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菜单条gydF4y2Ba
胰腺疾病gydF4y2Ba
大鼠胰腺星状细胞分泌基质金属蛋白酶:细胞外基质周转的意义gydF4y2Ba
免费的gydF4y2Ba
  1. 便士菲利普斯gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  2. J一McCarrollgydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  3. 世纪公园gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  4. m j吴gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  5. R PirolagydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  6. M KorstengydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  7. J S威尔逊gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  8. mv的利润率gydF4y2Ba1gydF4y2Ba
  1. 1gydF4y2Ba胰腺研究小组，消化内科，Bankstown-Lidcombe和利物浦医院，新南威尔士大学，悉尼，澳大利亚gydF4y2Ba
  2. 2gydF4y2Ba胰腺研究组，新南威尔士大学，悉尼，澳大利亚gydF4y2Ba
  3. 3.gydF4y2Ba美国纽约西奈山医学院胰腺研究小组gydF4y2Ba
  1. 通信:gydF4y2Ba
    M Apte博士，胰腺研究小组，澳大利亚新南威尔士州2170利物浦坎贝尔街利物浦医院卫生服务大楼4层463室;gydF4y2Bam.apte在{}unsw.edu.augydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

背景:gydF4y2Ba胰腺纤维化是慢性胰腺损伤的一个特征，被认为是由于细胞外基质(ECM)蛋白合成和降解之间的平衡发生了变化。最近的研究表明，激活的胰腺星状细胞(PSCs)通过增加ECM蛋白的合成在胰腺纤维形成中发挥核心作用。然而，这些细胞在ECM蛋白降解中的作用尚未完全阐明。gydF4y2Ba

目的:gydF4y2Ba为了确定:(i) PSCs是否分泌基质金属蛋白酶(MMP)和金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)，如果是(ii) PSCs分泌的MMP和TIMP是否在已知的PSC激活因子如肿瘤坏死因子α (TNF-α)、转化生长因子β1 (TGF-β1)、白介素6 (IL-6)、乙醇和乙醛的作用下发生改变。gydF4y2Ba

方法:gydF4y2Ba培养的大鼠PSCs (n= 3-5个独立细胞制剂)在37°C下与含TNF-α (5-25 U/ml)、TGF-β1 (0.5-1 ng/ml)、IL-6 (0.001-10 ng/ml)、乙醇(10-50 mM)或乙醛(150-200 μM)或不添加(对照)的无血清培养基孵育24小时。用10%聚丙烯酰胺-0.1%明胶凝胶酶谱法检测对照细胞培养基中mmp的存在。采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测MMP9和金属蛋白酶组织抑制剂TIMP1和TIMP2的基因表达。Western blotting用于识别一个特定的MMP, MMP2(一种消化基底膜胶原蛋白和酶谱图上观察到的显性MMP的明胶酶)和一个特定的TIMP, TIMP2。采用反酶谱法检测PSC分泌物中功能性TIMPs。通过western blot密度法评估TNF-α、TGF-β1和IL-6对MMP2分泌的影响。乙醇和乙醛对MMP2和TIMP2分泌的影响也通过这种方法进行了评估。gydF4y2Ba

结果:gydF4y2Ba酶谱图显示，PSCs分泌大量的mmp，包括分子量与MMP2、MMP9和MMP13一致的蛋白酶。RT-PCR显示PSCs中存在金属蛋白酶抑制剂TIMP1和TIMP2的mRNA，而反酶谱显示PSCs分泌物中存在功能性TIMP2。TGF-β1和IL-6显著增加PSCs的MMP2分泌，而TNF-α不影响MMP2分泌。乙醇和乙醛诱导PSCs分泌MMP2和TIMP2。gydF4y2Ba

结论:gydF4y2Ba胰腺星状细胞具有合成多种基质金属蛋白酶的能力，包括MMP2、MMP9和MMP13及其抑制剂TIMP1和TIMP2。在促炎细胞因子TGF-β1和IL-6的作用下，PSCs分泌的MMP2显著增加。乙醇及其代谢物乙醛都能增加PSCs对MMP2和TIMP2的分泌。gydF4y2Ba

含义:gydF4y2Ba胰腺星状细胞在细胞外基质形成和纤维形成中的作用可能与其调节细胞外基质蛋白降解和合成的能力有关。gydF4y2Ba

  • 方差分析，方差分析gydF4y2Ba
  • 发射极耦合逻辑,增强化学发光gydF4y2Ba
  • ECM,细胞外基质gydF4y2Ba
  • 胎牛血清gydF4y2Ba
  • 甘油醛磷酸脱氢酶gydF4y2Ba
  • 合,辣根过氧化物酶gydF4y2Ba
  • 肝星状细胞gydF4y2Ba
  • ,白介素gydF4y2Ba
  • IMDM, Iscove改良的Dulbecco培养基gydF4y2Ba
  • PSC，胰腺星状细胞gydF4y2Ba
  • MMP的基质金属蛋白酶gydF4y2Ba
  • MT-MMP:膜型基质金属蛋白酶gydF4y2Ba
  • RT-PCR，逆转录聚合酶链反应gydF4y2Ba
  • 十二烷基硫酸钠gydF4y2Ba
  • TBS，特里斯缓冲盐水gydF4y2Ba
  • TGF-β转化生长因子βgydF4y2Ba
  • 金属蛋白酶组织抑制剂TIMPgydF4y2Ba
  • TNF-α，肿瘤坏死因子αgydF4y2Ba
  • TTBS, Tris缓冲盐水和Tween 20gydF4y2Ba

