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摘要
背景和目标:5q31号染色体细胞因子簇的遗传变异(IBD5风险单倍型)在加拿大人群中与克罗恩病(CD)相关。我们研究了IBD5在英国和日本人群中都存在单倍型风险。疾病关联也有报告CARD15 / NOD2而且肿瘤坏死因子变体。在动物模型中已经显示了易感位点之间复杂的相互作用，我们测试了三个CD相关位点之间潜在的基因-基因相互作用。
方法:基于家族的关联分析在457个英国家庭(252个溃疡性结肠炎，282个CD三组)中进行IBD5单体型,常见的CARD15,肿瘤坏死因子−857变异。为了检验变异之间可能的上位相互作用，在其他位点上进一步按基因型对传播不平衡检验分析进行分层，并使用单倍型相对风险模型进行新的对数线性分析。对178名日本乳糜泻患者和156名健康对照进行了病例对照关联分析IBD5单体型。
结果:的IBD5在英国白人人群中，单倍型与CD相关(p=0.007)，而与UC无关。的CARD15变异和IBD5单倍型表现出加性主效应，特别是没有发现上位相互作用的证据。的变体IBD5单倍型在日本极为罕见。
结论:的IBD5风险单倍型与英国乳糜泻相关。易患乳糜泻的遗传变异表现出异质性和人群特异性差异。
- 克罗恩氏病
- 溃疡性结肠炎
- 炎症性肠病
- IBD轨迹
- 乳糜泻，克罗恩病
- UC，溃疡性结肠炎
- 炎症性肠病
- TDT，传输不平衡试验
- 肿瘤坏死因子α
- NFκB，核因子κB
- 聚合酶链式反应
- SNP，单核苷酸多态性
统计数据来自Altmetric.com
炎症性肠病(IBD)、克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)是胃肠道的慢性疾病。来自双胞胎研究的综合数据显示，同卵双胞胎中乳糜泻和UC的一致性高于异卵双胞胎，分别为33%对4%和13%对2%1 -3.-受影响个体的兄弟姐妹相对于一般人群的风险(λ年代CD为15-40,UC为8-10。4这些数据表明，IBD的疾病易感性有很强的遗传成分。
来自三个不同位点的遗传变异最近被证明与乳糜泻相关。首先，单核细胞的突变CARD15 / NOD2与乳糜泻有关的基因5 -7CARD15的富含亮氨酸重复区被认为具有与细菌成分(包括脂多糖)的结合活性，CARD15的激活刺激核因子κB (NFκB)通路和随后的细胞因子产生。8其次，我们已经描述了IBD和肿瘤坏死因子−857 c / T启动子多态性(位于6号染色体内，IBD3在英国白种人中。9我们证实了高刺激肿瘤坏死因子α (TNF)的产生肿瘤坏死因子−857 c转录因子OCT1的等位基因特异性结合，以及OCT1与TNF启动子内NFκB的相互作用。最后，在第5q31号染色体上一个250 kb的细胞因子基因簇的遗传变异(IBD5位点和风险单倍型)与加拿大高加索人群中的乳糜泻密切相关。10虽然引起疾病的突变还没有被精确地描述，但风险单倍型中包含的基因包括免疫调节细胞因子。
多种遗传变异被认为会影响像乳糜泻这样的复杂疾病。影响表型表达(例如，一个人是否会患乳糜泻)的变异可能会以一种附加的方式相互独立地起作用，称为遗传异质性。或者，变异之间可以相互作用，影响表型表达的程度比单个变异独立作用所预期的更大。上位效应被定义为由于多个变量之间复杂的相互作用而产生的非加性效应。在人类中，阿尔茨海默氏病、乳腺癌、赫什普隆氏病和镰状细胞性贫血中已发现遗传变异之间的互作。11 -14此外，白细胞介素10缺乏的IBD小鼠模型显示了一些易感位点之间的上位相互作用，15这些发现提示了最近发现的乳糜泻遗传变异之间可能的上位相互作用的研究。
