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摘要
背景:克罗恩病是一种异质性疾病。疾病行为特征为狭窄性、穿透性或非狭窄性非穿透性，是一种重要的临床表型，因为它与并发症和需要手术有关。最近的研究表明，克罗恩病的行为会随着疾病的发展而改变。
目的:评估克罗恩病穿透或狭窄型的快速发展与人口统计学和临床特征以及NOD2/CARD15基因型之间的关系。
患者及方法:研究了163例明确诊断为克罗恩病且诊断时患有非穿透性非狭窄性疾病的患者。在这些患者中记录了各种人口统计学和临床特征，以及抗酿酒酵母抗体状态和NOD2/CARD15基因型。根据诊断后五年疾病行为的演变，在亚组患者中比较了这些特征。
结果:诊断后5年，110例(67.5%)为非结构性非穿透性疾病，18例(11%)为狭窄性疾病，35例(21.5%)为穿透性疾病。在多变量分析中，三个亚组之间仅疾病位置和每年发作次数有显著差异(p分别为0.0009和0.0001)。疾病的回肠位置与狭窄模式相关，而大量耀斑与穿透模式相关。与非狭窄性非穿透性模式相比，主动吸烟也与穿透性模式有关。
结论:克罗恩病狭窄或穿透行为的早期发展受疾病位置、疾病的临床活动和吸烟习惯的影响，但与NOD2/CARD15基因型无关。
- 克罗恩氏病
- NOD2基因
- 瘘
- 狭窄
- 吸烟
- 疾病的行为
- 乳糜泻，克罗恩病
- ASCA，抗酿酒酵母抗体
- PCR，聚合酶链式反应
数据来自Altmetric.com
克罗恩病(CD)是一种多因子多基因疾病，以胃肠道慢性炎症为特征。1已经提出了几种诊断标准，通常依赖于临床、内窥镜、放射学或组织学标准。2 -4然而，按照定义，CD仍然是一个异构实体。该疾病可能以各种形式出现，例如取决于其位置，其倾向于发展解剖并发症，或对治疗的反应。5最近，两个独立的研究小组发现NOD2/CARD15是第一个与乳糜泻相关的基因6,7并很快得到了其他人的证实。8在NOD2/CARD15中发现了三个独立的突变(一个移码突变(1007fs)和两个错义突变(R702W和G908R))与白种人的CD有关。然而，从最近的数据来看，似乎只有25-43%的CD患者携带至少一种已确定的NOD2/CARD15突变。9 -11这些数据证实并强调了乳糜泻的异质性。在提出的乳糜泻的多种亚表型中，诊断时的年龄、位置和病理行为(包括穿透性或狭窄性病变的发展)最近被一个专家小组认为是最相关的和潜在的遗传决定的，因此被列入了新提出的乳糜泻的“维也纳分类”(表1)。12NOD2/CARD15变异最近与年轻发病有关9日,10，13日,14还有小肠的位置。9 -11日,13日,15
乳糜泻的行为与临床相关，因为它与并发症的发展和手术的需要有关。我们最近的研究表明，乳糜泻的行为会随着疾病的发展而改变。16大多数患者在诊断时表现为非狭窄性非穿透性疾病，而25年后大多数患者表现为狭窄性或穿透性疾病。这种不断变化的行为可能仍然由遗传和环境因素决定，这些因素可能会影响它的倾向和进化速度。狭窄模式与NOD2/CARD15变异之间的关联最近被提出9日,17，18但NOD2/CARD15基因型并不是一个统一的独立因素。10，13日,19唯一与乳糜泻明显相关的环境因素是主动吸烟。乳糜泻患者吸烟的频率明显高于健康对照组。20.吸烟还与更严重的疾病有关21日,22但没有其他临床或生物学特征，特别是乳糜泻行为。除吸烟外，该疾病的人口统计学和临床特征，包括所使用的治疗方法，也可能影响其行为的变化。抗酿酒酵母抗体(ASCA)是乳糜泻的主要血清学标志物。23日,24ASCA与乳糜泻的特定特征并没有明确的联系，尽管在小肠乳糜泻中有增加的患病率25，26在早期发病的疾病中，以及纤维狭窄和内穿透性疾病行为中，都提示有更高的水平。26总的来说，这些数据表明NOD2/CARD15或ASCA与疾病行为之间的关联是有缺陷的，因为对疾病行为的不同定义以及没有考虑这种行为随时间的演变。