http://dx.doi.org/10.1136/gut.52.2.275gydF4y2Ba

来自Altmetric.com的统计gydF4y2Ba

    请求的权限gydF4y2Ba

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    胰腺纤维化是酒精性慢性胰腺炎的一个重要病理特征。近年来越来越多的研究表明，胰腺星状细胞(PSCs)在胰腺纤维形成中起着重要作用。gydF4y2Ba1 -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba对慢性胰腺炎患者胰腺切片和实验性胰腺纤维化动物模型的研究表明，激活的PSCs是纤维化胰腺中胶原蛋白的主要来源。gydF4y2Ba5 -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba处于静止状态的PSCs可以通过细胞质中含有维生素A的脂滴的存在和星状细胞选择性标记物(如粘蛋白和胶质纤维酸性蛋白)的阳性染色进行识别。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba当被细胞因子、生长因子、氧化应激、酒精(乙醇)或其代谢物乙醛等因子激活时，它们转化为肌成纤维细胞样细胞，并合成更多的细胞外基质(ECM)蛋白质，其中包括纤维组织，特别是纤维胶原和纤维连接蛋白。gydF4y2Ba1 -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba

    ECM在维持正常组织结构中起着核心作用。现在很明显，ECM的周转(合成、分泌和降解)是伴随生理和病理过程的组织重塑的一个关键特征。gydF4y2Ba10gydF4y2BaECM蛋白合成和降解平衡的改变会导致ECM沉积的病理性增加，导致纤维化的发展。gydF4y2Ba

    虽然关于PSCs调节ECM蛋白合成的能力的证据越来越多，但这些细胞调节ECM降解的能力却知之甚少。参与ECM蛋白降解的关键酶是基质金属蛋白酶(MMPs)。这是一个至少25种锌依赖酶的家族，作为不活跃的(潜在的)酶原分泌。gydF4y2Ba11日,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba根据基质特异性和结构特征，基质金属蛋白酶可分为五大类:明胶酶(MMP2、MMP9)、基质溶素(MMP3、MMP10、MMP11)、弹性酶(MMP12、MMP7)、胶原酶(MMP1、MMP8、MMP13、MMP18)和膜型基质金属蛋白酶(MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP、MT4-MMP)。mmp的前肽形式包含一个具有自由半胱氨酸残基的调控基序，通过与催化区域的锌结合来维持延迟。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba活化是由调控基序与催化结构域的分离引起的。在体内，纤溶酶原-纤溶酶级联是影响前金属蛋白酶激活的主要系统。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba其他激活机制包括肥大细胞胰蛋白酶、组织蛋白酶、弹性蛋白酶、激肽酶和活性氧中间体。gydF4y2Ba15日,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba据报道，MMP2也可被膜型基质金属蛋白酶1 (MT1-MMP)激活。gydF4y2Ba17gydF4y2BaMMP2和MMP9都能降解基膜胶原蛋白(IV型)，并与伤口愈合、发展、炎症、纤维化、血管生成和肿瘤侵袭中的ECM重塑有关。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba正常基底膜胶原(胶原型IV)的降解被认为是促进病理性纤维形成胶原的沉积。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba

    金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)可以抑制基质金属蛋白酶的活性。迄今为止，已经确定了TIMPs的四种子类型(TIMP1-TIMP4)。gydF4y2Ba20 -gydF4y2Ba23gydF4y2BaTIMP1可以抑制几种MMP1、3、8、9、10、11、13和18的活性，而TIMP2在抑制MMP2方面尤为重要。gydF4y2Ba

    本研究的目的是检查PSCs是否是mmpp和TIMPs的来源，如果是，确定已知的PSC激活因子对这些细胞分泌MMP2和TIMP2的影响。gydF4y2Ba

    方法gydF4y2Ba

    胰腺星状细胞的分离gydF4y2Ba

    大鼠胰腺星状细胞分离如前所述。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba简单地说，在Gey的平衡盐溶液中，用胶原酶P(0.05%)、pronase(0.02%)和DNase(0.1%)的混合物消化胰腺。形成的细胞悬浮液在1400时以13.2%的Nycodenz梯度离心gydF4y2BaggydF4y2Ba20分钟。星形细胞在Nycodenz溶液和水溶液缓冲液的界面上方分离成一个模糊的带。该条带被收集，细胞被洗涤和重悬在Iscove的改良Dulbecco 's培养基(IMDM)中，其中含有10%胎牛血清(FBS)， 4 mM谷氨酰胺和抗生素(青霉素100 U/ml，链霉素100 mg/ml)。上述技术可制备出不受内皮细胞或巨噬细胞污染的星形细胞，标记因子VIII和ED1的阴性染色分别证明了这一点。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba

    胰腺星状细胞的培养条件gydF4y2Ba

    文化已经被激活gydF4y2Ba

    在使用培养激活的PSCs的实验中，细胞以每孔20 000个细胞的密度播种在未包被的塑料培养板中。然后在37°C的95%空气/5% CO中培养细胞gydF4y2Ba2gydF4y2Ba当细胞合流达到70%时进行气氛和实验。gydF4y2Ba

