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摘要
背景:噬菌体随机显示肽技术已被用于识别抗体或受体配体的结合表位。
目的:从噬菌体库中分离出的肽被克罗恩病(CD)患者血清中的抗体特异性识别。
方法:建立由9种氨基酸组成的噬菌体随机肽库，利用CD患者血清免疫球蛋白G进行序列筛选。
结果:从噬菌体库中分离到5种不同的CD特异性肽。在与每个CD患者血清表现出不同结合特征的五种肽中，有四种(cd1， -3至-5)的氨基酸序列没有同源性。相反，两种肽(CDP-1和-2)具有相似的氨基酸序列和相似的结合特征。合成了4种多抗原肽(MAP, CDP-1， -3 ~ -5)，并利用这4种多肽建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清抗体。92例CD患者中有52例(56.5%)采用ELISA检测，20例溃疡性结肠炎(UC)患者中无检测，25例十二指肠溃疡患者中仅检测1例，48例健康者中仅检测3例。
结论:本研究分离的四种多肽的ELISA检测可用于CD和UC的鉴别诊断。
- 克罗恩氏病
- 噬菌体随机显示肽技术
- 炎症性肠病
- 溃疡性结肠炎
- 血清学标记
- 乳糜泻，克罗恩病
- UC，溃疡性结肠炎
- DU，十二指肠溃疡
- IBD，炎症性肠病
- pANCA，核周抗中性粒细胞胞浆抗体
- ASCA,反酿酒酵母抗体
- 酶联免疫吸附试验
- 辣根过氧化物酶
- MAP，多重抗原肽
- IPTG,异丙基-β-d-thiogalactopyranoside
- 牛血清白蛋白
- D-PBS, Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水
- 磅,Luria-Bertani
- 三甲,3,3,5,5 ' -tetramethylbenzidine
- OD，光密度
- ROC，受试者工作特征
数据来自Altmetric.com
- 乳糜泻，克罗恩病
- UC，溃疡性结肠炎
- DU，十二指肠溃疡
- IBD，炎症性肠病
- pANCA，核周抗中性粒细胞胞浆抗体
- ASCA,反酿酒酵母抗体
- 酶联免疫吸附试验
- 辣根过氧化物酶
- MAP，多重抗原肽
- IPTG,异丙基-β-d-thiogalactopyranoside
- 牛血清白蛋白
- D-PBS, Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水
- 磅,Luria-Bertani
- 三甲,3,3,5,5 ' -tetramethylbenzidine
- OD，光密度
- ROC，受试者工作特征
炎症性肠病(IBD)以病因不明的慢性胃肠道炎症为特征。免疫、环境、感染和遗传因素被假定为增加IBD发展的风险。IBD的体征和症状通常是非特异性的，临床上很难将IBD与其他儿童和青少年疾病(如慢性腹泻、反复腹痛和急性感染性结肠炎)区分开来。目前，IBD的诊断需要结合典型的临床体征和症状，排除其他疾病，以及与IBD一致的x线、内镜和组织学特征。1，2尽管有仔细的临床评估，据报道，10-15%的结肠炎儿童有不确定的形式3.42-4%的接受结肠切除术治疗溃疡性结肠炎(UC)的患者最终被确定患有克罗恩病(CD)。5，6因此，能够准确区分CD和UC的特异性血清学标记物具有临床应用价值。
最近，一些针对IBD患者的候选血清学测试已经被描述出来，包括那些具有抗-抗体的患者酿酒酵母抗体(ASCA),7 -9核周抗中性粒细胞细胞质抗体(pANCA)，7 -9antipancreatic抗体,10antierythrocyte抗体,11抗内皮细胞抗体，12抗菌/增透蛋白抗体，13还有抗p40抗体。14ASCA和pANCA的研究最为广泛。然而，ASCA和pANCA的敏感性和特异性不足，特别是在鉴别CD和UC方面。7 -9
噬菌体随机显示肽库已被广泛应用于筛选与靶标分子(如抗体和受体)结合的肽。15日,16这种方法只需要噬菌体展示的随机肽库、目标疾病患者的血清和正常人或患者的血清进行区分，对于识别疾病特异性抗体的配体非常有用。因此，它特别适合于研究病因和病理抗原在很大程度上未知的自身免疫性疾病。事实上，一些研究已经使用噬菌体展示的肽库来治疗自身免疫性疾病，如风湿性关节炎，17日,181型糖尿病，19以及自身免疫性血小板减少症20.