我们研究了IBD5风险单倍型影响英国白种人乳糜泻，并首次评估了UC和日本乳糜泻人群的相关性。我们进行了进一步的分析，以研究不同乳糜泻相关变异之间的遗传异质性或上位性:CARD15(染色体16),IBD5(染色体5)，和肿瘤坏死因子(6号染色体)。
材料与方法
主题
有一个或多个孩子感染IBD的北欧高加索家庭通过牛津胃肠病学小组确定。来自457个家庭的双亲均可获得，其中101个家庭有两个或两个以上受感染的兄弟姐妹对，356个家庭只有一个受感染的后代。共获得282例CD组、252例UC组和10例不确定结肠炎组的数据。CD表型遗传分层后分析的三胞胎数量(所有标记的完全基因分型)为:CD- card15 -0: 184个三胞胎;CD-CARD15-1 +2: 95三重奏;CD-IBD5-0: 77三重奏;CD-IBD5-1+2: 200三重奏;CD-TNF−857 cc: 251首三重奏;和CD- TNF−857 ct / TT: 27个三重奏。
日本样本来自178名在日本东北大学医院(仙台，日本)就诊的乳糜泻患者。我们招募了156名生活在与健康对照组相同地区的日本志愿者。
在这两个人群中，IBD的诊断是基于临床症状和根据常规标准的内镜、x线和组织学检查结果。表1描述了两个人群中乳糜泻患者的人口学和表型数据。该研究获得了英国和日本机构的伦理批准。
基因分型
先前报道的11个单核苷酸多态性(SNPs)具有250 kb独特的等位基因IBD5风险单倍型，并且由于彼此之间几乎处于完全的连锁不平衡和相似的等位基因频率，它们的遗传信息基本相同。10我们对5 '端和3 '端的两个snp进行了基因分型IBD5单体型(http://www.genome.wi.mit.edu/humgen/IBD5)，以确认在我们的种群中连锁不平衡的程度相似，并使后续的准确识别IBD5风险单体型。IGR2060a_1和IGR3096a_1分别使用多重序列特异性聚合酶链反应(PCR)扩增(Amplitaq Gold, Applied Biosystems标准协议)进行基因分型。对于IGR2060a_1，我们在多态性两侧使用引物，并在最多3 '碱基处针对每个等位基因(G等位基因为5 ' - catacatccttgcaaccctg -3 ';对于C等位基因，5 ' - agctcagtcattacctttgcg -3 ')，加上外部引物(5 ' - aatgtgggagggaagagttgtg -3 '和5 ' - tgta AAATGGGGACAATTACAGTG-3 ')，形成两个不同大小的等位基因特异性PCR产物(图1)。对于IGR3096a_1，等位基因特异性引物为:T等位基因(5 ' - gaacccaaaca TCCTGGAGAAT-3 ')， C等位基因(5 ' - ccttggtaggttctcagctg -3 ')和外部引物(5 ' - ggacaaaaatagggccacaag -3 '和5 ' - TGCCACCTCCCATCTCTAAG-3 ')。对于这两个snp，最外层的两个引物也提供了更大的阳性对照带(不是等位基因特异性的)。PCR产物电泳在琼脂糖凝胶上，并用溴化乙锭染色观察(图1)。
IGR2060a_1基因型的琼脂糖凝胶图像。第一排是100 bp DNA大小标记，其次是24个聚合酶链反应(PCR)的产物。PCR产物大小分别为对照(212 bp)、C等位基因(149 bp)和G等位基因(105 bp)。箭头标记，按顺序为:CC纯合子，GC杂合子，GG纯合子。标记“h”的车道为阴性对照(不含DNA)。