    静止的和激活的PSCsgydF4y2Ba

    在一些实验中，从相同的细胞制剂中提取的静止和激活的PSCs与MMP2分泌进行比较。我们之前的研究已经证实，当PSCs在含10%胎牛血清的培养基中培养48小时时，显示激活表型。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba为了比较静止的和激活的PSCs，新鲜分离的细胞以50-100×10的密度进行播种gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba细胞/孔置于含10%胎牛血清的IMDM无涂层塑料孔中，孵育24小时(静止细胞)或48小时(激活细胞)。然后将培养基改为含有0.2%胎牛血清的IMDM，细胞再孵育24小时。然后收集分泌物进行MMP2分析。gydF4y2Ba

    胰腺星状细胞分泌MMP的评估gydF4y2Ba

    ZymographygydF4y2Ba

    正如Herron和同事所描述的，PSCs分泌MMP通过酶谱法进行评估。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba这种方法可以检测出潜在的和活性的mmp形式。蛋白质通过含有基质(如明胶)的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，基质很容易被基质切割。样品中mmp的存在可以被检测为与考马斯蓝染色凝胶相裂解的白色条带。在本研究中，将I型明胶添加到标准Laemmli丙烯酰胺聚合混合物中，最终浓度为1 mg/ml(0.1%)，制备酶谱凝胶。PSCs在无血清培养基中孵育24小时，然后收集无血清培养基，以1500转/分离心10分钟以去除细胞和碎片，并与非还原样品缓冲液(0.4 M Tris, pH 6.8, 5%十二烷基硫酸钠(SDS)， 20%甘油，0.03%溴酚蓝)混合。样品在60 V的条件下通过4%的堆积凝胶电泳，然后在100 V的条件下通过10%的溶解凝胶电泳。电泳后，凝胶在2.5% Triton X-100中轻轻摇动洗涤30分钟，然后在室温下培养缓冲液(40 mM Triton - hcl, 0.2 mM NaCl, 6.67 mM CaCl)中培养30分钟gydF4y2Ba2gydF4y2Ba， 0.1% Triton X-100, pH 7.8)。然后用新鲜的缓冲液替换显影缓冲液，凝胶在37°C下孵育一夜。用新鲜制备的0.5%考马斯蓝R-250在10%乙酸和40%甲醇中染色2小时，并用新鲜考马斯蓝染色液(45%乙醇，10%乙酸)进行染色。凝胶用脱色溶液洗涤(3×15分钟)，并置于储存溶液(5%甲醇，0.75%醋酸)中。如前所述，MMP活性被可视化为裂解带，在深色背景上显示为白色。gydF4y2Ba

    西方墨点法gydF4y2Ba

    用纯化的小鼠单克隆抗体进行western blotting鉴定了静止和激活PSCs分泌的MMP2。所有实验均使用培养的PSCs(1-3代)。4个重复孔的细胞暴露于细胞因子肿瘤坏死因子α (TNF-α 5、10和25 U/ml)、转化生长因子β1 (TGF-β1 0.5和1 ng/ml)和白细胞介素6 (IL-6 0.001、0.1和10 ng/ml)。用乙醇(10和50 mM)或乙醛(150和200 μM)在37°C的无血清培养基中处理细胞24小时。单独用无血清培养基培养的细胞作为对照。为避免血清的混杂作用，采用无血清培养基。gydF4y2Ba

    用Lowry和同事的方法测量星状细胞分泌物的蛋白质浓度gydF4y2Ba25gydF4y2Ba以牛血清白蛋白为标准。用10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离每个样品中的蛋白质(100 μg)。已知的分子量蛋白质标准与样品一起测定。使用商用半干印迹装置(Biorad, Richmond, California, USA)将分离的蛋白质转移到硝化纤维素膜上。将膜在含有0.05% Tween-20 (TTBS)的含Tris缓冲盐水(TBS, pH 7.6)的5%脱脂牛奶中阻塞1小时，以防止抗体的非特异性结合。然后在室温下与单克隆抗mmp2 (1 μg/ml)在5%脱脂牛奶中孵育膜1小时。用TTBS洗涤三次，每次洗涤五分钟后，将膜与辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗体(1:500)在室温下孵育60分钟。然后用TTBS冲洗薄膜(3×5分钟)，最后用TBS冲洗。使用Amersham ECL试剂盒的增强化学发光(ECL)技术检测MMP2条带。MMP2的表达通过扫描放射自显像的密度测定进行量化(Scion Image, Maryland, USA)。 Densitometer readings are expressed as integrated optical densities (arbitrary densitometer units calculated from the density as well as the size of each band/μg protein loaded onto the gel).

    rt - pcrgydF4y2Ba

    采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测PSCs中MMP9 mRNA的表达。通过修改Chomczynski和Sacchi描述的方法从PSCs中提取总细胞RNAgydF4y2Ba26gydF4y2Ba使用三试剂套件，如前所述。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba提取的RNA用分光光度法定量。提取的RNA的A260/A280比值通常在1.7 ~ 1.8之间。提取的RNA琼脂糖凝胶电泳证实了RNA样品的完整性。根据制造商的说明，使用第一链cDNA合成试剂盒反转录细胞总RNA。用MasterTaq试剂盒扩增得到的cDNA，该试剂盒使用之前报道的MMP9引物gydF4y2Ba27gydF4y2Ba甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH，内控)。引物序列如下:gydF4y2Ba

