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摘要
背景:钙粘蛋白是一种参与肿瘤侵袭/转移的粘附分子。沉默的钙粘蛋白启动子CpG甲基化在家族性和散发性胃癌中均有发现。幽门螺杆菌是一类胃癌致癌物。
目的:本研究旨在调查甲基化与钙粘蛋白而且H幽门消化不良患者的胃粘膜，胃癌患者手术标本的肠化生、原发性和转移性腺癌。
方法:钙粘蛋白甲基化研究采用甲基化特异性聚合酶链反应，在显微解剖组织活检或外科切除标本甲基化。钙粘蛋白免疫组化法研究表达。
结果:钙粘蛋白31%(11/35)的消化不良患者的胃粘膜存在甲基化，并与H幽门感染(p=0.002)，但与患者年龄或有无胃炎无关。钙粘蛋白0%(0/8)正常粘膜，57%(12/21)肠化生，58%(15/26)原发癌和65%(21/32)转移癌存在甲基化。钙粘蛋白来自同一切除标本的92%(11/12)肠化生和原发癌的甲基化状态一致，85%(17/20)原发癌和转移癌的甲基化状态一致。钙粘蛋白胃癌中的甲基化与肿瘤侵袭深度(p=0.02)和区域淋巴结转移(p=0.05)相关。
结论:钙粘蛋白甲基化是胃癌发生的早期事件，是由H幽门感染。
- 钙粘蛋白甲基化
- 胃癌
- 肠上皮化生
- 幽门螺杆菌
- 聚合酶链式反应
- 甲基化特异性聚合酶链反应
- cox - 2,环氧酶2
来自Altmetric.com的统计
e -钙粘蛋白是在上皮细胞上表达的一种跨膜糖蛋白，负责钙依赖性的同型细胞粘附。它与一些细胞质蛋白结合，包括α-， β-和γ-连环蛋白，这些蛋白又与肌动蛋白相连。1，2细胞-细胞和细胞-基质相互作用在肿瘤转化和转移中起着至关重要的作用。3 -6细胞粘连缺陷可能导致接触抑制生长的丧失，这是肿瘤过程中重要的早期步骤。此外，细胞黏附的丧失可能解释了癌细胞跨越正常组织边界和转移的能力。e -钙粘蛋白在维持细胞黏附中的重要性暗示其功能障碍可能在肿瘤发生过程中起重要作用。7
在胃癌发生中，e -钙粘蛋白的关键作用被观察到家族性胃癌与种系突变有关钙粘蛋白基因。8，9此外，体细胞突变钙粘蛋白在弥漫性组织型胃癌中约有50%可见。10最后，在家族性胃癌和种系胃癌两家系中钙粘蛋白突变，启动子CpG高甲基化被发现是废除的第二个“遗传打击”钙粘蛋白表达式。11这些结果表明E -钙粘蛋白是一个重要的肿瘤抑制基因参与胃癌的发生。
胃癌的发生是一个多步骤的形态学进展过程，涉及多个遗传和表观遗传事件，存在肠化生-发育不良-侵袭性癌序列。12现在越来越多的人认识到，启动子CpG高甲基化对基因表达的表观遗传沉默是癌症中抑制肿瘤基因和肿瘤相关基因失活的一种重要替代机制。13在胃癌和前体中也是如此。14日,15幽门螺杆菌感染是胃癌的一个重要的病因危险因素，被世界卫生组织的国际癌症研究机构归类为I类或明确的致癌物。16
在本研究中，我们评估了钙粘蛋白通过研究无癌变或不典型增生的消化不良患者的胃粘膜、肠上皮化生、胃癌手术患者的原发癌和转移淋巴结中基因的启动子高甲基化，在散发性胃癌中甲基化。特别是两者之间的联系钙粘蛋白甲基化和H幽门被评估。
材料和方法
病人和标本
本文研究了35例因消化不良而接受胃镜检查的患者的胃粘膜活检。评估苏木精和伊红染色玻片是否存在胃炎、肠化生或异型增生。H幽门用组织学和脲酶呼吸试验评价感染情况。研究了胃腺癌切除患者胃切除标本中8个正常粘膜、21个肠化生、26个原发性腺癌和32个转移淋巴结的DNA。这些肿瘤是根据日本胃癌研究协会的数据进行分级的17并根据世界卫生组织的分类方案进行分类。18DNA是通过5 μm厚的苏木精和伊红染色的石蜡包埋组织切片进行显微解剖获得的，无覆盖层，如前面所述。19H幽门通过组织学评估18例原发性腺癌标本的感染状况。获得所有患者组织获取的知情同意。
甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)用于e -钙粘蛋白启动子甲基化
