎓gydF4y2Ba
- lgydF4y2Ba- name,gydF4y2BaNgydF4y2BaGgydF4y2Ba硝基-gydF4y2BalgydF4y2Ba精氨酸甲酯gydF4y2Ba
- MTT，二甲基噻唑二苯基溴化四唑gydF4y2Ba
- NADH，还原烟酰胺二核苷酸gydF4y2Ba
- NADPH，还原烟酰胺二核苷酸磷酸gydF4y2Ba
- 不,一氧化氮gydF4y2Ba
- NOS，一氧化氮合酶gydF4y2Ba
- 氮氧化物,NAD (P) H氧化酶gydF4y2Ba
- phox,吞噬氧化酶gydF4y2Ba
- PMA，肉豆蔻酯gydF4y2Ba
- RT-PCR，逆转录聚合酶链反应gydF4y2Ba
- 草皮,超氧化物歧化酶gydF4y2Ba
超氧阴离子(OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba)是吞噬细胞中的一个关键抗菌过程，但尚未在人类结肠上皮细胞中得到证实。OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba如果溃疡性结肠炎患者的炎症上皮细胞中含有大量的一氧化氮(NO)，结肠上皮细胞本身可能有能力产生OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba．gydF4y2Ba1，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba
在吞噬细胞,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba是由膜结合酶复合物，还原烟酰胺二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶产生的，它由一个跨膜电子运输组件，细胞色素b558异二聚体，包括一个催化亚基gp91gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba(phox -吞噬氧化酶)和p22gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba．gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba在刺激下，胞质亚基的组合转移到膜上，随后氧化酶复合物将细胞外氧减少为OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba利用细胞内NADPH的一个电子。吞噬细胞NADPH氧化酶的刺激物包括肉豆蔻酸酯(PMA)，它通过激活蛋白激酶C迅速起作用。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba
OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba也由非吞噬细胞产生，如内皮细胞，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba血管平滑肌细胞，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和成纤维细胞,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba并被认为是参与增殖、凋亡和炎症的基因的调节因子。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba在非吞噬细胞中，NADPH和还原烟酰胺二核苷酸(NADH)可作为氧化酶的底物，该氧化酶在适当时被称为NAD(P)H氧化酶。已经描述了NAD(P)H氧化酶的几种替代催化亚基，Nox1-5，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba其中一些似乎是组织特异性的。因此，Nox1在结肠中大量表达，但在血管平滑肌细胞中表达较少。gydF4y2Ba9日,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba在结肠粘膜活检和结肠上皮细胞系Caco-2中检测到Nox1 mRNA，但在白细胞中不存在。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba
其他O的来源gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba如NO合成酶(NOS)、黄嘌呤氧化酶、环氧合酶(COX)和线粒体电子传递链酶等，它们在OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba．gydF4y2Ba11gydF4y2Ba
OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba在人类结肠中还没有观察到这种物质的产生，但从大鼠结肠的隐窝上皮培养产生OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba在基础条件下。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba此外，培养的豚鼠胃坑细胞产生OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba不受PMA影响，这表明OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba比gp91gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba．gydF4y2Ba11gydF4y2Ba
在本研究中，我们测量了OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2BaNAD(P)H氧化酶亚基Nox1, gp91的产生和表达gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba,第22位gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba在转化结肠上皮细胞系和来自正常人类结肠的原代上皮细胞的培养中。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