    老鼠MMP9gydF4y2Ba

    前向引物:5 ' AAG GAT GGT CTA CTG GCA C 3 ';反向引物:5 ' AGA GAT TCT CAC TGG GGC 3 '。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba

    老鼠GAPDHgydF4y2Ba

    正向引物:5 ' AAT CCC ATC ACC ATC TTC CA 3 ';反向引物:5 ' GGC AGT GAT GGC ATG GAC TG 3 '。gydF4y2Ba

    反应液为cDNA 4 μl，前后引物各50 pmol, MgCl 2 mMgydF4y2Ba2gydF4y2Ba、0.2 mM dNTPs和2.5 U Taq DNA聚合酶。PCR在94°C预变性2分钟的perkins - elmer热循环器上进行，扩增35个循环，包括94°C 1分钟(变性)、56°C 1分钟(退火)和72°C 1分钟(延伸)。gydF4y2Ba

    胰腺星状细胞分泌TIMP的评估gydF4y2Ba

    反向zymographygydF4y2Ba

    这种方法允许检测样品中的功能性TIMPs。蛋白质在含有添加明胶酶的明胶- sds凝胶中通过电泳分离。功能性TIMPs呈现为暗带，对应于凝胶中明胶酶降解明胶被抑制剂阻止的区域。PSCs (PSC分泌物)的无血清条件培养基使用分子量限制为5000 Da的离心过滤装置进行脱盐和浓缩(Ultrafree -0.5;微孔)。简单地说，离心过滤装置用MilliQ水在4°C下12 000 g离心5分钟。PSC分泌物(400 μl)置于过滤装置中离心12 000gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置15分钟。样品用MilliQ水漂洗2次，按上述方法离心。这项技术的结果是PSC分泌物浓度达到20倍。浓缩分泌物与非还原性样品缓冲液(0.4 M Tris, pH 6.8, 5% SDS, 20%甘油，0.03%溴酚蓝)混合。样品被应用于含有1mg /ml明胶的14%聚丙烯酰胺凝胶和30% (v/v) 10× HT1080细胞的浓缩条件培养基(作为明胶酶的来源)。电泳结束后，凝胶在2.5% Triton X-100中轻轻摇动30分钟冲洗两次，然后在室温下孵育30分钟，孵育缓冲液(40 mM Triton - hcl, 0.2 mM NaCl, 6.67 mM CaCl)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba， 0.1% Triton X-100, pH 7.8)。然后在37°C下孵育一夜。用0.5%考马斯蓝在10%乙酸和40%甲醇中染色，用45%乙醇和10%乙酸染色。人重组TIMP1和TIMP2作为阳性对照。gydF4y2Ba

    rt - pcrgydF4y2Ba

    如前所述，采用RT-PCR检测PSCs中TIMP1和TIMP2 mRNA的表达。从PSCs中分离RNA并进行逆转录。使用MasterTaq Kit扩增cDNA，使用之前报道的TIMP1和TIMP2引物。gydF4y2Ba28日,gydF4y2Ba29gydF4y2Ba如前所述，GAPDH作为阳性对照。TIMP1和TIMP2的引物序列如下:gydF4y2Ba

    老鼠TIMP1gydF4y2Ba

    前向引物:5 ' ACA GCT TTC TGC AAC TCG 3 ';反向引物:5 ' CTA TAG GTC TTT ACG AAG GCC 3 '。gydF4y2Ba28gydF4y2Ba

    老鼠TIMP2gydF4y2Ba

    正向引物:5 ' ATT TAT CTA CAC GGC CCC 3 ';反向引物:5 ' CAA GAA CCA TCA CTT CTC TTG 3 '。gydF4y2Ba29gydF4y2Ba

    PCR在94°C预变性2分钟的perkins - elmer热循环器上进行，扩增35个循环，包括94°C 1分钟(变性)，55°C 1分钟(退火)，72°C 1分钟(延伸)。gydF4y2Ba

    西方墨点法gydF4y2Ba

    用纯化的小鼠单克隆抗体western blotting鉴定PSC分泌物中的TIMP2。培养后的PSCs在37℃的密闭培养板上用乙醇(50 mM)或乙醛(200 μm)在无血清培养基中处理24小时。单独用无血清培养基培养的细胞作为对照。然后将PSC分泌物脱盐并浓缩20倍，如前所述。按照制造商的说明，使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒测定浓缩样品的蛋白质浓度。每个样品等量的蛋白质用凝胶电泳(10%凝胶)分离，转移到硝化纤维素中。已知的分子量蛋白质标准与样品一起测定。按照MMP2的概述进行Western blotting。TIMP2一抗的浓度为50 μg/ml。gydF4y2Ba

    统计分析gydF4y2Ba

    根据实验方案，结果以均值(SEM)表示。数据分析采用方差分析(ANOVA)。gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba如果F检验显著，则使用Fisher保护最小显著性差异进行组间比较。gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba31gydF4y2Ba在说明的地方，数据由学生的配对分析gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。使用Statview II统计软件包进行分析。gydF4y2Ba

