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摘要
背景:先天性巨结肠病(HSCR)是一种先天性疾病，其特征是下消化道神经丛中神经节细胞的缺失。这种疾病的表现与编码肠神经系统发育的关键信号(RET和EDNRB信号通路)的基因突变有关。的Phox2b基因参与神经发生和调节受潮湿腐烂表达在小鼠，其中中断Phox2b导致了hscr样表型。
目的:调查…的贡献PHOX2B到HSCR表型。
方法:利用聚合酶链反应扩增和直接测序进行筛选PHOX2B91例HSCR患者和71例种族匹配对照的突变和多态性编码区域和内含子/外显子边界。75例HSCR患者受潮湿腐烂突变是独立考虑的。单倍型和基因型频率用标准病例对照统计进行比较。
结果:序列分析发现了三个新的多态性:两个新的单核苷酸多态性(A→G1364；→C2607)和15碱基对删除(DEL2609)。A→G差异有统计学意义1364．包括等位基因G的基因型在患者中代表性不足(19%)v36%;χ2= 9.30;p＝22%和0.0095v36%;χ2= 7.38;p＝0.024为无受潮湿腐烂突变)。配对连锁不平衡(LD)分析显示，物理上紧密的多态性之间没有LD，这表明3号外显子是重组的热点。
结论:的PHOX2B→G1364多态性与HSCR相关。它是否直接导致疾病易感性或代表LD的一个位点标记PHOX2B需要进一步调查。我们的调查结果与PHOX2B在控制肠神经元发育的信号通路中。
- 巨结肠疾病
- 遗传易感性
- PHOX2B
- 多态性
- HSCR,巨结肠病
- ENS，肠神经系统
- LD,连锁不平衡
- SNP，单核苷酸多态性
- 聚合酶链式反应
- WS4, Waardenburg综合征4型
- TCA，全结肠神经节病
- 英国石油(bp)碱基对
- EH，估计单倍型频率
来自Altmetric.com的统计
- HSCR,巨结肠病
- ENS，肠神经系统
- LD,连锁不平衡
- SNP，单核苷酸多态性
- 聚合酶链式反应
- WS4, Waardenburg综合征4型
- TCA，全结肠神经节病
- 英国石油(bp)碱基对
- EH，估计单倍型频率
巨结肠病(HSCR)被认为是一种多基因神经细胞病变，是一种先天性疾病，在下消化道的神经丛中缺少神经节细胞。新生儿期表现为胎粪排出失败，慢性严重便秘，结肠膨胀，继发性电解质紊乱，有时小肠结肠炎和肠穿孔。估计人口发病率为1/5000活产。1男性受影响的可能性是女性的3.5-4.0倍。2，3.HSCR可能发生于其他神经发育障碍，如Waardenburg综合征4型(WS4)，4它也可能与其他各种异常有关，包括染色体异常和孟德尔遗传模式综合征。大约20%的HSCR病例是家族性的，兄弟姐妹复发的风险为4%。
神经节增多症是由于肠神经系统(ENS)的紊乱，在胚胎发育期间神经节细胞不能支配下胃肠道。神经节节段的范围是可变的，并反映在疾病的严重程度。神经嵴迁移和向肠神经节分化的关键遗传信号包括编码神经营养因子及其受体的基因。大量证据表明，HSCR具有复杂的遗传病因，需要几个不相关基因的相互作用，可能还有环境因素，以产生表型。5 -11
据推测，受体酪氨酸激酶基因(受潮湿腐烂)是HSCR表型的关键。7然而,受潮湿腐烂突变仅占HSCR病例的20-30%，由于外显率低，突变缺乏基因型-表型相关性，表明除受潮湿腐烂都与这种疾病有关这导致了对可能导致HSCR的其他易感性和修饰基因的研究。有趣的是，目前鉴定的HSCR基因主要编码参与肠神经节发育的两个重要信号通路的蛋白质成员:RET和内皮素受体B (EDNBR)信号通路。这两个信号通路之间的相互作用可能会发生改变受潮湿腐烂表达式11因此是HSCR表型。7,12然而，对于几乎每一个描述的HSCR基因，也观察到HSCR表型的不完全外显和可变表达。13日,14因此，其他基因牵涉其中受潮湿腐烂表达和/或肠神经发育应被认为是HSCR的候选基因。
配对中胚层同源异构体2b基因(PHOX2B)编码一个转录因子(同源结构域蛋白)，它参与了几个去甲肾上腺素能神经元群体的发育。在小鼠中,Phox2b当肠母细胞侵入前肠间质时，表达就开始了，并在发育成肠神经元的整个过程中保持着表达。的纯合破坏Phox2b基因导致肠神经节缺失，这一特征使人联想到HSCR。此外，没有受潮湿腐烂表达Phox2b突变体胚胎。这表明监管受潮湿腐烂通过Phox2b可以解释ENS未能发展的原因。15，16
人类的PHOX2B基因已被克隆并测序。17其编码区由分配在3个外显子上的945个碱基对(bp)组成，产生314个氨基酸残基的同源结构域蛋白。18