试剂、培养基和PCR引物gydF4y2Ba
试剂采购自Sigma化学公司(美国密苏里州圣路易斯)，除非另有说明，所有培养基均来自Gibco公司(美国马里兰州盖瑟斯堡)。OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba测量在Krebs-Ringer缓冲液(mM) (NaCl 130, KCl 5, CaCl)中进行gydF4y2Ba2gydF4y2Ba0.9, MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba1.2，磷酸二氢钠-二水合15，葡萄糖5)，pH 7.4，除PMA外，所有试剂都溶解在其中，PMA溶解在二甲基亚砜中。聚合酶链式反应(PCR)使用以下引物对(Amersham Bioscience, Little Chalfont, UK): Nox1，上游:5 ' -CCAGGATTGAAGTGGATGGT-3 ';下游:5 ' -CGGTGAGGAAGAGACGGTAG-3 ' (PCR产物297 bp);gp91gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba上游:5“-GAATGGGGAAAAATAAAGGAATG-3”;下游:5 ' -ACCCCTTCTTCTTCATCTGTAGC-3 '(产品202 bp);和第22位gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba上游:5“-CGCTTCACCCAGTGGTACTT-3”;下游:5 ' -GAGAGCAGGAGATGCAGGAC-3 '(产品200 bp)。gydF4y2Ba
用鲎试剂与火箭免疫电泳相结合的方法检测到所有缓冲液和培养基的脂多糖浓度均低于5 pg/ml。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba
DLD-1, HT-29和Caco-2结肠上皮细胞系gydF4y2Ba
未分化的人结肠癌细胞系DLD-1和HT-29(美国类型培养集(ATCC)，马纳萨斯，弗吉尼亚州)在McCoy’s 5a培养基中与10% (v/v)的胎牛血清在5% CO中培养gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在37°C。Caco-2细胞(ATTC)在添加酚红、5.5 mM葡萄糖和谷氨酰胺的Dulbecco 's modified Eagle 's培养基(DMEM)中培养，并添加10% (v/v)的胎牛血清。在研究之前，10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba或10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞被植入24孔板(TTP, Trasadinger，瑞士)，培养24小时，分别获得亚汇合(所有细胞系约15%汇合)和汇合细胞(>95%汇合)。然而,阿gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba细胞在2.5 ml的DMEM中培养24小时(培养基不变)，并加入上述含有5.5或25 mM葡萄糖的添加剂。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba因此，将细胞株培养在2.5 ml含有上述添加剂的含葡萄糖5.5 mM的DMEM中，每8小时更换一次。为了提高培养量，细胞被接种在Pico玻璃瓶(Packard, Groningen, Netherlands)中，在8 ml含有上述添加剂的含5.5 mM葡萄糖的DMEM中培养24小时，每8小时更换一次。为了评估丁酸盐的作用，细胞系在2.5 ml DMEM中培养24小时，DMEM中添加了上述添加剂，其中含有5.5 mM葡萄糖和5 mM丁酸盐，培养基改变或不改变。gydF4y2Ba
对于分化的单分子细胞，Caco-2细胞持续培养14天，期间每隔2天更换含有葡萄糖的上述添加剂的DMEM 5.5 mM。在研究前的24小时内，媒介每8小时更换一次。gydF4y2Ba
细胞代谢通过测量葡萄糖，gydF4y2BalgydF4y2Ba通过自分析仪(ABL-625, Radiometer，哥本哈根，丹麦)和线粒体酶功能通过二甲基噻唑二苯基溴化四唑(MTT)测定进行评估。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba
来自无炎症肠的受试者的初级结肠上皮细胞gydF4y2Ba
参与者gydF4y2Ba
该研究获得了地区伦理委员会的许可，所有参与者都给予了知情的书面同意。gydF4y2Ba
在医院的工作人员中招募了健康的不吸烟的受试者，他们至少一个月没有服用药物。如果结肠镜检查正常且组织病理学检查时黏膜无炎症，则纳入因肠易激综合征或便血而接受内镜检查以排除结直肠癌的患者。gydF4y2Ba
内窥镜检查gydF4y2Ba
在健康受试者中，在没有事先肠道准备的情况下进行乙状结肠镜检查，并从乙状结肠中取出8个活检标本，置于10ml冰冷的Krebs-Ringer缓冲液中立即分离上皮细胞。对患者，在前一天晚上用口服聚乙二醇(丹麦Bispebjerg医院药房)3000溶液(96克溶于1.5升自来水中)进行肠道准备后，进行常规结肠镜检查。8个活检标本从横结肠如上所述。额外的活检样本用于组织病理学评估，如果异常，则排除受试者。gydF4y2Ba
结肠原代上皮细胞的分离与培养gydF4y2Ba
隔离程序以前已经评估过。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba简单地说，活检标本在1mm的EDTA/EGTA中孵育10分钟，然后机械分离，粗滤，洗涤。在研究之前，细胞悬浮在pH值为7.4的Krebs-Ringer缓冲液中，转移到Eppendorf管中，在37°C下孵育1小时。gydF4y2Ba
从外周血中分离中性粒细胞gydF4y2Ba
从健康受试者的外周血中分离中性粒细胞，提取mRNA。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba简而言之，血液在含有EDTA的小瓶中取样，并进行顺序的葡聚糖沉淀(淋巴普rep;Nycomed，奥斯陆，挪威)和梯度离心。用低渗生理盐水溶解污染红细胞，加入高渗生理盐水恢复正常渗透压，2000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置10分钟。gydF4y2Ba