    材料gydF4y2Ba

    所有普通化学试剂均为分析试剂级，并从Sigma化学公司(美国密苏里州圣路易斯)购买，所有细胞培养试剂也是如此。胶原酶P购自勃林格曼海姆(Mannheim, Germany)。蛋白酶类型XIV (fromgydF4y2Ba链霉菌属将gydF4y2Ba)从西格玛化学公司获得。DNase购自Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden)。Nycodenz从Nycomed Pharma AS (Oslo, Norway)获得。IMDM从Invitrogen Pty Ltd公司(澳大利亚墨尔本)购买。抗体从以下来源获得:MMP2和TIMP2单克隆抗体(Calbiochem-Novabiochem, Cambridge, Massachusetts, USA);TIMP1单克隆抗体(Chemicon, Victoria, Australia);山羊抗鼠HRP偶联抗体(Dako公司，Carpintaria, California, USA)。大鼠重组TNF-α、TGF-β1和IL-6购自Peprotech (Rocky Hill, New Jersey, USA)。MMP9、TIMP1和TIMP2的引物由Invitrogen Pty Ltd公司合成。预染色的大范围蛋白标准购自Biorad (Richmond, California, USA)。 ECL kit was obtained from Amersham Pharmacia Biotech (Sydney, Australia). The MasterTaq kit was obtained from Eppendorf Scientific (Westbury, New York, USA). The first strand cDNA synthesis kit was obtained from MBI Fermentas (Vilnius, Lithuania). Human recombinant MMP2, TIMP1, and TIMP2 were obtained from Calbiochem-Novabiochem (Cambridge, Massachusetts, USA). Ultrafree-0.5 centrifugal filter devices were obtained from Millipore (Sydney, Australia). BCA protein assay kit was obtained from Progen (Melbourne, Australia). The HT-1080 cell line was a generous gift from Associate Professor John Rasko, Centenary Institute of Cancer, Medicine, and Cell Biology, Sydney, Australia.

    结果gydF4y2Ba

    PSCs在条件培养基中的凝胶溶解活性gydF4y2Ba

    PSC分泌物的酶谱图显示存在大量mmp(图1A)。从图1A中超载的酶谱图可以看出，大部分的胶解活性似乎集中在分子量范围60-80 kDa的区域。最显著的MMP分子量为72 kDa，提示MMP2的存在。另外，在分子量为92 kDa和57 kDa的分子上还观察到不同的条带，提示分别存在MMP9和MMP13。gydF4y2Ba

    图1gydF4y2Ba

    胰腺星状细胞分泌基质金属蛋白酶(MMP)。(A) PSCs条件培养基中的明胶酶活性。超负荷的酶谱显示培养的PSC分泌物中MMP活性。条件培养基来自传代的PSC培养基，在无血清培养基中培养24小时。1-3通道:从三个不同的细胞制剂中提取150 μg蛋白质。车道4-6:75 μg蛋白质来自三种不同的细胞制剂。MW,分子量。(B) Western blot分析PSC分泌物中MMP2。Lane 1:重组MMP2(阳性对照)。Lane 2:无血清培养基培养24小时后得到的PSC分泌物。gydF4y2Ba

    MMP2蛋白印迹gydF4y2Ba

    使用针对MMP2活性和潜伏形式的单克隆抗体，通过western blotting证实了PSC分泌物中MMP2的存在(图1B)。检测到的单个条带与潜在MMP2的分子量(72 kDa)相对应。静止和激活的PSCs均可分泌MMP2(图2A,2B)。然而，激活表型细胞的MMP2分泌明显高于静止表型细胞。静压细胞和激活细胞的密度计单位分别为62.4(3.7)和83.1 (9.7)(p<0.04;n=4个独立的细胞制剂)(图2B)。gydF4y2Ba

    图2gydF4y2Ba

    静止和激活的胰腺星状细胞(PSCs)分泌基质金属蛋白酶2 (MMP2)(A)来自同一细胞制剂的静止和激活的PSC分泌物中MMP2表达的代表性western blot。MW,分子量。(B)所有western blots (n=4个独立的细胞制剂)的密度测定显示，与静止细胞分泌物相比，培养激活的PSCs中MMP2水平显著增加(*p<0.04，学生配对)gydF4y2BatgydF4y2Ba测试)。gydF4y2Ba

    MMP9的表达gydF4y2Ba

    通过RT-PCR，观察到MMP9在五种不同的PSC制剂中的表达(图3A)。PCR产物为280bp，与文献报道一致。gydF4y2Ba27日,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba

    图3gydF4y2Ba

    基质金属蛋白酶9 (MMP9)和金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP1/TIMP2)在胰腺星状细胞(PSCs)中的表达(A)从五种不同的PSC制剂中提取总RNA，用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对MMP9进行分析。在1车道(std)中运行RNA梯子，以确定观察到的PCR产物的大小。2巷的阴性对照(−C)在PCR反应中不含RNA模板。甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH, lane 3)作为内对照。通道4-8包含从5种不同的细胞制剂中提取的MMP9 PCR产物。(B)通过RT-PCR分析从5种不同的PSC制剂中获得的总RNA中TIMP1和TIMP2的表达。上面的面板显示TIMP1的表达，下面的面板显示TIMP2的表达。两个面板都在1号通道中包含一个RNA梯，以确定观察到的PCR产物的大小。gydF4y2Ba