老鼠模型的令人信服的证据使人类PHOX2B基因作为一种潜在的人类HSCR基因具有很好的探索价值。HSCR是由多个基因的突变和/或单核苷酸多态性(SNPs)单独或联合作用造成的。因此，本研究的假设是基因突变或多态PHOX2B基因可能通过直接影响HSCR表型的表达而与HSCR表型相关PHOX2B基因产品，通过连锁不平衡(LD)与未知的致病突变或多态性，或通过成为致病性存在的突变和/或多态性在其他基因。我们的数据有助于HSCR的分子解剖，并使理解遗传相互作用如何导致HSCR表型。据我们所知，这是第一个关联研究之间PHOX2B和HSCR。
材料和方法
病人和控制
本研究共纳入了91例1984 - 2001年间诊断为HSCR的华裔患者。诊断是在香港玛丽医院作出的，并基于组织学检查的活检或外科切除材料的肠丛缺失。5例患者(1例为全结肠神经节病变(TCA)， 2例为长节段神经节病变，2例为短节段神经节病变)均有亲属感染(共2个不相关家族)。86例散发型HSCR患者具有以下表型:4例TCA患者;长节段神经节增多症7例;75例为短节段神经节增多症。9例散发型HSCR患者还伴有以下相关异常:5例为唐氏综合征(短段);Waardenburg综合征1例;肾脏发育不全(短段)1例;甲状旁腺瘤1例(短段); and one with desmoid tumour (short segment). Seventy five of 91 patients had no causative mutations in the受潮湿腐烂基因(未发表的数据)。更好的评价相关性PHOX2B在HSCR中，这75例患者也进行了独立评估。因此，对HSCR患者进行相关性分析受潮湿腐烂基因突变状态及基因突变组75例受潮湿腐烂突变。
正常对照(71人)是来自香港的无血缘关系的华裔受试者，未被诊断为HSCR。
如前所述，从外周血中提取DNA。19所有患者和对照组均同意分子分析。该研究得到了当地伦理委员会的批准。
聚合酶链反应和DNA测序
采用聚合酶链式反应(PCR)对其3个编码区(包括其5 '和3 '侧翼序列)进行扩增PHOX2B．对于外显子1和2,PCR在25 μl的反应体积中进行，包含100 ng基因组DNA;四种核苷酸的混合物(每个核苷酸的最终浓度为0.2 mM);10×反应缓冲液2.5 μl;各适当底漆0.5 μM;1毫米MgCl2；1.25 U AmpliTaq黄金聚合酶(应用生物系统公司，福斯特城，加利福尼亚州，美国)。由于外显子3的GC含量高，我们使用GC- rich PCR系统(Roche Molecular Biochemicals, USA)对其进行扩增。外显子3 PCR的反应体积为25 μl，包含100 ng基因组DNA;四种核苷酸的混合物(每个核苷酸的最终浓度为0.2 mM);5× GC-RICH PCR反应缓冲液5 μl;2.5 μl 5 M GC-RICH分辨率溶液;各适当底漆0.5 μM;和1.25 U Taq DNA聚合酶和Tgo DNA聚合酶的混合物。用于扩增三个编码区域的引物，包括内含子-外显子边界PHOX2B基因序列可在GenBank中找到(登录号AB015671)。引物如下(括号内为扩增DNA大小;前向引物在每组中首先显示):外显子1:GACCTCAGACAAGGCATCTCA和AATTACCCCTCCCTGCAATC (586 bp);外显子2:CTGCCGTATGACCTGACCTT和ACAGCCACACCAAATCCAGT (442 bp);外显子3:accctaaccggtgcttct和ACAATAGCCTTGGGCCTACC (687 bp)。3个外显子的循环条件为95°C 8分钟，然后依次为95°C 1分钟，62°C 1分钟，72°C 45秒，循环35次。在35个循环结束时，最后增加了10分钟。测序之前，PCR产物进行柱纯化(Life Technologies, UK)，以去除反应缓冲液和未结合的引物，每个样品5 μl在2%琼脂糖凝胶上观察。利用染料终止循环测序试剂盒(ABI PRISM Big dye terminator v 2.0 cycle测序试剂盒;应用生物系统公司)和ABI 3100自动测序仪(应用生物系统公司)。 For those samples in which DNA sequence variation had been observed, PCR amplification from genomic DNA and sequencing using both forward and reverse primers were repeated up to five times.