我们怀疑，通过从CD患者和UC患者的血清中选择噬菌体随机显示的肽库中选择肽，有可能开发一种特异性的血清学检测方法来鉴别CD和UC。在本研究中，我们使用这种策略从CD患者血清抗体识别的非肽噬菌体库中识别肽，但UC患者血清抗体不识别。
材料与方法
试剂
为了筛选乳糜泻特异性多肽和检测多抗原多肽(MAPs)抗体，制备了以下物质和试剂。噬菌体载体(pTV119N)购自Takara Syuzo(志贺，日本)。氨苄西林、异丙基-β-d-硫半乳糖yranoside (IPTG)和kanamycin来自Wako Pure Chemical (Osaka, Japan)。寡核苷酸由Amersham Pharmacia Biotech (Tokyo, Japan)合成。抗人免疫球蛋白G (IgG)来自Biodesign公司(Kennebunk, Maine, USA)。牛血清白蛋白(BSA)来自Seikagaku Kogyo (Tokyo, Japan)。酪蛋白来自Calbiochem (La Jolla, California, USA)。抗m13噬菌体单克隆抗体来自Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK)。磁珠(tosylactivated Dynabeads M-450)来自Dynal (Oslo, Norway)。96个用于亲和选择和噬菌体ELISA的微孔板(免疫板Maxisorp)来自Nalge Nunc国际公司(Rochester, New York, USA)，用于MAP酶联免疫吸附试验(ELISA)的微孔板(Coster)来自康宁公司(Corning, New York, USA)。
用于亲和选择的免疫球蛋白固定化磁珠或微量滴定板
用抗人IgG固定的磁珠根据制造商的说明制备(抗hu-IgG磁珠)。按照标准方法制备抗人IgG包被的微量滴度板21加上一些修饰(抗hu- igg板)。
血清样本
为分离CD特异性肽显示噬菌体，采集了20份CD患者血清样本、20份UC患者血清样本和20份无症状健康受试者血清样本。利用分离出的多肽进行酶联免疫吸附试验(ELISA)后，又收集了72份CD样本、25份十二指肠溃疡(DU)样本和28份无症状健康样本，以评估ELISA的临床应用价值。根据兵库医学院消化内科内科的临床、放射学、组织学和内窥镜检查结果，对CD、UC和DU进行了诊断。此外，根据炎症的主要部位将CD患者分为三组:结肠CD组(n=11)，包括9例小肠炎症面积较小的患者;小肠CD组(n=32)，包括31例结肠炎症面积较小的患者;结肠/小肠CD组(n= 49)，结肠和小肠均有较大的炎症区域。
随机肽显示噬菌体库
为了建立与丝状M13噬菌体的主要外壳蛋白(pVIII)融合的随机非分子肽的噬菌体文库，按照标准方法构建了pVIII蛋白显示的噬菌体载体。22通过位点定向诱变方法构建Sac I和BamH I位点，将随机的27位寡核苷酸插入pVIII蛋白基因近N端。聚合酶链式反应模板为5 ' - GCTGCTGAGGGTGAGCTC (NNK)。9GGGGATCCCGCAAAAGCGGCCTTT-3”。模板中的N表示任意核苷酸，K表示G或t，将随机寡核苷酸DNA文库转化为大肠杆菌JM109感受态细胞经电穿孔和感染转化大肠杆菌JM109细胞与M13KO7辅助噬菌体一起建立噬菌体随机显示肽库。噬菌体库与UC患者igg固定的磁珠一起孵育，以排除与UC相关的噬菌体(预吸收噬菌体)。
使用患者血清进行亲和选择
三名随机选取的CD患者(A、B血清)的30 μl混合血清样本用2×10孵育8抗hu- igg磁珠4℃过夜。磁珠用冲洗缓冲液(含有0.1% BSA和0.1% Tween 20的Dulbecco 's磷酸盐缓冲盐水(D-PBS))洗涤10次后，用1×10孵育11预吸收的噬菌体颗粒在4°C过夜并清洗。结合在磁珠上的噬菌体用噬菌体洗脱缓冲液(100 mM盐酸调至pH 2.2，含1%牛血清白蛋白和0.1%酚红)洗脱，然后用1 M三(羟甲基)氨基甲烷氯化缓冲液(pH 9.1)中和。大肠杆菌制备JM109，用噬菌体洗脱感染。