过氧化物检测gydF4y2Ba
超氧化物歧化酶抑制细胞色素c还原试验gydF4y2Ba
细胞外的啊gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba用1 mg/ml取自马心脏的细胞色素c在Krebs-Ringer缓冲液中孵育细胞，pH值为7.4，加入或不加入来自牛红细胞的超氧化物歧化酶(SOD) 200 U/ml，在37°c孵育1小时，测定细胞增殖。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba从孔中除去培养基(转化细胞)或在5000℃下离心即可停止反应gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下5分钟(原代细胞)，上清的吸光度在550 nm下对蒸馏水在分光光度计上读取(Shimadzu UV A160，日本京都)。将加入或不加入SOD孵育的相似细胞上清液的吸光度差异转化为等效O值gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba使用细胞色素c (21×10)的摩尔消光系数生产gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba/ mol /厘米)。检测限，用O的平均产量表示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba从热灭活的HT-29细胞+2 SD (n=10)中提取，为0.25 nmol/mg蛋白质/h，每天的检测间变异，用从10开始的基础值的变异系数表示gydF4y2Ba5gydF4y2BaHT-29细胞(n=10)，为15%。在药理研究中，将转化的或原代结肠上皮细胞与上述细胞色素c孵育，添加或不添加NAD(P)H氧化酶活性的潜在调节剂:二苯碘(DPI) 10 μM, NADPH或NADH 10 μM、100 μM或1 mM，或PMA 0.05、0.5或5 μg/ml。在其他实验中，转化细胞与其他OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba生成酶:gydF4y2BaNgydF4y2BaGgydF4y2Ba硝基-gydF4y2BalgydF4y2Ba-精氨酸甲酯(gydF4y2BalgydF4y2Ba10 μM、100 μM或1 mM的吲哚美辛或别嘌醇。在不改变培养基或添加丁酸盐的情况下，热灭活或培养24小时的HT-29细胞作为阴性对照。gydF4y2Ba
鲁米诺增强发光试验gydF4y2Ba
研究细胞外氧的动力学gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba制备，悬浮上皮细胞与鲁米诺500 μM在Krebs-Ringer缓冲液中孵育，pH 7.4, 37℃，在固定时间点使用发光计(FB12;Berthold检测系统，普福尔茨海姆，德国)。在60分钟时，加入NADPH 1 mM，并测量另一个小时的发光。每次实验中，用SOD 200 U/ml处理可比细胞的实验值减去细胞外O引起的发光gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba．根据背景(含鲁米诺的Krebs-Ringer缓冲液)对值进行校正，并给出每10秒每毫克蛋白质的相对光单位。日与日的化验间变异，用从10开始的基础值的变异系数表示gydF4y2Ba5gydF4y2BaHT-29细胞(n=10)，为21%。gydF4y2Ba
表达分析gydF4y2Ba
rt - pcr分析gydF4y2Ba
使用TRIzol (Gibco)从新鲜分离的上皮细胞或血液中性粒细胞中提取总RNA，使用First-Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Bioscience)生成cDNA。PCR使用AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, California, USA)， 94°C变性35秒，58°C退火35秒，72°C延伸30秒，均在Mastercycler Gradient (Eppendorf, Germany Hamburg)中进行。每种产品的循环次数在图4的图例中给出。扩增后，PCR产物分离在含有1 μg/μl溴化乙胺的2%琼脂糖凝胶上，用紫外光进行观察(Image Master, Amersham Bioscience)。gydF4y2Ba
为了控制引物特异性，限制性内切酶分析使用pDraw32软件(共享软件，gydF4y2Bahttp://home.get2net.dk/acaclonegydF4y2Ba)．PCR产物为Nox1, gp91gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba,第22位gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba分别与相关酶(Apo-1、su -96-1、Mnl-1)孵育;New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, USA)按照制造商的指示，放置一个小时，装入3%琼脂糖凝胶，并如上分析。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
结果用均值(SEM)表示。用Komolgorov-Smirnov统计量和Levine统计量检验模型的正态性假设是否相等。数据分析由gydF4y2BatgydF4y2Ba在适当的地方测试成对或未成对的变量。gydF4y2Ba18gydF4y2Bap<0.05(双尾)被认为显著。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
结肠上皮细胞系的代谢gydF4y2Ba
