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摘要
背景与目的:大约25%的患者在一次感染性腹泻发作后出现类似肠易激综合征的慢性肠紊乱。尽管我们之前已经表明，在急性疾病发生时或之前起作用的心理社会因素似乎可以预测感染后肠易激综合征(PI-IBS)的发展，但我们发现急性感染后直肠中炎症细胞数量的增加持续了至少三个月，这表明在PI-IBS的发展中也有一种有机成分参与。为了进一步评估这一点，我们测量了白细胞介素1β (IL-1β)及其受体拮抗剂(IL-1ra)在这些患者中的表达，以提供额外的证据，证明PI-IBS的发病机制是由炎症过程支撑的。
方法:前瞻性地在急性胃肠炎期间和三个月后从8名发生感染后肠易激综合征(INF-IBS)的患者和7名在急性胃肠炎后恢复正常排便习惯的患者(感染对照，INF-CON)中获得连续直肠活检样本。18名在过去两年内未患过肠胃炎的健康志愿者作为正常对照(NOR-CON)。采用逆转录聚合酶链反应检测IL-1β和IL-1ra基因表达，琼脂糖凝胶电泳后采用光密度法定量表达水平。
结果:在急性胃肠炎期间和3个月后，INF-IBS患者直肠活检中IL-1β mRNA的表达明显高于INF-CON患者。此外，急性感染后3个月，INF-IBS患者活检中IL-1β mRNA表达增加，但在INF-CON患者中未观察到一致的变化。在胃肠炎后3个月，INF-IBS患者IL-1β mRNA的表达明显高于no - con，而INF-CON患者IL-1β mRNA的表达与no - con患者差异不显著。尽管IL-1β mRNA的表达有差异，但IL-1ra mRNA的表达在三组间未见明显变化。
结论:这些发现表明，与未发生PI-IBS的患者相比，感染后发生IBS的患者在感染期间和感染后都表现出更高的IL-1β mRNA表达。我们的结论是，这类患者可能对炎症刺激敏感，炎症可能在PI-IBS的发病机制中发挥作用。
- 白介素- 1β
- 肠易激综合症
- 感染后肠易激综合症
- IBS，肠易激综合症
- PI-IBS，感染后IBS
- IL-1β，白细胞介素1β
- IL-1ra，白细胞介素1受体拮抗剂
- PCR，聚合酶链式反应
数据来自Altmetric.com
越来越多的人接受急性细菌性胃肠炎可能在易感人群中诱发肠易激综合征(IBS)。事实上，一项大型队列研究表明，细菌性胃肠炎对IBS发展的相对风险为11.9。1前瞻性研究表明，感染后发生肠易激综合征的患者在实际患病时比排便习惯恢复正常的患者表现出更多的焦虑、抑郁和压力生活事件。2 -4这一观察结果支持了行为因素是感染后IBS表达的重要决定因素的假设。
动物模型的研究表明，短暂和表面的肠道感染会导致长期的功能障碍。5这与细胞因子在黏膜腔室和深层神经肌肉层的表达有关。6，7持续性功能障碍状态可被皮质类固醇逆转，表明它是由炎症介质积极维持的。对感染后肠易激综合征(PI-IBS)患者的研究表明，黏膜中的炎症细胞增加3.8在没有突发性肠道感染病史的IBS患者中也有类似的观察，9这促使人们猜测炎症可能在更广泛的肠易激综合征人群的发病机制中发挥作用。10 -12一项初步报告表明，由于抗炎细胞因子白细胞介素10和转化生长因子β的分泌低，一些IBS患者可能具有遗传上的炎症易感性。13因此，无法有效地下调炎症反应可能会使患者在感染后易患肠易激综合征。