受感染的大肠杆菌然后用M13KO7辅助噬菌体重叠感染，在含有150 μg/ml氨苄西林、100 μg/ml卡那霉素和0.1 mM IPTG的Luria-Bertani (LB)培养基中孵育，37℃剧烈摇晃，扩增洗脱噬菌体(先摇浴)。扩增被洗脱的噬菌体后，将噬菌体与相同的混合血清样本或固定在抗hu- igg板上的单个血清样本再次平移(第二次平移)。洗涤后，结合在平板上的噬菌体用噬菌体洗脱缓冲液洗脱并感染大肠杆菌JM109。将细胞镀于含有150 μg/ml氨苄青霉素和1%葡萄糖的LB琼脂板上，37℃孵育过夜。从每个亲和选择中随机选取200个菌落，在含有150 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃独立孵育3小时，剧烈震动。在含150 μg/ml氨苄西林的LB培养基中，用M13KO7辅助噬菌体感染细胞，并依次与100 μg/ml卡那霉素和0.1 mM IPTG混合。37℃剧烈摇晃孵育过夜后，用ELISA(噬菌体酶联免疫吸附法)评价每种扩增噬菌体溶液的免疫反应性。
噬菌体ELISA
96孔微量滴度板涂布抗m13噬菌体单克隆抗体。每个孔中加入噬菌体溶液(10 μl)和噬菌体ELISA缓冲液(含0.5% BSA、0.05% Tween 20和10%正常山羊血清的D-PBS) 90 μl, 37℃孵育1小时。用PBST(含0.05% Tween 20的D-PBS)洗涤4次后，加入在噬菌体ELISA缓冲液中1:100稀释的血清样品100 μl, 37℃孵育1小时。用PBST清洗后，加入1:2万稀释的辣根过氧化物酶(HRP)结合山羊抗人IgG(室内)100 μl, 37℃孵育1小时。洗净后，加入含3,3 '，5,5 ' -四甲基联苯胺(TMB)的底物溶液100 μl，室温孵育10分钟显色。加入1 N硫酸100 μl后停止显色。在450nm处测量光密度(OD)。
目的噬菌体克隆的筛选
采用噬菌体酶联免疫吸附法(ELISA)对每个亲和选择的200个噬菌体克隆进行筛选，并对一名乳糜泻患者的血清样本进行二次筛检(阳性筛选)。阳性筛选的噬菌体克隆采用噬菌体酶联免疫吸附法(噬菌体酶联免疫吸附法)，使用随机选择的10名健康个体(阴性筛选)的混合血清进行筛选。以20例CD患者、20例UC患者和20例健康人的血清样本，采用噬菌体酶联免疫吸附法(ELISA)检测阴性筛选的噬菌体克隆。最终筛选出与多个CD样品反应阳性、对UC样品无反应的噬菌体克隆和健康样品(噬菌体)(最终筛选)。
用双脱氧核苷酸链终止法测定最终筛选的吞噬体的DNA序列。推导出的DNA序列转化为氨基酸序列。
地图综合
根据Fmoc策略，从MAP(8)翼树脂(Watanabe Chemical，广岛，日本)开始，使用ACT-357肽合合器(Advanced ChemTech，东京，日本)合成多个抗原肽(MAPs)。通过水解后的氨基酸分析来确认每个MAP合成。
地图ELISA
将MAP混合物(CDP-1， -3至-5的混合物)涂于微量滴度板孔上。血清样品(100 μl)用MAP ELISA缓冲液(100 mM三羟甲基氨基甲烷氯化钠缓冲液(pH 8.0)，含0.5 M氯化钠、1.5%酪蛋白、0.2% Tween 20和2%正常山羊血清)1:100稀释后，置于MAP板上，25°C震动1小时。为了使用MAP混合物(鸡尾酒MAP ELISA)进行定量检测，还在每个板中孵育由阳性血清样品制备的一系列稀释校准剂(300、100、50、25和0单位/ml，任意单位)。洗净后，用HRP标记的山羊抗人IgG孵育。洗净后，加入含TMB的底物溶液100 μl，室温孵育15分钟显色。加入1 N硫酸100 μl后停止显色。在450nm处测量OD。在鸡尾酒MAP ELISA中，使用同时测量的校准剂OD制备的校准曲线计算样品的抗体滴度。计算出超过300单位/毫升的样品被进一步稀释并测定以获得实际抗体水平。
ASCA ELISA
根据制造商的说明，使用市售ELISA试剂盒(Medipan diagnostics, Selchow, Germany)测量血清样品中的ASCA。
结果
吞噬体的选择