    基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMP1和TIMP2的表达gydF4y2Ba

    RT-PCR显示TIMP1和TIMP2在所有检测的PSC制剂中均有表达(n=5个独立的细胞制剂;图3 b)。TIMP1和TIMP2 PCR产物分别为335 bp和342 bp，与文献报道一致。gydF4y2Ba32gydF4y2Ba

    TIMP2在PSCs条件培养基中的活性gydF4y2Ba

    反酶谱显示PSC分泌物中存在功能性TIMP2(图4A)。检测到一个分子量为21 kDa的暗带，与阳性对照(人重组TIMP2)相对应。然而，尽管使用了20倍浓缩的PSC分泌物，该技术未能显示出任何与TIMP1阳性对照相对应的条带(图4A)，这表明尽管PSCs表达TIMP1的mRNA，但相应蛋白的分泌要么缺失，要么分泌量过低，无法通过该方法检测到。gydF4y2Ba

    图4gydF4y2Ba

    胰腺星状细胞(PSCs)分泌金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)。(A)用反酶谱法分析TIMP1和TIMP2活性。Lane 1:人重组TIMP1。Lane 2:人类重组TIMP2。通道3-5:在无血清培养基培养24小时后，从三种不同的细胞制剂中获得的PSC分泌物。重组TIMP2对应的条带可见于PSC分泌物中。在样品中未发现与TIMP1相对应的条带。MW,分子量。(B)用无血清培养基培养24小时后，TIMP2在细胞中表达的代表性western blot (n=4个独立细胞制剂)。Lane 1:人类重组TIMP2。 Lane 2: PSC secretions.

    TIMPs的Western blottinggydF4y2Ba

    使用针对TIMP2的单克隆抗体进行western blotting也证实了PSC分泌物中TIMP2的存在(图4B)。检测到一个分子量为21 kDa的单条带，与人重组TIMP2(阳性对照)相对应。然而，western blotting未能显示TIMP1阳性对照对应的任何条带(数据未显示)。gydF4y2Ba

    TGF-β1、IL-6、TNF-α对MMP2分泌的影响gydF4y2Ba

    在确定了PSCs可以分泌MMP并且主要的MMP是MMP2之后，本研究的下一个问题是已知的PSC激活因子对这些细胞分泌MMP2的影响。TGF-β1、IL-6和TNF-α(在先前观察到的浓度下)对PSCs的激活作用gydF4y2Ba1，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)对MMP2分泌的影响，采用western blot密度法进行分析。TGF-β1可显著增加PSCs分泌的MMP2(图5A, 5B;N =5个独立的细胞制剂)，浓度为0.5 ng/ml(对照的145.8 (47.8)%;P <0.05)和1 ng/ml(对照组的166.6 (40.1)%;p < 0.05)。同样，与IL-6孵育显著增加MMP2分泌(图6A, 6B;N =5个独立细胞制剂)0.1 ng/ml(对照组的168.2 (41.5)%;P <0.05)和10 ng/ml(对照组的176.2 (49.6)%;p < 0.05)。相比之下，TNF-α浓度为5 U/ml(对照组的122.2 (19.9)%)，10 U/ml(对照组的76.9 (13.3)%)，25 U/ml(对照组的95.4 (12.2)%; n=5 separate cell preparations) had no significant effect on MMP2 secretion by PSCs.

    图5gydF4y2Ba

    转化生长因子β1 (TGF-β1)对胰腺星状细胞(PSCs)分泌基质金属蛋白酶2 (MMP2)的影响。(A)细胞与单独的培养基(对照)或TGF-β(0.5或1 ng/ml)孵育24小时后，MMP2表达的代表性western blot。(B)所有western blot (n=5个独立的细胞制剂)的密度测定显示，与对照组相比，在0.5 ng/ml和1 ng/ml TGF-β1孵育的PSCs中MMP2水平显著升高(*p<0.05)。gydF4y2Ba

    图6gydF4y2Ba

    白细胞介素6 (IL-6)对胰腺星状细胞(PSCs)分泌基质金属蛋白酶2 (MMP2)的影响。(A)单独用培养液(对照)或IL-6(0.01、0.1或10 ng/ml)孵育24小时后，细胞中MMP2表达的代表性western blot。(B)所有western blot (n=5个独立的细胞制剂)的密度测定显示，与对照组相比，在0.1 ng/ml和10 ng/ml IL-6孵育的PSCs中MMP2水平显著增加(*p<0.05)。gydF4y2Ba

    乙醇及其代谢物乙醛对MMP2分泌的影响gydF4y2Ba

    与单独用无血清培养基培养的对照细胞相比，浓度为10和50 mmol/l的乙醇显著增加了PSCs的MMP2分泌(图7A, 7B;N =5个独立的细胞制剂)。当乙醇浓度为10 mmol/l和50 mmol/l时，密度计单位分别为对照的169.2 (33.8)% (p<0.05)和174.3 (31.7)% (p<0.05)。同样，乙醛(150和200 μmol/l)显著增加了MMP2的分泌，分别达到对照的218.46 (83.8)% (p<0.05)和145.5 (13.7)% (p<0.05)(图7B)。gydF4y2Ba