我们工作的目的是寻找在诊断后的前五年内，根据维也纳分类定义的CD行为的演变与NOD2/CARD15基因型、吸烟习惯、ASCA以及其他各种临床和人口统计学特征之间的关联。
患者与方法
病人
根据Lennard- Jones的标准，共有163名患者被确诊为乳糜泻，2根据维也纳分类诊断为非狭窄性非穿透性疾病(B1)，12并在我们的机构(CHU Liège，倩碧圣约瑟夫Liège)定期随访进行研究。患者知情同意这项研究。这些患者构成了我们之前根据维也纳分类研究了乳糜泻特征随时间演变的人群的一部分。16对于所有这些患者，我们记录了诊断时的年龄、诊断时的位置和疾病的行为以及5年后的演变。五年后，根据维也纳分类，乳糜泻被分为:腹腔内瘘管病变或存在肛周疾病(包括脓肿、瘘管或克罗恩氏裂)的病例为B3;B2:在没有穿透性疾病的情况下存在明显的狭窄;无狭窄或穿透性病变者为B1。
患者被定义为吸烟者，如果他们每周至少吸7支烟，而非吸烟者，如果他们从未吸烟或在诊断为乳糜泻之前停止吸烟。127名患者有吸烟信息。其中三人在乳糜泻发病后已经戒烟，因此被排除在分析之外。
该疾病的家族性形式被定义为在亲属中存在炎症性肠病，无论亲代程度如何。收集这些信息，询问患者是否有患有乳糜泻或溃疡性结肠炎的亲属。如果可能的话，亲自联系亲属确认这些数据。如有疑问，也联系了负责患者的全科医生或胃肠科医生。这些信息在随访期间定期更新。
根据制造商的说明，我们在90名患者中定义了ASCA状态，这些患者的血清样本可追溯到诊断时，使用商业ELISA (Medipan diagnostics, Selchow, Germany)。确定ASCA的研究人员对这种疾病的行为是盲目的。当存在ASCA IgA或IgG时，患者被认为是ASCA+。
根据患者病历回顾性评估每年发作次数。当负责患者的医生(EL, FF, MD, JB)在记录中记录并相应地改变治疗时，就考虑到耀斑。由于患者仅为非狭窄性非穿透性疾病，这些耀斑的特征是消化和一般症状的结合，包括腹泻、腹痛、发烧、体重减轻、一般身体状况恶化或全身表现。在发生狭窄性或穿透性疾病之前，或对于未发生狭窄性或穿透性疾病的患者，计算耀斑数。然后计算每位患者每年的平均耀斑次数。医疗记录中的信息可供查阅，并被判定为126名患者的可靠信息。
类固醇疗程的数量也从患者的医疗记录中回顾性地确定。对于耀斑，计算类固醇疗程的数量，直到出现狭窄性或穿透性病变，或在疾病的前5年，患者仍未出现狭窄性或穿透性病变。然后计算每位患者每年类固醇疗程的平均值。医疗记录中的信息可供查阅，并被判定为126名患者的可靠信息。
145例患者获得了免疫抑制治疗的可靠信息。只有24名患者在发病前5年服用了硫唑嘌呤。16人在发生穿透性疾病后开始使用硫唑嘌呤。其余8例患者因类固醇依赖或慢性活动性疾病而接受硫唑嘌呤治疗。在这些患者中，计算了在发生穿透性或狭窄性疾病之前接受硫唑嘌呤治疗的月数，或对于那些仍未发生穿透性或狭窄性疾病的患者，计算了在疾病的前5年内接受硫唑嘌呤治疗的月数。
患者的人口学特征和临床特征见表2。
NOD2基因分型结果/ CARD15
在98例患者中，收集了与CD相关的NOD2/CARD15的三种主要变体(OMIM 605956)的DNA并进行了基因分型，如先前定义的那样。6在最初的报告中，突变的命名来源于IBD1的序列。该序列与Ogura及其同事描述的NOD2/CARD15的较小开放阅读框相同。7然而，Ogura也报道了另一种开放阅读框架，其特征是翻译起始位点位于小核苷酸上方的81个核苷酸等．其他人最近提出该序列作为突变注释的序列参考。8因此，为了避免混淆，我们在研究中使用了这种新的注释方法，即在突变氨基酸的初始数目上加上27，就可以很容易地从初始的注释中推导出这种注释方法。