统计分析
计算对照组和不相关患者中各多态性的等位基因和基因型频率。对照组和患者组的等位基因和基因型频率比较采用χ2测试。χ2还进行了测试，以确定每个多态性在每组内是否处于Hardy-Weinberg平衡。
2个或3个多态位点的基因型与HSCR疾病之间的关联水平通过χ 2和χ 2进行评估2列联表和估计单倍型频率(EH)程序。20.EH是一个用于测试和估计不同标记之间或疾病位点与标记之间的连锁不平衡的连锁效用程序。EH程序使用基因计数的方法，提供单倍型频率的最大似然估计。单倍型频率估计考虑等位基因关联/连锁不平衡(H1(H0)。EH程序还提供了对数似然，χ2，假设H下的自由度数0和H1．EH只适用于不相关的个人。为了测试病例和对照组之间的单倍型频率是否有显著差异，我们使用EH程序进行了三个单独的分析:单独对病例受试者，单独对对照组受试者，以及病例和对照组受试者的组合。得到的三个对数似然(lnL情况下, lnL控制, lnL结合)计算相关的统计检验T=[ln(Lcase) + ln(Lcontrol)−ln(Lcombined)]。这个值的两倍给出了一个近似的χ2分布的自由度(df)等于在允许等位基因关联的假设下估计的单倍型的数量。假设Hardy-Weinberg平衡的EH程序也被用来估计多态性之间的LD。
结果
多态的网站
通过直接测序整个编码区和部分5 '和3 '侧区，我们发现了两个新的snp和一个缺失PHOX2B核苷酸的位置是根据起始密码子的第一个核苷酸定义的，即指定位置+1。
中发现的多态性PHOX2B基因。这三个PHOX2B外显子用矩形表示。黑盒子表示同源域。孵化框表示聚丙氨酸延伸(从密码子162到169，从密码子245到264)。向下的箭头表示多态性的相对位置。
第一个被识别的多态性是A→G转换(称为A→G)1364)在内含子2，距离内含子/外显子边界100 bp处。我们研究了A→G的可能性1364作为的一部分PHOX2B内含子剪接调控位点。的PHOX2B内含子2序列被筛选为分支位点(附加内含子剪接信号)，但序列分析没有显示这种可能性。
第二个确定的多态性是A→C的变化(称为A→C2607的密码子253中的PHOX2B外显子3。→C2607是一个无声的转变，不改变氨基酸序列(GCA→GCC)。
第三个序列变异是一个15 bp的缺失(称为DEL)2609)在第3外显子，从密码子254开始，在A→C下游2bp处2607这个15 bp的缺失发生在C端两个多丙氨酸延伸中的一个，导致了5个丙氨酸残基(密码子254-258)的丢失。正常PHOX2B蛋白(密码子245-264)的聚丙氨酸区可能形成α-螺旋结构，并作为柔性连接子。21目前还不清楚这五种丙氨酸残基被删除的功能后果。有趣的是，在71名被研究的正常人中，有9人的某一基因缺失PHOX2B等位基因。我们排除了这种观察到的删除是一种实验人工制品的可能性。利用特异性PCR扩增酶对外显子3的GC序列含量高的部分进行解析(方法见)。此外，对缺失的样本进行5-10次重测序。
最后，在每个被分析的样本中，我们发现在第243位和第1418位都有APHOX2B基因(内含子2和3)(图1)PHOX2B(AB015671和AF117979)分别记录T和G。这些可能代表GenBank条目中的排序错误。或者，本研究分析的中国人群可能有这些snp。
除了本研究中描述的三种多态性外，还有其他三种PHOX2Bsnp记录在GenBank中。多态性ss3136952是a→C2118在2118号位置的过渡PHOX2B基因(基因内区2);多态性ss1551093是一个T→a44574457位置的横向偏移(3 '非平移区域的末端);ss1551094为C→a型多态性4517位置4517(3 '非平移区域末端)的横向偏移。这些多态性在我们的研究中没有被检查，因为它们在编码区和剪接位点之外。
患者和对照组之间的等位基因变异