细胞因子白细胞介素1β (IL-1β)是炎症过程的重要调节因子。14日,15它的生物活性被其天然存在的拮抗剂(IL-1ra)抑制，正是这些细胞因子的平衡决定了IL-1β的生物利用度，从而决定了它对炎症的贡献。16 -18我们实验室的一项初步研究表明，伴有腹泻的肠易激综合征患者的一个子集表现出IL-1β水平升高。19因此，我们选择在胃肠炎期间和之后从患者获得的直肠活检中测量IL-1β和IL-1ra mRNA水平，以验证PI-IBS患者对感染有更大炎症反应的证据，并且感染后这种反应持续存在的假设。
研究对象与方法
患者和正常对照组
研究对象是从1993年至1995年在我院感染性疾病病房连续收治的228名急性胃肠炎患者中前瞻性招募的。在他们入院期间进行了详细的访谈和有效的肠道症状问卷调查。符合肠易激综合征标准的患者20.或任何其他慢性肠道疾病发作前的肠胃炎被排除在研究之外。我们排除了67例患有肠易激综合征的患者，12例之前接受过肠道手术的患者和10例患有炎症性肠病的患者。在139名符合条件的患者中，30名患者拒绝参与，反应率为78%。发生PI-IBS的患者为22例。在我们之前的研究中3.我们获得了直肠活检的石蜡包埋组织学切片，用于细胞计数。在我们发现细胞计数增加后，为了本研究的目的，我们从后续患者那里获得了额外的活检样本。通过这种方式，我们能够从8名发生PI-IBS (INF-IBS)的患者和7名肠胃炎后排便习惯恢复正常的患者(感染对照组(INF-CON))中获得足够重量的连续直肠活检。在参与研究的其他患者中，要么没有直肠活检样本，要么只在研究的两个时间点中的一个时间点有样本，即急性感染时或感染后三个月。
这些患者被要求在肠胃炎发作三个月后再次进行评估。在随访期间，患者再次完成肠道症状问卷。那些有持续症状的患者由胃肠病学家进行调查，以排除器质性疾病，随后至少一年每三个月联系一次，以研究他们疾病的症状学和自然史。通过这种方式，我们确定了8例胃肠炎后症状与IBS一致的患者，并将他们组成PI-IBS组(INF-IBS)进行研究。所有这些患者均报告排便疼痛减轻，排便习惯改变，如罗马标准所述。20.6人腹泻，1人便秘，1人排便习惯交替。7例肠胃炎后排便习惯恢复正常的患者为感染对照组(INF-CON)。在急性感染期间进行的粪便培养，有7名患者呈阳性(INF-IBS: 4名沙门氏菌，1名沙门氏菌大肠杆菌；infr - con:一个沙门氏菌，一个志贺氏菌)。大多数患者(全部为INF-IBS, 4例为INF-CON)在急性胃肠炎期间接受了抗生素治疗。正常对照组(NOR-CON)由18名不符合肠易激综合征标准的健康志愿者组成，他们最近没有肠胃炎史。这些人是通过在当地医院和大学刊登广告招募的。表1总结了学科特征。感染对照组明显比健康对照组年龄大。
临床协议
所有患者在急性入院期间和肠胃炎发作后约3个月进行乙状结肠镜检查和直肠活检。在INF-IBS组和INF-CON组中，急性肠胃炎发病时间和第二次直肠活检时间之间的间隔是相当的(见表2)。在正常对照组中也是如此。每次乙状结肠镜检查前均获得知情同意。
首先检查直肠黏膜是否有炎症变化。在离肛缘6 - 8厘米的后壁，远离任何明显炎症区域，至少进行两次直肠活检。一个样品在液氮中快速冷冻，用于随后的RNA提取(方法如下所述)。另一个样本放入福尔马林中，送去做常规组织病理学检查。
RNA制备
采用改良硫氰酸胍法制备总RNA。21活检组织在4 M异硫氰酸胍溶液中均质。RNA在等体积的水饱和苯酚-氯仿-异戊基溶液(pH 4.0)中提取。离心后，上部水相在20°C下沉淀于两体积乙醇中过夜。RNA颗粒用75%乙醇清洗，晾干。通过测量光密度对得到的RNA进行定量。