常见疾病基因分型CARD15变异(Arg702Trp, Gly908Arg和Leu1007fsinsC)和肿瘤坏死因子如前所述，启动子−857C/T变体通过PCR限制性片段长度多态性试验进行检测。9，16
统计分析
采用GOLD软件包中实现的ldmax算法计算变量间的连锁不平衡(D’)。17我们进行了基于家族的关联分析(传输不平衡测试(TDT))18使用ASPEX程序(ftp://lahmed.stanford.edu/pub/aspex)．模拟计算了TDT χ的经验概率2通过排列父母等位基因进行统计，同时根据家族中兄弟姐妹的血统地位确定身份。因此，当测试来自同一家庭的多个兄弟姐妹时，TDT的p值反映了一种独立于连锁的关联，允许在TDT中使用单型和多型受影响家庭(所有分析均结合了单型和多型受影响家庭)。我们还对相关疾病相关突变的携带进行了进一步的分层分析，将乳糜泻的影响状态重新编码为不受基因型影响的状态。我们将乳糜泻影响的后代按携带或不携带进行分层IBD5,CARD15,肿瘤坏死因子−857变体。对所有的乳糜泻变量进行TDT分析，并对基因型进行分层。我们进行了Kaplan-Meier分析的影响IBD5诊断时的年龄单倍型，使用来自家庭队列的所有乳糜泻患者(包括父母)和对数秩检验来评估显著性(SPSS公司，芝加哥，伊利诺伊州，美国)。
为了正式测试遗传异质性，我们在每个家庭中选择了一个受影响的后代。在多重受影响家庭的情况下，随机选择一个后代，并从几个不同的随机种子中得到类似的结果(数据未显示)。IBD5,CARD15,肿瘤坏死因子−857用MERLIN测定了从每个亲本传递给受影响后代的等位基因。19然后，我们根据家庭数据构建了病例对照研究(使用单个受影响后代的传播/未传播等位基因的单倍型相对风险模型，包括来自纯合子父母的后代20.)，并使用SAS分析套件(SAS Institute Inc.， Cary, North Carolina, USA)中实现的CATMOD程序对主要影响和相互作用进行对数线性分析。
结果
相关研究IBD5英国白种人的单倍型。
从5 '和3 '的极端变量之间的强连锁不平衡IBD5在96例基因型健康白人献血者中观察到IGR2060a_1和IGR3096a_1单倍型(D ' =0.81, p<0.00001)。这些数据证实了在英国人群中的连锁不平衡程度与在加拿大人群中发现的相似(最小)。10因此，后续仅使用IGR2060a_1进行基因分型。
英国家族中IBD、CD和UC表型的TDT结果见表2。乳糜泻与IBD5是复制的。通过IGR2060a_1的遗传/非遗传等位基因比值测定，英国队列的关联强度(1.42)弱于139个加拿大队列的关联强度(2.38)21= 4.8, p = 0.03)。没有证据表明IBD5与UC相关，该位点似乎是CD特异性的。
较弱的联想IBD5单倍型的英国人(确诊后代平均年龄22.4岁)和加拿大人(16.3岁)的乳糜泻患病后代的可能性增加IBD5单倍型可能对乳糜泻诊断时的年龄有影响。为了验证这一假设，我们对乳糜泻的影响进行了Kaplan-Meier分析IBD5英国队列中所有乳糜泻个体诊断年龄的单倍型状态。IBD5在组间的对数秩比较中，单倍型状态对诊断时的年龄没有显著影响(数据未显示)。个体诊断时的平均年龄IBD5风险单倍型为26.5年(SEM 1.0)，杂合子25.4年(SEM 0.7)，纯合子25.2年(SEM 0.8)。
基因型分层关联研究CARD15,IBD5,肿瘤坏死因子−857在高加索乳糜泻中