错义突变R702W(原R675W) (SNP8, GenBank登录号G67950)采用等位基因特异性聚合酶链式反应(PCR)方法进行基因分型。扩增后(引物:5 ' -ATC TGA GAA GGC CCT GCT CC-3 '(野生型，正向)、5 ' -ATC TGA GAA GGC CCT GCT CT-3 '(突变型，正向)和5 ' - ccc ACA CTT AGC CTT GAT G-3 '(反向)，退火温度58℃，30个循环)，PCR产物加载在2%琼脂糖凝胶上，内控。由迁移谱直接推断基因型。采用pcr -限制性片段长度多态性方法对错义突变G908R (ex G881R) (SNP12, GenBank登录号G67951)进行基因分型。简而言之，PCR(引物:5 ' - cccagctcctccctcttc -3 '和5 ' - AAGTCTGTAATGTAAAGCCAC-3 '，退火温度55°C, 30个循环)后，380 bp的产物被限制性内切酶Hha1 (Gibco BRL)消化，并在2%琼脂糖凝胶上电泳。G908R突变体有两条条带(分别为138 bp和242 bp)。对于移码突变1007fs (SNP13, GenBank登录号G67955)，使用荧光标记引物(5 ' - gaatgtcagaatcagaagg -3 '和5 ' - ctcaccattgtatcttcttttc -3 '，退火温度55°C, 30个周期)的PCR产物装载在377 ABI Prism自动测序仪上。从PCR产物大小推断基因型:230 bp(野生型)和231bp (1007fs, ex 980fs)。确定NOD2/CARD15基因型的研究人员对疾病的行为一无所知。
统计分析
采用SAS 6.12软件进行统计分析。我们最初使用单因素分析来研究疾病行为演变(由诊断后5年的疾病行为确定- b1、B2或B3)与每个所述因素之间的关系，使用χ2或Kruskal-Wallis测试，根据需要。此外，对变为B3(穿透性疾病)的患者进行亚组分析:将这些患者细分为腹腔内穿透性疾病和肛周穿透性疾病。
然后采用逐步判别分析进行多变量分析。我们对83例患者进行了多变量分析，我们有完整的数据。p值<0.05被认为是显著的。
结果
疾病行为进化
经过5年的演变，110名患者(67.5%)的CD行为被分类为仍然非狭窄性非穿透性(B1)， 18名患者(11.0%)的CD行为被分类为狭窄性(B2)， 35名患者(21.5%)的CD行为被分类为穿透性(B3)。表3显示了这些亚组的人口学和临床特征，以及NOD2/CARD15基因型和ASCA状态。
乳糜泻行为演变(B1、B2或B3)与人口学、临床和生物学特征之间的关联:单变量分析
在单因素分析中，三组之间的疾病位置、每年发作次数、每年类固醇治疗次数和ASCA状态有显著差异，而吸烟和家族性形式具有显著性(表3)。NOD2/CARD15基因型(定义为变异携带者与否、野生型、简单杂合子、复合杂合子、和纯合子)和CD行为的进化(表3)。不同NOD2/CARD15变异和CD行为的进化之间没有关联。
穿透性疾病(B3)亚型的进化与人口学、临床和生物学特征之间的关联:单变量分析