如前所述，RNA逆转录为互补DNA (cDNA)。22通常，从每个样品中提取3 μg总细胞RNA，与500ng低聚脱氧thymidylic acid引物(Promega, Madison, Wisconsin, USA)在20 μl无核糖核酸酶水中混合。然后，RNA通过将混合物加热到70°C 10分钟，然后逐渐冷却到37°C来退火。在退火后的混合物中，加入15单位的逆转录酶，1ml的dATP, dCTP, dGTP和25单位的商业RT反应缓冲液(Promega)中的RNasin。然后在42°C下孵育60分钟，然后在90°C下加热10分钟终止逆转录反应。
基于以下互补DNA序列信息设计感兴趣的信息引物:β-actin上游5 ' -CCT TCC TGG GCA TGG AGT CCT G -3 '，下游5 ' - gga GCA ATG TTG ATC TTC-3 ';IL-1β上游5 ' - AGC TTG GTG ATG TCT GGT CCA T-3 '，下游5 ' - gag GTG CTG ATG TAC CAG TTG-3 ';IL-1ra上游5 ' -AGA AGA CCT CCT GTC CTA TG-3 '，下游5 ' -TAC TCG TCC TCC TGG AAG TA-3 '。基本的聚合酶链式反应(PCR)方案与其他地方描述的相同。22cDNA (2 μl)与上游、下游引物各1 μl和Thermus aquaticus (Taq) DNA聚合酶(Promega) 0.5 μl混合。使用了以下循环参数:变性94°C×30秒;退火57°C×30秒;扩展72°C×60秒;最终延伸72°C×five分钟相对靶mRNA。基于阳性(溃疡性结肠炎患者炎症黏膜样本)和阴性(去离子水)对照的初步研究，IL-1β使用了30个循环，IL-1ra和β-actin使用了32个循环。每个RNA样本都直接用于PCR，以确保没有DNA污染。
PCR最终产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，并用溴化乙锭染色。干燥后，凝胶被拍照，底片被用于光密度法进行半定量(图1再现了凝胶与感染后3个月样品的照片)。根据光密度法评估的肌动蛋白含量，对样品进行归一化。
(A)感染后肠易激综合征患者(INF-IBS)和(B)感染后对照组(INF-CON)中白细胞介素1β (IL-1β) mRNA的表达(2%琼脂糖凝胶用溴化乙胺染色;30个聚合酶链式反应循环)。INF-IBS患者在急性胃肠炎后发生IBS, INF-CON患者在急性胃肠炎后恢复正常排便习惯
统计分析
在第一个实例中进行方差分析，如果这显示出统计学上显著的差异，则独立样本t用检验比较两组间的结果。的χ2检验用于分类数据的比较。考虑到多重比较，α设为0.01。
结果
在所有研究对象中均未发现炎症性肠病的组织学特征。在6例急性胃肠炎患者(3例INF-IBS和3例INF-CON)中观察到轻微的炎症变化。在胃肠炎后3个月，所有患者乙状结肠镜检查均正常，送到我们组织病理学实验室的任何活检均未报告炎性肠病或显微镜下结肠炎。
在急性胃肠炎期间，INF-IBS患者IL-1β mRNA的表达明显高于INF-CON患者(见表2)。这一差异在3个月后因INF-IBS患者而非INF-CON患者的活组织检查中IL-1β mRNA的表达显著增加而加剧(图1,2)。3个月时，INF-IBS患者IL-1β mRNA的表达显著高于正常对照组，而INF-CON患者则没有。
感染后INF-IBS患者(急性胃肠炎后出现肠易激综合征)和INF-CON患者(急性胃肠炎后恢复正常排便习惯)白细胞介素1β (IL-1β) mRNA表达的变化
在胃肠炎期间或之后的三组活检中，IL-1ra mRNA的表达没有显著差异(表2，图3)。