葡萄糖和乳酸的浓度以及培养基的pH值取决于细胞浓度、培养基中葡萄糖的初始浓度、丁酸的添加量以及培养过程中更换培养基的频率(表1)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba如果葡萄糖的初始浓度提高到25 mM，则24小时后观察到pH值或乳酸值没有变化，而葡萄糖浓度仍然很高(见表1)。在含有5.5 mM葡萄糖的培养基中，添加丁酸盐不影响葡萄糖、乳酸和pH值。在10不变的培养基中gydF4y2Ba6gydF4y2Ba乳酸酸中毒发生时，细胞葡萄糖浓度降低。相反，如果每8小时更换一次培养基，则葡萄糖、乳酸和pH值基本不受影响。添加丁酸盐至10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞和未改变的培养基减少了葡萄糖和乳酸酸中毒的下降。改变培养基和补充丁酸盐的组合导致葡萄糖升高，乳酸酸中毒加重(见表1)。gydF4y2Ba
葡萄糖和乳酸的浓度(平均(SEM))和pH值在10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba或10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba培养24小时后转化的结肠上皮细胞gydF4y2Ba
细胞色素c 1 mg/ml孵育1小时(基础值的1%，均值(SEM)，所有实验n=3: 103% (4))， DPI 10 μM (96% (3))， NADPH 10 μM, 100 μM, 1 mM(97%(4)， 107%(3)， 98%(6))或NADH (96% (2)， 95% (2)， 103% (7))， PMA 0.05 μg/ml, 0.5 μg/ml, 5 μg/ml (112% (5)， 102% (4)， 107% (4))， MTT值不受影响gydF4y2BalgydF4y2Ba-NAME 10 μM、100 μM和1mm(105%(3)、103%(1)和100%(3))、吲哚美辛(112%(5)、102%(2)和106%(5))或别嘌醇(104%(5)、103%(4)和115%(5))。gydF4y2Ba
转化和原代结肠上皮细胞的超氧化物产生gydF4y2Ba
转化的结肠上皮细胞gydF4y2Ba
在热灭活细胞和培养24小时不改变培养基或补充丁酸盐的细胞中，OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba无论采用何种检测或刺激方法(NADPH、NADH或PMA)均无法检测到。gydF4y2Ba
如果每8小时更换一次培养基或添加丁酸盐，转化的细胞系产生细胞外OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba在基础条件下。O的速率gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba亚融合细胞的产量是未分化或分化融合细胞的6倍(p<0.001;但不受融合Caco-2细胞分化的影响(见图1A)。产率也不受亚汇流等级(5%，15%，和50%汇流，数据未显示)或大容量培养(8毫升)的影响gydF4y2BavgydF4y2Ba2.5 ml)培养基(数据未显示)。gydF4y2Ba
过氧化物(OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba)在正常人结肠转化结肠上皮细胞和原代结肠上皮细胞的培养中产生。细胞外的啊gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba用抑制超氧化物歧化酶的细胞色素c还原法测定产量，并以每毫克蛋白质每小时的纳摩尔(见方法)表示。(一)OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba形成DLD-1, HT-29和Caco-2结肠上皮细胞。未分化细胞在亚汇流或汇流条件下进行研究。为了进行分化，Caco-2细胞培养14天。五次实验的平均(SEM)值:*p<0.05与融合细胞(配对)比较gydF4y2BatgydF4y2Ba测试)。(B) OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba来自无炎症肠的受试者的原代结肠上皮细胞的生产。给出了5名健康受试者和16名肠道无炎症患者的平均值(SEM)。gydF4y2Ba
初级结肠上皮细胞gydF4y2Ba
用细胞色素c还原法对5例健康受试者和16例无炎症结肠黏膜患者的原代结肠上皮细胞培养进行了研究。此外，对三名肠道未发炎患者和三名健康受试者的细胞进行了发光分析。gydF4y2Ba
细胞外的啊gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba在基础条件下产生，通过细胞色素c还原试验或发光检测(图1B，图2)。健康受试者和无炎症肠道患者的细胞产生率在统计学上无显著差异(图1B)。利用发光技术，OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba观察(图2)。gydF4y2Ba
正常人结肠原代结肠上皮细胞培养产生超氧化物的动力学及细胞外还原烟酰胺二核苷酸磷酸(NADPH)的影响。OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba在固定的时间点，用抑制超氧化物歧化酶(SOD)的鲁米诺增强发光法测量产量，并以每毫克蛋白质每10秒的相对光单位表示(见方法)。60分钟后，NADPH 1 mM加入培养基中。给出了来自6个受试者，3个肠道无炎症患者和3个健康对照组的细胞的平均(SEM)值。*p=0.02相比60分钟的值(配对gydF4y2BatgydF4y2Ba测试)。gydF4y2Ba
药理干预gydF4y2Ba
在转化细胞系中，观察到类似的干预反应，在未融合细胞和融合细胞中观察到的反应之间只有微小的差异。在亚融合细胞中，氧化还原酶抑制剂DPI降低了OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba产生50% (p=0.02)，而NADPH和NADH导致产生率的剂量依赖性增加(见图3A)。相比之下,阿gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2BaPMA对蛋白激酶C的激活和NOS的抑制均不影响生成gydF4y2BalgydF4y2Ba-NAME, COX，与吲哚美辛或黄嘌呤氧化酶与别嘌呤醇(图3A, C)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba而NADPH和NADH剂量依赖性地提高了细胞的增殖率，在浓度为1 mM时，增殖率提高了5倍(p<0.01)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba代不受PMA影响，gydF4y2BalgydF4y2Ba-NAME、吲哚美辛或别嘌醇(数据未显示)。gydF4y2Ba