当分别分析腹腔内和肛周穿透病时，发现有显著差异。各组间诊断部位差异显著，在腹腔内和肛周穿透性疾病中，L1、L2、L3和L4的比例分别为83.3%、8.3%、8.3%和0%，13.3%、40%、40%和6.7% (p=0.004)。当肛周穿透性疾病从穿透性疾病组(B3)中排除时，疾病位置与疾病行为之间的相关性仍然显著(p<0.0001)。吸烟在肛周(86.7%)明显高于腹腔内穿透病(45.5%)(p=0.03)。然而，当将肛周穿透性疾病排除在穿透性疾病组之外时，吸烟与疾病行为演变之间的关联仍然处于显著边缘(p=0.057)。腹腔内穿透病与肛周穿透病无显著性差异。至于疾病行为演变与临床、人口统计学或生物学特征之间的关联，当肛周穿透性疾病患者被排除在穿透性疾病组之外，除了疾病位置和吸烟习惯外，每年发作次数的关联也仍然显著(穿透性疾病仍然较高(p=0.001))，而其他参数没有显著关联。
疾病行为演变(B1, B2, B3)与人口学、临床和生物学特征之间的关联:多变量分析
在多变量分析中，比较三组时仅选择疾病位置和每年耀斑次数(模型中这些参数的p值分别为0.0009和0.0001;模型的p值为0.0001)。当将变为B2的患者与保持B1的患者进行比较时，仅选择疾病位置(模型p值为0.0001)。当将B3级的患者与B1级的患者进行比较时，选择了每年发作次数和吸烟次数(模型中这些参数的p值分别为0.0001和0.02;模型的p值为0.0001)。最后，当将转为B2的患者与转为B3的患者进行比较时，选择了每年发作的次数、位置和家族性疾病形式的存在(模型中这些参数的p值分别为0.0004、0.001和0.04;模型的p值为0.0001)。
讨论
我们之前的研究表明，乳糜泻的行为会随着疾病的发展而改变。16从理论上讲，遗传和环境因素都可能影响这种不断变化的行为。目前的数据表明，前五年疾病行为的演变受疾病位置、每年爆发次数和吸烟习惯的影响，但不受NOD2/CAD15基因型的影响。
乳糜泻的行为是该病的一个主要特征。穿透性和狭窄性表型与并发症的发生和需要手术有关。试图识别与这些表型相关的标记或因素的动机是需要预测这种行为，以便能够选择患者进行适当的早期管理。表型与临床、人口统计学或遗传因素之间的这种关联也有助于理解表型发展背后的机制。对疾病行为的研究因所使用的分类的可变性而受到阻碍27 -29以及评分者之间的不满意程度。30.最近，维也纳分类被提出，其目的是根据广泛接受和可重复的标准对患者进行分层。12其重现性最近已被证实是良好的。31一些作者在手术适应症的基础上提出了疾病行为在一定程度上的稳定性。27日,32岁的33在受多重影响的家庭中显著保守的行为也表明，这种行为至少部分是由基因决定的。34 -36然而，使用维也纳分类，并仔细审查个别患者的病史，我们已经证明了疾病过程中疾病行为的巨大变化。16这并不一定与以前的研究相矛盾，但表明如果不考虑疾病的持续时间，就不能分析乳糜泻的疾病行为。然而，在疾病持续一段时间后，疾病行为的某些特征可能会更加稳定甚至固定。16为了分析可能涉及疾病行为决定论的因素，我们研究了诊断时无并发症疾病(B1)的同质人群，并进行了预先确定的随访时间。我们研究了穿透性或狭窄性疾病的快速发展(5年内)，以确定强烈影响此类并发症发展的因素。
诊断后五年内与疾病行为变化独立相关的两个主要因素是疾病的回肠位置和每年发作次数。回肠位置本质上与狭窄性疾病的发展相关，当仅比较这两种表型时，回肠位置并不是穿透性疾病和非狭窄性非穿透性疾病的区分因素。然而，当穿透性疾病分为腹腔内和肛周疾病时，腹腔内穿透性疾病的回肠位置明显高于肛周穿透性疾病，并且在第一亚组中达到了与狭窄性疾病相似的频率。这种狭窄性疾病或腹腔内穿透性疾病与回肠位置之间的联系已在基于手术系列的疾病行为研究中得到描述，而与疾病持续时间无关。27日,37与狭窄性疾病相关的一种解释可能是回肠的肠管直径小于结肠，这使得功能上显著的狭窄更容易发生。另一种解释可能是回肠与结肠的免疫炎症反应性质不同，但这种差异尚未得到明确证明，尽管回肠的Peyer 's斑块数量多于结肠，可能会影响黏膜免疫炎症反应。38腹腔内穿刺性病变的发展本身可能有利于下游狭窄的一部分患者。39每年大量的疾病发作基本上与穿透性疾病(腹腔内和肛周穿透性疾病)的发展相关，当仅比较这两种表型时，并不是狭窄性和非狭窄性非穿透性疾病的区分因素。同样，这并不意外，因为穿透性疾病通常是一种临床上更具侵袭性的疾病。穿透性病变的发展可能是粘膜水平炎症反应严重程度的结果。相比之下，狭窄性疾病通常可以沉默很长一段时间，只有当狭窄发展时才表现出来。