感染后白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1ra) mRNA在INF-IBS患者(急性胃肠炎后出现肠易激综合征)和INF-CON患者(急性胃肠炎后恢复正常排便习惯)中的表达变化
讨论
这项研究的结果表明，与未发展为IBS的感染患者相比，继续发展为IBS的急性胃肠炎患者IL-1β mRNA的表达更高。这与临床观察相一致，即较严重的感染性胃肠炎患者更有可能在感染后发生肠易激综合征。3.4动物研究也表明，宿主对初始感染反应的减弱降低了感染后肠道功能障碍的程度。6综上所述，这些观察结果表明，除了之前确定的行为决定因素外，2有机因素在感染后肠易激综合征的发展中很重要。
最近的一份初步报告表明，一些肠易激综合征患者的基因型与炎症性肠病患者的基因型相似。13具体来说，一些IBS患者的抗炎细胞因子白细胞介素10和转化生长因子β的分泌水平较低。这样的患者可能会无效地下调炎症反应，并且可能比对照组表现出更强的炎症标志物。目前发现急性胃肠炎期间IL-1β mRNA的表达增加，这些患者随后发展为肠易激综合征，这支持了急性炎症反应增强可能是感染后肠易激综合征的决定因素的观点，并引发了这可能是由基因决定的猜测。
我们发现有IBS症状的患者直肠黏膜中IL-1β mRNA的表达增加，但在感染后无症状的个体中没有，这表明炎症可能有助于PI-IBS的表达。这与我们之前的结果一致3.和其他人的8这表明PI-IBS患者粘膜中的炎症细胞数量增加。综上所述，这些观察结果有助于越来越多的文献表明，在肠易激综合征患者的结肠中存在低级别炎症和免疫激活。11由于这些发现并不局限于有明显感染史的患者，肠胃炎似乎是易感人群中可能诱发炎症性肠易激综合征的几个诱因之一。
我们选择IL-1β mRNA表达仅仅是作为炎症的普遍标志物，我们不重视PI-IBS患者直肠活检中该细胞因子mRNA表达的增加。IL-1β局限于粘膜间室，不太可能导致被认为是IBS症状产生基础的感觉或运动活动的变化。动物研究表明，肠粘膜浅表感染伴随炎症和粘膜隔室促炎细胞因子的表达，进而导致深层神经肌肉层细胞因子的表达。7在动物模型中，Th2细胞因子IL-4和IL-13的表达肌层外对于神经肌肉功能的改变是至关重要的。6因此，IL-1β的黏膜表达可被视为深层组织发生变化的替代标记物。
一个需要解决的关键问题是，抗炎疗法是否对有持续轻度炎症证据的IBS患者有用。虽然在动物模型中，肠外给药皮质类固醇或局部环加氧酶抑制剂治疗逆转了感染后肠道功能障碍，但初步报告表明，PI-IBS可能并非如此。23PI-IBS中逆转肠道功能障碍的治疗机会窗口可能与动物模型中看到的不同，介质及其口服抗炎治疗的可及性也可能不同。
总之，本研究的主要发现是，胃肠炎患者的外周炎症反应增强，随后发展为肠易激综合征，这与之前确定预测感染后肠易激综合征发展的行为因素的工作形成对比。我们不认为这些途径是相互排斥的。相反，有越来越多的证据表明，行为和外周炎症过程会影响疾病的表达，并且在基于动物的研究中有支持的例子。已有研究表明，先前的压力会增强对随后炎症刺激的反应24这种压力可能会重新激活静止性结肠炎25以及随之而来的肠道生理变化。26综上所述，这些观察结果强调了行为和炎症过程在肠道感染后肠易激综合征发展中的重要性。
致谢
部分由前谢菲尔德联合医院特别受托人的拨款和格拉斯哥皇家内科和外科医生学院的旅行奖，英国消化基金会-亨特和赫斯特旅行奖，以及惠康英国- cihr加拿大。K-AG得到了英联邦大学协会、新加坡国立大学和生理学会的奖学金支持。