表3显示了英国家庭中乳糜泻表型的分层TDT结果。在这个队列中，Arg702Trp和Leu1007fsinsC的关联CARD15和乳糜泻的变异肿瘤坏死因子−857 c没有乳糜泻的个体CARD15变种，已经在其他地方报道过。9，16
乳糜泻和IBD5单倍型最强CARD15阴性组，CD与Leu1007fsinsC之间的差异在两组后均相同IBD5分层，乳糜泻和肿瘤坏死因子−857 c只有在CARD15阴性组。CD与Arg702Trp的相关性最强IBD5单倍型占有组。变异组与非变异组间的传播/非传播比(一项与基因型相对风险相关的统计数据)相似2在任何分层后，组间的等位基因传递测试都不显著(表3和未显示的数据)。值得注意的是，TDT只使用了数据集的一部分(因为只统计了来自杂合亲本的等位基因传递)，因此并不是一种测试可能的上位相互作用的强大方法。
CD三重奏的数量肿瘤坏死因子−857 ct / TT分层组小，分析结果需谨慎解释。
英国克罗恩病变异间潜在相互作用的对数线性分析
使用基于家族的数据评估变量间潜在相互作用的显著性的最适当的统计方法尚未建立。因此，我们将家庭数据简化为病例和对照等位基因(样本量相当于230例病例和230个对照个体的研究)。我们使用单倍型相对风险关联统计量进行对数线性分析。首先测试了单位点模型，其中仅对表型(即存在或不存在乳糜泻)的单一遗传变异的影响进行了分析。两个(和类似的三个)位点模型允许对多个遗传变异的主要影响进行分析，并在模型中添加一个更高阶的项，以解释变异之间可能的非加性相互作用(上位性)。因此，这些模型允许检测遗传异质性(也就是说，在考虑了所有非加性相互作用后，关联仍然存在)和上位性。
的Gly908ArgCARD15变异没有显示出与乳糜泻的显著关联，而且在我们的人群中非常罕见，无法测试相互作用。16和之前一样，非分层乳糜泻和肿瘤坏死因子−857 c被观察到。9
的IBD5单倍型和Arg702Trp/Leu1007fsinsCCARD15在TDT分析中观察到，与CD相关的变量(表4)。然后使用两个位点模型对主要影响进行分析，在调节潜在基因-基因相互作用的高阶效应后测试相关性(表5,6)。Arg702Trp和Leu1007fsinsC与CD仍存在显著相关性CARD15变体和IBD5条件作用后的单倍型，为独立的主效应(异质性)提供直接证据。最后，在两个或三个基因座模型中没有发现基因-基因相互作用(上位性)的证据CARD15变异,肿瘤坏死因子−857 c，以及IBD5单倍型，病例组和对照组的等位基因组合频率相似(表5)，所有模型的p值为>0.05(数据未显示)。
关联研究IBD5日本人口的变异
在日本人群中，3例健康对照和2例克罗恩病患者IGR2060a_1是杂合的，而IGR3096a_1在两个日本队列(均为野生型)中均无多态性。无个体为纯合子IBD5单体型。在日本人中这些变异(<1%等位基因频率)的罕见性排除了关联试验。
讨论
在了解IBD的遗传易感性方面已经取得了很大进展。联系研究已经确定了人类基因组中可能包含易感位点的区域，最近报告了来自三个不同位点的疾病相关变异(CARD15/NOD2，染色体5q31细胞因子簇/IBD5风险单倍型和肿瘤坏死因子)．5，7,9，10乳糜泻和CARD15变异已经在高加索人群中得到广泛证实，16日,21 -24另外两个基因座的复制研究还在等待中。