为了分离CD特异性吞噬体，我们收集了20名CD患者、20名UC患者和20名健康受试者的血清样本。随机选取6个乳糜泻样本，制备2个混合血清样本(混合血清A和B)，每个混合其中3个样本。在分别使用混合血清A和B的亲和选择中，分离出两个吞噬体(CDP-1和-2)和一个吞噬体(CDP-3)。当使用这三种吞噬体检测其余14个未被选择用于制备合并血清样本的CD患者样本的反应性时，8个CD样本对吞噬体没有反应性。然后联合使用混合血清A和8个单独样本(C-J)进行额外的噬菌体选择。结果，结合混合血清a和两个单独样本(血清C和E)，从噬菌体库中分离出另外两个噬菌体(CDP-4和-5)(表1，图1)。
克隆氏病(CD)患者(n=20)、溃疡性结肠炎(UC)患者(n=20)和健康人(n=20)血清的噬菌体免疫反应性反应活性(黑条)用450nm处的实际光密度(OD)表示。
在20名乳糜泻患者中，每个被分离出的吞噬体仅在部分患者中表现出阳性反应，但在20例UC患者或20例健康受试者的噬菌体ELISA检测中未观察到阳性反应(图1)。这些结果表明，使用分离的噬菌体检测到的抗体与CD密切相关。在CDP-1和CDP-2之间观察到类似的免疫反应性，但其余噬菌体表现出与反应性相关的不同特征(图1)。5个噬菌体上显示的肽的氨基酸序列见表1。用于亲和选择的CDP-1和CDP-2从同一组合的血清样本中分离出来，具有3个相同的氨基酸和2个相关的氨基酸。相比之下，其余三种肽(CDP-3、-4和-5)的氨基酸序列在它们之间没有同源性，也与CDP-1(或-2)没有同源性。由于四种肽(CDP- 1， -3， -4和-5)之间没有关系，因此当这四种map用作鸡尾酒抗原时，预期会有更高的敏感性。因此，这四种多肽被合成为MAP，并使用涂有这四种MAP混合物的板开发了鸡尾酒MAP ELISA。
鸡尾酒MAP法
对92份CD样本(其中20份用于亲和选择)、20份UC患者(用于噬菌体ELISA)、25份DU患者(用于噬菌体ELISA)和48份健康人(包括20份用于噬菌体ELISA)进行鸡尾酒MAP ELISA检测。一个典型的标准曲线和实际OD校准器，包括空白校准器，如图2所示。用92份CD样本和48份健康样本计算得到鸡尾酒MAP试验和ASCA试验的受试者工作特征(ROC)曲线如图3所示。鸡尾酒MAP法比ASCA法获得更好的ROC曲线。在特异性大于90%的病例中，ROC曲线确定截断值24单位/ml为最准确的点。
鸡尾酒多抗原肽(MAP)酶联免疫吸附试验(ELISA)的典型标准曲线和各标准抗体溶液包括空白溶液(0单位/ml)的实际光密度(OD)。数据在对数刻度上绘制，并绘制线性标准曲线。
鸡尾酒多抗原肽(MAP)酶联免疫吸附试验(ELISA)和抗酿酒酵母抗体(ASCA) ELISA试剂盒。对鸡尾酒MAP ELISA和ASCA ELISA的ROC曲线进行灵敏度-特异性比较。利用92例克罗恩病患者和48例健康受试者的ELISA结果计算敏感性和特异性。每一种化验的截止点用箭头表示。
正如预期的那样，在鸡尾酒MAP ELISA中，CD患者的抗体滴度明显高于UC患者(Mann-Whitney U检验p<0.0001)、DU患者(p<0.0001)和健康受试者(p<0.0001)(图4A)。鸡尾酒MAP ELISA的敏感性和特异性分别为56.5%(52/92)和95.7%(89/93)。DU患者仅有1份阳性样本(n=25)，健康受试者仅有3份阳性样本(n=48)，且这些阳性样本的抗体滴度分布在截断点附近。
克罗恩病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、十二指肠溃疡(DU)患者和健康受试者血清抗体滴度用鸡尾酒多抗原肽(MAP)酶联免疫吸附试验(ELISA) (A)和抗酿酒酵母抗体(ASCA)酶联免疫吸附试验(B)。每个截断值用折线表示。数据分析采用Mann-Whitney方法U测试(**p<0.001， ***p<0.0001)。
当用ASCA ELISA试剂盒测量相同的血清样本时，与鸡尾酒MAP ELISA相比，观察到的敏感性(30.4%)和特异性(91.4%)值都要低得多，并且在大多数情况下，UC、DU患者和健康受试者中大多数阳性样本的抗体滴度足够高(图4B)。