    图7gydF4y2Ba

    乙醇及其代谢物乙醛对胰腺星状细胞(PSCs)分泌基质金属蛋白酶2 (MMP2)的影响(A)代表性的western blot检测MMP2表达在细胞中单独用培养基(对照)，乙醇(10和50 mmol/l;E10和E50)或乙醛(150和200 μmol/l;A150和A200)。(B)所有western blots (n=5个独立的细胞制剂)的密度测定显示，与对照组相比，乙醇(E10和E50)和乙醛(A150和A200)都显著增加了PSCs的MMP2分泌(*p<0.05)。gydF4y2Ba

    乙醇及其代谢物乙醛对TIMP2分泌的影响gydF4y2Ba

    与单独用无血清培养基培养的对照细胞相比，乙醇(50 mM)和乙醛(200 μM)均显著增加了PSCs TIMP2的分泌(图8A, 8B;N =3个独立的细胞制剂)。乙醇和乙醛的密度计单位分别为对照的148.6 (9.5)% (p<0.01)和157.9 (3.7)% (p<0.006)(图8B)。gydF4y2Ba

    图8gydF4y2Ba

    乙醇及其代谢物乙醛对胰腺星状细胞(PSCs)分泌组织抑制物金属蛋白酶2 (TIMP2)的影响。(A)代表性的western blot检测TIMP2表达在细胞中与单独的培养基(对照)，乙醇(50 mmol/l;E50)，或乙醛(200 μmol/l;A200)。(B)所有western blots (n=3个独立的细胞制剂)的密度测定显示，与对照相比，乙醇(E50)和乙醛(A200)均显著增加了PSCs TIMP2的分泌(E50， **p<0.01;A200 * * * p < 0.006)。gydF4y2Ba

    讨论gydF4y2Ba

    这项研究表明，PSCs具有合成和分泌多种基质降解酶的能力，包括MMP2 (PSC分泌物中主要的MMP)、MMP9和MMP13。静止和激活的PSCs均可分泌MMP2，但静止PSCs产生的MMP2量明显低于激活表型产生的MMP2量。PSC激活因子如乙醇和乙醛以及细胞因子TGF-β1和IL-6增加细胞分泌MMP2。本研究还证实了PSCs中金属蛋白酶TIMP1和TIMP2组织抑制剂信使RNA的存在。然而，在蛋白水平上，只有TIMP2在PSC分泌物中被检测到。乙醇和乙醛都能显著增加PSCs对这种抑制剂的产量。gydF4y2Ba

    PSCs可以合成和分泌MMPs这一发现非常重要，因为它表明除了它们在ECM合成中的作用外，PSCs也可能在ECM降解中发挥作用。PSCs分泌的主要MMP为潜伏MMP2。这与Knittel及其同事的研究结果一致gydF4y2Ba32gydF4y2Ba表明肝星状细胞(HSCs)是肝脏中MMP2的主要来源，而MMP2的分泌主要以潜伏形式存在。在本研究中，酶谱学结果表明PSCs也分泌MMP9。RT-PCR研究证实了PSCs合成MMP9的能力。这些发现与以往的报道一致，HSCs可以合成和分泌MMP9。gydF4y2Ba32gydF4y2Ba本研究的酶谱结果也表明在PSC分泌物中存在MMP13。这一发现与最近的一项研究一致，表明造血干细胞表达MMP13的信使RNA。gydF4y2Ba34gydF4y2Ba已知MMP2和MMP9都能降解基底膜胶原蛋白，而MMP13则能降解纤维胶原蛋白。gydF4y2Ba

    通过沉积多余的纤维胶原蛋白来促进纤维形成的细胞也会分泌降解纤维胶原蛋白(MMP13)的蛋白酶，这似乎有点矛盾。然而，正如肝脏研究记录的那样，纤维生成是一个复杂的过程，由ECM合成和ECM降解之间的整体失衡所导致。gydF4y2Ba35gydF4y2Ba对造血干细胞的研究已经证实，当造血干细胞被激活时，会合成更多的ECM蛋白，特别是纤维胶原蛋白，但会关闭蛋白酶的表达，如MMP13(它会降解纤维胶原蛋白)。gydF4y2Ba15日,gydF4y2Ba36 -gydF4y2Ba38gydF4y2Ba总的来说，这些变化可能促进活化星形细胞的前成纤维作用。gydF4y2Ba

    PSCs增加的MMP2分泌可能通过两种方式促纤维形成。首先，MMP2对正常基底膜胶原(IV型)降解的增加可能促进腺体中病理性纤维胶原的沉积。其次，MMP2可能对PSCs产生增殖作用(方式类似于对造血干细胞的报道)gydF4y2Ba39gydF4y2Ba)，导致损伤部位活化的PSCs数量增加，从而导致胶原合成增加。gydF4y2Ba