甲基化状态钙粘蛋白如前所述，启动子是通过亚硫酸氢盐处理DNA然后MSP确定的。20.简单地说，2 μg DNA用2 M NaOH在37℃下变性10分钟，然后用3 M亚硫酸氢钠，pH 5.0，在50℃下孵育16小时。亚硫酸氢盐处理后的DNA进行纯化(DNA Cleanup Kit;Promega, Madison, Wisconsin, USA)，用3m NaOH在室温下孵育5分钟，用10m醋酸铵和100%乙醇沉淀，用70%乙醇洗涤，在20 μl蒸馏水中重悬。DNA (2 μl)通过聚合酶链反应(PCR)，用Herman和同事描述的两组针对甲基化和未甲基化等位基因的引物进行扩增20.和格拉夫及其同事21CpGenome通用甲基化DNA (Intergen, Purchase, New York, USA)钙粘蛋白每次实验均采用甲基化和试剂空白作为阳性和阴性对照。所有测试都是重复执行的。如前所述，为了确认MSP的特异性，从甲基化和未甲基化引物中提取的PCR产物进行凝胶纯化和测序。22
(A)甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)特异性的确认。野生型的钙粘蛋白基因序列与甲基化聚合酶链反应(PCR)产物的序列一起显示。M1: PCR产物(如图所示，从核苷酸2280到2339,Genbank登录号为D49685)，第一引物设置，如Herman和同事所述，20.的甲基化钙粘蛋白等位基因(正向引物:5 ' - TTA GGT TAG AGG GTT ATC GCG T -3 ';反向引物:5 ' - TAA CTA AAA ATT CAC CTA CCG ACC -3 ')。引物为未甲基化的钙粘蛋白等位基因向前:5 ' - TAA TTT TAG GTT AGA GGG TTA TTG T -3 ';反向:5 ' - CAC AAC CAA TCA ACA ACA CA -3 '。在MSP产品中，未发生改变的甲基胞嘧啶残基用蓝色下划线标出，已变成尿嘧啶/胸嘧啶的未甲基胞嘧啶残基用红色下划线标出。(B) M2:第二引物组的PCR产物甲基化钙粘蛋白等位基因(这里显示的是从核苷酸2229到2283)，正如格拉夫和他的同事所描述的21，表示甲基化钙粘蛋白等位基因(正向引物:5 ' - GTG GGC GGG TCG TTA GTT TC -3 ';反向引物:5 ' - CTC ACA AAT ACT TTA CAA TTC CGA CG -3 ')。未甲基化E-cadherin等位基因的引物向前:5 ' - GGT GGG TGG GTT GTT AGT TTT GT -3 ';反向:5 ' - AAC TCA CAA ATC TTT ACA ATT CCA ACA -3 '。
e -钙粘蛋白免疫组化染色
用亲和素-生物素复合物免疫过氧化物酶法免疫染色检测e -钙粘蛋白的表达。23简单地说，4 μm厚的组织切片在二甲苯中脱蜡，然后用酒精和水连续复水。内源性过氧化物酶用3%过氧化氢阻断10分钟，然后微波抗原提取9分钟，在95°C, pH 6.0的10 mM柠檬酸钠缓冲液中。然后用亲和素偶联的单克隆抗e -钙粘蛋白抗体(HECD-1 1:500稀释于磷酸盐缓冲盐水;Zymed Laboratories Inc.， South San Francisco, USA)在37°C的潮湿室中放置1小时。结合抗体用生物素化二抗和亲和素-生物素复合物免疫过氧化物酶法检测(Dako Corp.， Carpinteria, USA)。最后用梅尔氏苏木精反染色。阴性对照用小鼠IgG替代一抗。以胃粘膜正常的载玻片作为阳性对照。此外，相邻非受累胃黏膜e -钙粘蛋白染色阳性作为内阳性对照。e -钙粘蛋白染色分为无染色、细胞质分布、异质染色和正常膜染色。 Because staining patterns often varied within the same tumour, particularly when the degree of differentiation varied, the classification was based on the dominant pattern. Tumours with more than 10% variation were scored as heterogenous.