药理干预对OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba在转化的或原代结肠上皮细胞的培养中表达为基础生产率的百分比(见图1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba用抑制超氧化物歧化酶的细胞色素c还原法测定产量，并以每毫克蛋白质每小时的纳摩尔(见方法)表示。在转化细胞系中，观察到对干预的类似反应，但只在(A)和(C)中给出了未融合Caco-2细胞的实验值。(A) Caco-2细胞中NAD(P)H氧化酶潜在调节剂的作用。(B) NAD(P)H氧化酶潜在调节剂在原代结肠上皮细胞中的作用。(C)其他潜在OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba在Caco-2细胞中产生酶给出了五次实验的平均(SEM)值。*p与基础值比较<0.05(配对gydF4y2BatgydF4y2Ba测试)。DPI,二苯基碘鎓;gydF4y2BalgydF4y2Ba- name,gydF4y2BaNgydF4y2BaGgydF4y2Ba硝基-gydF4y2BalgydF4y2Ba精氨酸甲酯;NADH，还原烟酰胺二核苷酸;NADPH，还原烟酰胺二核苷酸磷酸;PMA，肉豆蔻酯。gydF4y2Ba
在原代结肠上皮细胞中，DPI减少了OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba50% (p = 0.02;图3 b)。NADPH的加入使O增加3倍gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba细胞色素c还原法检测产量(p=0.02;图3B)或发光(p=0.01;看到60gydF4y2BavgydF4y2Ba65分钟，图2)，这是在几秒钟内观察到的(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba不受PMA影响(图3B)。gydF4y2Ba
表达分析gydF4y2Ba
Nox1和第22位gydF4y2BaphoxgydF4y2BamRNA在转化细胞系和原代结肠上皮细胞的所有培养物中均检出，而gp91gydF4y2BaphoxgydF4y2BamRNA仅在HT-29细胞中被检测到(图4)。相比之下，在表达gp91 mRNA的分离外周中性粒细胞中未检测到Nox1 mRNAgydF4y2BaphoxgydF4y2Ba和第22位gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba(图4). PCR产物与适当的限制性内切酶孵育后，两个较小的预测大小片段证实了引物特异性(数据未显示)。gydF4y2Ba
Nox1, gp91的表达gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba,第22位gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba来自健康受试者的转化结肠上皮细胞系、初级结肠上皮细胞和外周中性粒细胞中的mRNA。提取的RNA用30 (Nox1和p22)进行逆转录聚合酶链反应gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba)或37 (gp91gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba)扩增周期(见方法)。产物在2%琼脂糖凝胶上分离，用溴化乙锭观察。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
本研究结果表明，转化结肠上皮细胞和来自正常人类结肠的原代结肠上皮细胞培养产生细胞外OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba，可通过氧化还原酶抑制剂减弱。Nox1和p22的表达gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba表明这些亚基构成了氧化酶的一部分，利用NADPH/NADH生成OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba．二核苷酸不能自由穿透细胞膜，因此OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba产生表明氧化酶定位于细胞膜外层。另一方面，NOS、COX或黄嘌呤氧化酶不太可能促进OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba从结肠上皮细胞作为合成速率不受这些酶的抑制剂。gydF4y2Ba
非上皮细胞不太可能对OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba在原代上皮细胞培养中观察到，据报道所使用的培养物纯度为>95%。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba此外，OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba在原代和转化上皮细胞培养中观察到NAD(P)H氧化酶亚基的形成和表达。最后，如果吞噬细胞存在，PMA可能会刺激OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba生产。gydF4y2Ba