我们首先试图研究英国IBD队列中5q31细胞因子基因簇的遗传变异。该区域包含一组免疫调节细胞因子，对Th1/Th2分化可能很重要。然而，强烈的连锁不平衡的存在意味着迄今为止仅靠遗传方法还无法确定导致突变的疾病。10我们确认了IBD5加拿大的乳糜泻家族中有单倍型风险的报道。然而，英国人的关联强度较弱。在加拿大队列中，早发性乳糜泻的联系和关联证据最强，10加拿大队列诊断时的平均年龄比目前英国队列的平均年龄小4.1岁。然而，没有效果IBD5在英国队列中观察到诊断时年龄的单倍型。表型的其他差异(例如，疾病位置或行为)可能解释加拿大队列中更强的相关性，尽管这些比较无法进行，因为加拿大发表的研究没有提供这些信息。10
的作用IBD5UC的风险单倍型此前未被研究。在我们的英国队列中没有观察到相关的证据，增加了从研究中获得的CD和UC之间异质性的分子证据CARD15．
我们的基因IBD5在日本乳糜泻和健康对照的单倍型变异中，发现与高加索人群相比，这种变异极其罕见。这种差异太大了，无法用种群间细微的人口统计学和表型差异来解释。测试的两个变异来自于“高加索”乳糜泻风险单倍型的极端端，因此似乎在“高加索”单倍型背景下携带的致病变异在日本乳糜泻中没有发挥作用(尽管在知道该变异之前不能直接测试)。也有可能在携带高加索特异突变的同一基因中独立出现了其他日本特异疾病的突变。现在有必要进行一项全面的研究，以确定该区域是否存在与日本乳糜泻特别相关的变异，并评估第5q31区域的连锁不平衡的人群特异性模式。如果在日本人中发现乳糜泻相关的变异，这可能为确定高加索人致病的功能研究提供了另一种方法IBD5突变。有趣的是，普通的白种人CARD15变异在日本人和非裔美国人中也很罕见。25 -27因此，不同的基因缺陷可能导致不同种族人群的乳糜泻易感性。
上位性，或导致疾病的遗传变异之间的非加性相互作用，是在Drosophilia老鼠模型，28日,29最近在几种人类疾病中得到了证实。在IBD中，对白细胞介素10缺陷小鼠的结肠炎易感位点的全基因组搜索显示，位点之间存在复杂的互作作用。15相反，也有可能敲除、过度表达或突变参与不同途径的不同基因，从而在小鼠模型中产生类似的结肠炎表型。既然已经从人类IBD中三个独立的基因座中确定了相关的变异，就有可能评估上位性是否起主要作用，或者变异之间是否存在异质性。没有发现明显的相互作用之间CARD15变异,肿瘤坏死因子−857，以及IBD5分层TDT或对数线性分析中的单倍型。这一发现是由缺乏相互作用之间CARD15变体和IBD5在一个较小的加拿大队列中报告了单倍型，10日,24虽然只使用了分层TDT分析。此外，英国乳糜泻队列遗传异质性的直接证据是在一项主要影响和相互作用的新分析中提供的。乳糜泻和糖尿病之间有很强的相关性CARD15变异/IBD5单倍型后的条件条件可能相互作用的变种。然而，其他位点之间可能存在不同的相互作用，似乎遗传异质性和上位性可能在人类IBD中共存。事实上，在1p36和。之间已经报道了上位性的初步证据IBD1位点。30.
我们的结论是IBD5细胞因子簇风险单倍型不影响UC的易感性，在英国人群中对CD的遗传易感性的作用小于加拿大人群。我们的数据支持在人类乳糜泻的遗传易感性中存在遗传异质性和人群特异性差异。现在需要进一步的研究来解决IBD易感性基因在不同人群和不同疾病亚表型中的相对重要性。如果从其他易感位点中鉴定出相关变异，则需要重新评估IBD中上位相互作用的可能性。
致谢
我们感谢Joseph Terwilliger对异质性分析的建议。这项工作得到了英国医学研究委员会(DAvH, DPMcG, LINK拨款)、威康信托基金(LRC)、Hamanako研讨会(KN)、Oxagen有限公司和NIH EY15652拨款(LRC)的支持。我们感谢所有参与的家庭，我们的研究护士，全国克罗恩病和结肠炎协会，顾问和帮助确定家庭的全科医生。
参考文献
脚注
↵＊K Negoro和D A van Heel对这项工作做出了同样的贡献。