统计分析
Fisher恰当检验和χ2测验用于比较范畴联想和学生的范畴联想t测试连续关联。采用双面检验计算p值。采用正向条件模型的多变量分析来评估年龄、胃炎和H幽门感染到钙粘蛋白消化不良患者胃粘膜的甲基化。之间的关系钙粘蛋白我们评估了26例原发癌的甲基化状态和临床病理特征，包括年龄、癌的组织学亚型、肿瘤侵袭的深度、区域淋巴结的存在和范围以及远处转移。
结果
MSP上皮
MSP和两组引物分别用于甲基化和未甲基化钙粘蛋白启动子在阳性对照和阴性对照中均达到预期结果，且在所有被测标本中均达到一致结果。对PCR产物的测序证实了甲基化和未甲基化等位基因中与亚硫酸根修饰相关的预期核苷酸变化(图1A, 1B)。
消化不良患者胃粘膜中e -钙粘蛋白的甲基化、表达和临床病理关系
35例消化不良患者的临床病理联系见表1。胃炎31例(89%)H幽门19例(54%)感染。患者H幽门与未感染的患者相比，感染患者年龄更大(53(14)岁v38(12)年;p = 0.002)。H幽门感染也与胃炎相关(p=0.009)。在组织学评估中，任何活组织检查均未见肠化生或异型增生。钙粘蛋白11例(31%)患者出现胃黏膜甲基化(图2A, 2B)。所有11例钙粘蛋白甲基化导致胃炎(NS)(表1)。E -钙粘蛋白甲基化与H幽门感染:53%(10/19)患者H幽门感染了钙粘蛋白甲基化vs 94%(15/16)无甲基化患者H幽门感染，无甲基化(p=0.002)(表1)钙粘蛋白甲基化组比未甲基化组年龄更大(53(13)岁v43(15)年;p = 0.048)。H幽门感染是唯一与之相关的因素钙粘蛋白多因素分析甲基化(p=0.013(95%可信区间0.007-0.55))。然而，免疫组化染色显示，无论有无e -钙粘蛋白的膜染色均正常E -钙粘蛋白甲基化。这可能是由于免疫组化染色在检测基因甲基化亚群细胞时不如PCR灵敏，从而导致E-cadherin下调。
(A)甲基化分析钙粘蛋白在消化不良患者的胃粘膜中。样品N3-N6被甲基化，样品N1、N2和N7未被甲基化。用第一组引物进行甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)，得到了116 bp的甲基化聚合酶链反应(PCR)产物和97 bp的未甲基化PCR产物。(B)甲基化分析钙粘蛋白在消化不良患者的胃粘膜中，如(A)所示，但用第二引物组进行MSP。样品N3-N6被甲基化，样品N1、N2和N7未被甲基化。(C)甲基化分析钙粘蛋白在肠化生(IM)，胃腺癌(T)和转移淋巴结(LN)的胃癌患者。样品IM2、T1、T2、LN1和LN2甲基化，样品IM1未甲基化。使用第一个引物进行MSP。
胃癌切除标本中e -钙粘蛋白的甲基化、表达和临床病理关系