在CD中按炎症部位分类的三组(结肠CD组、小肠CD组、结肠/小肠CD组)中，鸡尾酒MAP ELISA检测无显著性差异(图5)。在结肠CD组与UC患者的比较中，两者有微小但显著性差异(p=0.0004)。此外，两名仅在结肠有炎症的CD患者中，有一人在鸡尾酒MAP ELISA中显示出很高的抗体滴度(1019.3单位/ml)。这些结果表明，鸡尾酒MAP ELISA能够检测结肠和小肠中与乳糜泻相关的抗体。
结肠克罗恩病(CD)组、小肠CD组、结肠/小肠CD组与溃疡性结肠炎(UC)患者抗体滴度比较截断值用折线表示。数据分析采用Mann-Whitney方法U测试。
CD患者ASCA ELISA与鸡尾酒MAP ELISA结果比较，无相关性(r=0.050, Fisher 's r to z转换检验p=0.6362)(图6)。92例CD患者中，双阳性17例，ASCA ELISA单阳性11例，鸡尾酒MAP ELISA单阳性35例，双阴性29例。由于两种elisa检测结果之间无相关性，故两种检测结果合并时敏感性提高至68.5%。
鸡尾酒多抗原肽(MAP)酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清抗体滴度与抗血清抗体滴度的相关性酿酒酵母抗体(ASCA) ELISA试剂盒。采用克罗恩病患者(n=92)血清抗体滴度分析，采用Fisher r to z转换试验。
讨论
目前用于诊断IBD和区分CD与UC的诊断测试是侵入性和昂贵的。尽管使用了这种侵入性和昂贵的诊断方法，一些结肠炎患者在最初诊断时不能容易地分为CD或UC。因此，为了及时准确地诊断UC和CD，需要进行无创检测。一些候选血清学检测，包括ASCA和pANCA已被研究。尽管ASCA和pANCA检测结果已分别被证明与CD和UC相关，但报道的敏感性和特异性较差，特别是在日本。23日,24因此需要对乳糜泻和结肠炎进行更具体的血清学测试。
为了开发一种针对CD的特异性血清学测试，我们利用噬菌体展示技术来识别与CD相关的肽。通过将噬菌体与UC患者血清IgGs固定的磁珠孵育，从噬菌体展示的肽库中吸收UC相关噬菌体后，通过两个独立的噬菌体亲和选择和修改选择从噬菌体库中筛选CD相关肽。通过亲和选择得到了5种不同的与CD密切相关的肽。虽然每种肽只检测到15-25%的CD患者，但使用5种肽中的4种(鸡尾酒MAP法)的ELISA检测到92名CD患者中的52名(56.5%)，20名UC患者中没有检测到，25名DU患者中只有1名(4.0%)，48名健康受试者中只有3名(6.3%)。这些结果表明这些肽只与CD相关。当使用ASCA ELISA试剂盒检测相同的血清样本时，敏感性和特异性明显低于鸡尾酒MAP法。此外，本研究中ASCA ELISA与鸡尾酒MAP ELISA结果之间未发现相关性。尽管MAP ELISA的检测性能优于ASCA ELISA，但之前的一份报告指出，市售ASCA试剂盒在敏感性和特异性上存在差异。25因此，有必要进一步比较使用不同ASCA试剂盒获得的结果。
在鸡尾酒MAP ELISA中观察到的CD患者样本的反应性高于噬菌体ELISA，这可能是因为在MAP ELISA中肽可以直接包被在微量滴度孔上，而噬菌体上显示的肽必须被包被在微量滴度孔上的抗噬菌体抗体捕获。
在三组按炎症部位分类的CD患者中，抗体滴度无明显差异。因此，CD患者炎症的位置不影响MAP ELISA结果。
5个肽中有2个(CDP-1和-2)氨基酸序列相似，具有相似的免疫反应性。对这两种肽的免疫反应性被另一种肽完全抑制(数据未显示)，证明这两种肽检测相同的抗体，并表明它们模拟蛋白质的相同区域。其余3个肽与CDP-1(或-2)在氨基酸序列上无同源性，在免疫反应性上无相关性。因此，我们推测这些多肽模拟不同的蛋白质或同一蛋白质的不同区域。蛋白质数据库的搜索显示，肽的氨基酸序列与已知的乳糜泻相关的自身抗原或任何已知生物体的不相关蛋白质之间没有显著的相似性。由于模拟天然表位的能力并不一定对应于强序列同源性，因此需要额外的信息，如乳糜泻患者血清抗体识别的关键氨基酸，以识别本研究中识别的肽所模拟的蛋白质。
总之，我们利用噬菌体随机肽技术开发了一种新的克罗恩病血清学检测方法。该血清学试验被证实对克罗恩病非常特异性，并应有助于克罗恩病和溃疡性结肠炎的鉴别诊断。由于ASCA和pANCA等血清学标记物的流行率在世界范围内都有变化，因此需要对本研究中开发的ELISA进行多中心前瞻性研究。