    基质基质及其抑制剂(TIMPs)对ECM合成和降解的调控是一个复杂的过程。一般来说，TIMPs以可逆和非共价的方式，以1:1的化学计量法与MMP活性位点结合，从而抑制MMP的活性。gydF4y2Ba35gydF4y2Ba然而，TIMPs也被证明在调节mmp从其潜在形式的激活中发挥作用。例如，众所周知，TIMP2在低浓度时，通过充当连接proMMP2的C端和MT1-MMP(激活proMMP2的MMP)的N端的桥接分子，促进MMP2的激活。gydF4y2Ba35gydF4y2Ba另一方面，在高浓度时，TIMP2与proMMP2结合，并抑制MT1-MMP对其的激活。gydF4y2Ba35gydF4y2Ba

    目前的研究表明，培养激活的PSCs表达TIMP1和TIMP2的mRNA。为了评估细胞分泌相应蛋白的情况，进行了反酶谱分析。这项技术证实了TIMP2在PSC分泌物中的存在，这与在造血干细胞中的发现一致。gydF4y2Ba38岁的gydF4y2Ba40gydF4y2Ba然而，尽管使用了20倍浓缩的PSC分泌物，我们的样本中仍无法检测到TIMP1，这表明TIMP1 mRNA可能没有在PSCs中翻译，或者如果翻译，可能分泌量过低，用标准技术无法检测到。PSC的分泌物中缺乏可证实的TIMP1，而反向酶谱分析显示HSC的分泌物中存在TIMP1。gydF4y2Ba40gydF4y2Ba

    TIMP2的分泌被发现由PSC激活因子乙醇和乙醛诱导。这一发现与之前报道的造血干细胞的结果相似，在细胞激活过程中TIMP表达显著增加。gydF4y2Ba38岁的gydF4y2Ba40gydF4y2Ba我们的研究显示，PSCs分泌的MMP2量比TIMP2的分泌量高一个数量级，因为MMP2很容易通过未浓缩的PSC分泌物的酶谱检测到，而TIMP2只能通过浓缩20倍的PSC分泌物的反酶谱检测到。因此，即使乙醇和乙醛诱导的MMP2的增加伴随着TIMP2的增加，后者的增加可能不足以抑制MMP2的净活性，特别是考虑到TIMP2与MMP2以1:1的化学计量关系结合。此外，考虑到低浓度TIMP2可以激活MMP2，观察到TIMP2的增加可能会增强MMP2的基质降解作用。gydF4y2Ba

    本研究中检测的促炎细胞因子(TNF-α和IL-6)在急性胰腺炎患者的胰腺组织和血清中均升高。gydF4y2Ba41gydF4y2Ba这些细胞因子的血清水平与疾病的严重程度直接相关。gydF4y2Ba42 -gydF4y2Ba45gydF4y2BaTGF-β在人慢性胰腺炎中有过表达。gydF4y2Ba46岁,gydF4y2Ba47gydF4y2Ba体外研究表明，PSCs被激活(通过增加细胞增殖、α-平滑肌肌动蛋白和/或胶原合成表示)gydF4y2Ba1，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)。因此，研究这些细胞因子对PSCs分泌MMP2的影响是很有意义的。我们的研究发现，TGF-β1和IL-6均显著增加了MMP2的分泌，而TNF-α则无影响。我们对TGF-β1的研究结果与Shek和同事最近对大鼠PSCs的研究相似。gydF4y2Ba48gydF4y2Ba对于造血干细胞，TGF-β1的作用在两种表达上调的情况下都存在争议gydF4y2Ba49gydF4y2BaMMP2表达未见变化。gydF4y2Ba32gydF4y2Ba据我们所知，目前还没有关于TNF-α和IL-6对PSCs分泌MMP的影响的发表研究。然而，我们对TNF-α的研究结果与在造血干细胞中的报道一致gydF4y2Ba32gydF4y2Ba说明TNF-α对这些细胞的MMP2表达和分泌无显著影响。gydF4y2Ba

    我们之前已经证明，PSCs被临床相关浓度的乙醇(慢性胰腺炎的主要相关因素)及其代谢物乙醛激活。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba在目前的研究中，我们发现这些化合物可诱导PSCs分泌MMP2和TIMP2。到目前为止，尚无乙醇对PSCs或HSCs分泌MMP和TIMP的影响的报道。然而，乙醛已被证明上调了从正常人类肝脏培养的造血干细胞中MMP2基因的表达。gydF4y2Ba50gydF4y2Ba

    总之，本研究证明了PSCs具有合成和分泌基质降解酶及其抑制剂的能力，为这些细胞可能在ECM降解调节中发挥作用的概念提供了支持。PSCs即使在静止期也能分泌MMP2这一事实表明，在正常胰腺中，PSCs通过调节ECM的合成和降解，在维持正常ECM中发挥作用。在病变胰腺中，PSCs对TGF-β1、IL-6、乙醇和乙醛等因子的响应增加了MMP2的分泌，可能导致基底膜降解增加，这反过来可能促进纤维(病理)胶原的沉积，导致腺体纤维化的发展。这一领域的进一步研究可能有助于发现新的分子靶点，可以通过调节这些靶点来改变PSCs在ECM降解方面的功能，从而预防/改善慢性胰腺炎纤维化的发展。gydF4y2Ba

    致谢gydF4y2Ba

    我们感谢John Rasko副教授(澳大利亚悉尼癌症、医学和细胞生物学百年研究所)提供HT-1080细胞系。该项目得到了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会、澳大利亚退伍军人事务部和澳大利亚酿酒者基金会的资助。gydF4y2Ba

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