钙粘蛋白8例正常粘膜中0例(0%)存在甲基化，21例肠化生中12例(57%)存在甲基化，26例原发癌中15例(58%)存在甲基化，32例转移癌中21例(65%)存在甲基化(图2C)。来自同一患者的12例肠化生和癌症中有11例(92%)甲基化状态一致，20例原发性和转移性癌症中有17例(85%)甲基化状态一致。一名患者在肠化生中有甲基化，但没有发生原发癌;另一名患者发生未甲基化的原发癌，但发生了甲基化的转移癌;还有两名患者发生了甲基化的原发癌，但发生了未甲基化的转移癌。对13例原发癌和9例转移癌进行e -钙粘蛋白免疫组化。11种原发癌症的e -钙粘蛋白膜分布缺失(图3A)E -钙粘蛋白甲基化(100%)。在两种保留E-cadherin表达的原发癌症中，该基因在一种情况下被甲基化，在另一种情况下未被甲基化。7例淋巴结转移癌的e -钙粘蛋白染色减弱(图3B)， 5例(71%)的e -钙粘蛋白染色减弱E -钙粘蛋白甲基化。在剩下的两种保留E-cadherin表达的癌症中，该基因在一种癌症中甲基化，在另一种癌症中未甲基化。钙粘蛋白甲基化与肿瘤侵袭深度相关。所有3个局限于固有层(T1)的肿瘤均未发生甲基化，但23个侵犯固有肌层或以上的肿瘤中有15个(65%)发生了甲基化(p=0.02)(表2)。钙粘蛋白甲基化也与局部淋巴结转移有关。5例(80%)无淋巴结转移的患者中有4例(80%)未甲基化，21例(67%)有区域转移的患者中有14例(p=0.05)甲基化(表2)。H幽门感染情况、组织学亚型或远处转移情况。
e -钙粘蛋白的免疫组化染色，显示(A)正常胃粘膜的膜性分布染色，(B)胃癌细胞的细胞质染色，(C)转移淋巴结肿瘤细胞的细胞质染色。
讨论
在这项研究中，我们发现钙粘蛋白甲基化患者H幽门无化生或异型增生的感染，发生于肠化生，以及因胃癌接受胃切除术的患者的原发性和转移性癌症。钙粘蛋白甲基化存在于1 / 3的消化不良患者的胃粘膜，并与年龄和H幽门感染。然而，通过多元分析H幽门感染是唯一重要的影响因素。H幽门可通过核因子κB和环氧合酶2 (COX-2)等炎症介质诱导转录激活。24日,25胃上皮细胞中的甲基化可能是慢性暴露于感染期间过度产生的炎症介质的结果，也可能是一种适应性保护反应，这种机制在病毒感染中已被描述过，26或化生、异型增生和因食管慢性反流损伤和结直肠炎症性肠病而发生的癌。27日,28前者得到了之前一项研究的支持H幽门在没有启动子甲基化的胃细胞系中被刺激COX-2的表达COX2甲基化的细胞系中没有cox - 2启动子。25然而，COX-2的表达可以通过5-氮杂胞苷去甲基化处理后再暴露H幽门甲基化的细胞系中cox - 2启动子。因此，有可能钙粘蛋白甲基化可能通过类似的反应机制介导H幽门感染。最后，有趣的是，只有大约一半的胃炎病例H幽门感染了钙粘蛋白甲基化。这可能与抽样效应有关钙粘蛋白甲基化与H幽门感染可能是局部的。或者，其他协作机制一起H幽门可能涉及感染钙粘蛋白甲基化。
而且，很明显只有一小部分H幽门相关的胃炎进展为癌。根据克努森的"两次袭击"假说，29两个基因突变需要灭活一个假定的肿瘤抑制基因。启动子甲基化抑制基因表达可能与突变或缺失协同导致基因失活，从而实现Knudson的假设。30.因此，发生额外的遗传事件可能是必要的钙粘蛋白基因失活，导致癌变发生。