我们的结果表明，Nox1是结肠上皮细胞中NAD(P)H氧化酶的催化亚基，而不是吞噬细胞，它催化OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba由gp91gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba．我们发现gp91gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba在HT-29细胞中，OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba不受PMA影响，提示gp91gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba．gydF4y2Ba
目前，Nox1活性的调控途径尚不清楚，但我们的结果表明OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba这与PMA激活的蛋白激酶C无关。在血管平滑肌细胞的研究中也有类似的观察结果，显示Nox1的表达和对OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2BaPMA的生产。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba
代谢功能障碍可损害OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba通过观察到转化细胞释放OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba只有含有葡萄糖生理浓度的培养基每8小时更换一次或添加丁酸盐。在10种文化中gydF4y2Ba6gydF4y2Ba如果每天更换一次培养基，可观察到细胞、葡萄糖和乳酸酸中毒的异常浓度。丁酸盐部分逆转了这些变化，丁酸盐也恢复了OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba．在10种文化中gydF4y2Ba5gydF4y2Ba当细胞在含有生理葡萄糖浓度的培养基中培养，但产生OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直到用丁酸盐还原才被检测出来。总之，这些观察结果表明，代谢功能障碍的后果，除了丁酸饥饿和葡萄糖和乳酸浓度异常，可能有助于O的衰减gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba形成。gydF4y2Ba
O的参与gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba观察到结肠上皮细胞的高OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba亚融合细胞的生产，其特点是有丝分裂率高。对大鼠结肠隐窝上皮的观察支持了这一观点gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba生产有助于胆汁酸诱导细胞增殖。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba此外，转染Nox1的成纤维细胞生长速度加快，而转染Nox1反义mRNA的成纤维细胞生长速度减慢。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba显然，需要进一步的研究来确定O的作用gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba和Nox1在结肠上皮细胞增殖中的作用。gydF4y2Ba
在肠道中，OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba上皮细胞可能有助于屏障功能。观察到结肠炎/肠炎常发生在具有NAD(P)H氧化酶亚基基因缺陷的慢性肉芽肿性疾病患者中，这一观点得到了加强。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba此外，SOD可逆转Caco-2细胞的抑菌活性，过氧化氢酶和过氧化氢酶均不能逆转Caco-2细胞的抑菌活性gydF4y2BalgydF4y2Ba- name,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba表明阿gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba来自结肠的上皮细胞可能参与宿主防御。gydF4y2Ba
OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba生产也可能有助于氧化应激，可能是溃疡性结肠炎的情况。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba相反，结肠上皮细胞中表达的抗氧化系统，如SOD、过氧化氢酶和谷胱甘肽，在严重炎症期间可能会被耗尽。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba如果上皮细胞OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba对细胞膜和细胞器的损害可直接或通过过氧化氢或羟基自由基发生。此外，OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2BaNO可能导致形成活性氮物种，如过氧亚硝酸盐，提示在溃疡性结肠炎患者的炎症上皮中存在硝基酪氨酸。gydF4y2Ba1，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba
总之，转化的结肠上皮细胞系和来自正常人结肠的原代上皮细胞的培养物释放细胞外OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba通过NAD(P)H氧化酶表达NAD(P)H氧化酶亚基Nox1和p22gydF4y2BaphoxgydF4y2Ba．因此,阿gydF4y2Ba2gydF4y2Ba−gydF4y2Ba生产可能有助于维持正常的结肠屏障。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
我们感谢丹麦哥本哈根Herlev医院临床微生物科的Leif Baek博士对LPS的分析。该研究也得到了诺和诺德基金会的资助。这项研究的一部分在2000年消化疾病周上发表，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国。gydF4y2Ba