主动吸烟在发生穿透性和狭窄性疾病的患者中更为常见。当发生穿透性疾病的患者与未发生狭窄性穿透性疾病的患者进行比较时，它与穿透性疾病的发展独立相关。吸烟与穿透性疾病之间的联系在肛周穿透性疾病中尤其明显。吸烟以前与更严重的乳糜泻有关21日,22但不是特别有穿透或肛周并发症。吸烟的影响可能与疾病严重程度和耀斑次数的影响有关。然而，在目前的研究中，这种关联是独立的。吸烟有利于穿透性病变以及更严重疾病的机制仍有待阐明。
在全球范围内，如前所述，与腹腔内或肛周穿透性疾病相关的因素是不相同的。事实上，如果一种更具侵袭性的疾病(由每年发作次数定义)似乎与两种亚型的穿透性疾病相关，那么回肠部位的情况并非如此，它主要与腹腔内穿透性疾病相关，而主动吸烟则与肛周疾病相关。这些数据表明，这两种类型的穿透性疾病的发展机制至少部分不同。此外，在我们的系列中，只有一小部分患者同时患有腹腔内和肛周穿透性疾病。因此，它们可能代表不同的实体，应该独立研究。
当发生狭窄和发生穿透性病变的患者进行比较时，独立的鉴别因素是耀斑的数量(如前面讨论的，穿透性疾病更高)和回肠位置，以及疾病的家族形式(发生狭窄性病变的患者更常见)。狭窄性疾病和家族性疾病之间的联系已经被描述过，但被认为主要与回肠位置和发病年龄早有关。40有趣的是，在我们的研究中，家族病史与狭窄行为相关，与回肠位置或发病年龄无关。
在单因素分析中，ASCA在穿透性病变患者中更为常见。ASCA与穿透表型之间的关联已经被提出。26然而，在目前的研究中，这种关联并不是独立的，这表明ASCA状态并不代表与疾病行为相关的显著标志。类固醇的使用也可以得出类似的结论，在单变量分析中与穿透行为相关，但在多变量分析后不再存在。这可能是由于与疾病行为独立相关的耀斑数量与类固醇使用之间的相关性。在治疗方面，我们发现免疫抑制治疗与疾病行为之间没有关联。然而，很少有患者接受免疫抑制治疗，这主要是因为我们研究的是诊断后5年的疾病早期阶段，因为免疫抑制治疗通常是在穿透性病变发展后开始的。免疫抑制治疗或生物治疗对疾病行为的影响应该是一个更大样本治疗患者的研究领域。
重要的是，在这项研究中，我们发现NOD2/CARD15变异与疾病行为之间没有关联。这与报道的研究结果相反。9日,10，17 -19然而，在这些先前的研究中，结果部分不一致，用于对疾病行为进行分类的标准不一致，并且没有考虑到疾病行为定义之前的疾病持续时间。还必须强调的是，最近记录的NOD2/CARD15突变与回肠位置之间的关联可能导致与狭窄行为的继发性关联。10因此，我们认为这些之前的数据是不确定的。我们的研究首次仔细分析了这一点，并进行了有效的分类，我们可以得出结论，NOD2/CARD15基因型对CD行为没有重大影响。然而，我们不能排除一个小的影响，作用缓慢，并在较长时间后对疾病行为产生影响。这应该在一个充分设计的研究中进行测试。
总之，我们已经证明，乳糜泻的回肠位置和侵袭性疾病的大量发作分别与狭窄性疾病和穿透性疾病的快速发展独立相关。吸烟习惯也与穿透行为的发展显著相关，而NOD2/CARD15基因型与疾病行为的演变无相关性。在研究乳糜病遗传标记与疾病行为之间的潜在联系时，应根据疾病位置、疾病侵袭性以及可能的吸烟习惯对患者进行分层。
致谢
E Louis是比利时FNRS的研究助理
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