我们没有观察到两者之间的联系H幽门感染和钙粘蛋白胃癌中的甲基化。这可能与这是一个回顾性分析的事实有关，所以之前H幽门所有癌症病例的感染状况都不清楚。然而，这也是众所周知的H幽门感染率随胃癌的发展而下降31而单纯的组织学检查也不能准确反映之前接触过H幽门感染。
钙粘蛋白在我们的研究中，57%的胃癌患者肠化生中存在甲基化。在肿瘤发育过程中，高甲基化的时机因不同的基因和肿瘤类型而异。康和他的同事们15甲基化在DAP-kinase，THBS1,TIMP-3出现在胃炎中，而p16而且hMLH1存在于肠化生和癌症中。我们证明了频率钙粘蛋白甲基化频率最高p16(2.1%),hMLH1(6.3%),THBS-1(34.7%),DAP-kinase(36.7%)和TIMP-3肠化生(36.7%)。15
甲基化的钙粘蛋白在我们的研究中，存在于58%的原发癌和66%的转移到淋巴结的癌症中，这一频率与以前的报道相当。14有趣的是，在转移性淋巴结中钙粘蛋白甲基化，有两例原发肿瘤显示钙粘蛋白甲基化。在e -钙粘蛋白表达的免疫组化研究中也观察到类似的结果。23据推测，e -钙粘蛋白的表达可能是动态的。因此，原发肿瘤中E-cadherin的下调可能使细胞分散到循环系统中，而E-cadherin的重新表达可能使细胞在远处沉积形成转移灶。23
总的来说，两者是一致的钙粘蛋白免疫染色显示甲基化和E-钙粘蛋白表达减少。然而，在淋巴结有一个原发癌和一个转移癌钙粘蛋白甲基化与E-钙粘蛋白染色减少无关。这可能表明癌细胞具有钙粘蛋白甲基化只是肿瘤的一个小亚克隆，它被敏感的MSP检测到。
临床病理相关性显示钙粘蛋白甲基化与侵袭深度和淋巴结转移相关。这种模式表明，不断增加的获得E -钙粘蛋白甲基化可能与肿瘤的进展有关。如果钙粘蛋白甲基化也是一个重要的启动事件，如发生在肠化生进展为胃癌，在定量增加钙粘蛋白甲基化可能是随着肿瘤克隆体逐渐增大而发生的。为了进一步验证这些可能性，分析钙粘蛋白需要通过定量分析甲基化。32尽管有这些生物学上的考虑，侵袭深度和淋巴结转移与钙粘蛋白甲基化是可能与不良预后相关的参数。其实，作用钙粘蛋白免疫组化研究已证实可作为胃癌的预后标记物23，33血清酶联免疫吸附试验。34此外，E-cadherin表达的缺失在浸润性生长且无细胞间粘连的上皮癌中最为明显，如侵袭性小叶型乳腺癌和弥漫性胃腺癌。肿瘤侵袭性的增加钙粘蛋白在我们的研究中发现的甲基化可能与这些发现一致。
总之，我们已经证明了钙粘蛋白胃中的甲基化和H幽门没有癌症的消化不良患者的感染，以及肠化生和癌症的感染。此外,钙粘蛋白胃癌的甲基化也与胃腺癌的肿瘤侵袭深度和淋巴结转移有关。然而，本研究的结果不排除其他机制H幽门感染可能会独立导致钙粘蛋白甲基化。一个可行的假设可能是胃粘膜感染H幽门提升者钙粘蛋白甲基化可能随后发展为肠化生和浸润性癌症。这样的假设需要在未来的研究中进行有力的检验。最后，潜在的贡献钙粘蛋白甲基化和其他H幽门相关的病理可能需要进一步的调查。
致谢
元乐会由嘉道理慈善基金资助。该项目得到了美国医科大学研究基金的支持。