为了确定这三种HSCR新多态性的意义，我们进行了病例对照关联研究，以调查它们是否与HSCR表型直接相关。患者和对照组的等位基因频率差异在任何多态性(A→G1364χ2= 2.41;p＝0.12;→C2607χ2= 1.62;p＝0.20;▽2609χ2= 1.06;p＝0.3)。此外，75例未患糖尿病的患者，两组间无统计学差异受潮湿腐烂将突变与对照组进行比较。在每一组中，两性的等位基因频率进行了比较，没有发现任何已识别的多态性在统计上的显著差异。
患者和对照组的基因型频率分布
比较患者与对照组这三种新多态性的基因型频率(表1)，发现A→G的差异有统计学意义1364(χ2= 9.30;p = 0.0095)。在75名没有基因突变的患者中也发现了这种关联受潮湿腐烂比较(χ2= 7.38;p＝0.024)。对于这种特殊的多态性，包括G的基因型在两组患者中均未充分代表:19%(91例患者)对36%(71例对照组)，22%(75例患者)对36%(71例对照组)。在每一组中，在性别之间没有发现任何已识别的多态性的基因型频率的统计显著差异。在每组中，3个多态位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态。
三个多态位点间的单倍型频率和连锁不平衡
我们还对评估HSCR疾病与涉及两个或三个多态位点的基因型之间的关联水平感兴趣。当我们用列联表比较组合A→G产生的单倍型的频率时1364+ C→2607A→G的组合1364+德尔2609两种单倍型组合患者与对照组差异有统计学意义(χ2= 12.41;p = 0.014和χ2= 9.71;分别为p = 0.04)。贡献χ2分析结果表明，多态位点A→G1364．相比之下，组合A→C的频率差异无统计学意义2607+德尔2609(χ2= 3.26;p = 0.19)。当本研究中描述的三种多态性组成的单倍型分析患者和对照组之间的频率差异时，未发现相关性(χ2= 11;6 df, p = 0.08)。同样的结果也出现在75例未确诊的患者身上受潮湿腐烂突变
使用EH程序，我们估计了三种多态性组合的单倍型频率(表2)。病例和对照组最常见的两种单倍型组合是A-A-ND和G-A-ND(等位基因名称如表1所示)。当单倍型频率进行比较时，单倍型组合在患者和对照组之间没有显示出统计学上的显著差异(表3)。我们还评估了仅包含两个多态位点的单倍型组合的频率差异。没有发现统计学上的显著差异。同样的结果也出现在75例未确诊的患者身上受潮湿腐烂突变(数据未显示)。总的来说，这些发现与使用列联表时得到的数据一致:发现的关联由A→G驱动1364．
在患者和对照组的三种多态性中发现了LD的显著证据，无论是独立分析还是联合分析。这些发现并不令人惊讶，因为这些标记在物理上非常接近。我们还评估了两个多态性之间的LD(表4)1364多态性在LD中表现为A→C2607在患者和对照组中，要么独立分析，要么联合分析。令人惊讶的是，在A→G之间没有发现LD1364和德尔2609A→C之间也没有2607和德尔2609尽管相距只有2个bp。75例患者也得到了类似的结果(数据未显示)。这些数据有力地表明，只有A→G1364多态性与HSCR疾病相关，单倍型频率分析的差异是由于不完全LD。
讨论
在本研究中，我们对整个编码区进行了测序PHOX2B基因以及内含子/外显子边界的种族匹配患者和对照，以寻找可能有助于HSCR疾病临床表现的突变或多态性。我们发现了两个新的SNPs (A→G)1364,一个C→2607)和一次删除(DEL2609)。
→C2607是一种不改变氨基酸序列的无声转变。这种多态性在没有显著等位基因或基因型频率差异的对照人群中也存在。有趣的是,▽2609尽管导致PHOX2B蛋白中5个丙氨酸残基的丢失，但与HSCR没有关联。在患者和对照组中，DEL2609总是杂合的。这一删除的功能后果目前尚不清楚。在小鼠中，杂合子的破坏Phox2b同源结构域没有明显的表型，但纯合突变体在胚胎上是致死的。在携带DEL的个体中2609，由DEL引起的任何功能后果2609多态性可由正常等位基因补偿。
对于一个→G1364，当患者与对照组比较时，我们发现基因型分布有统计学上的差异，表明A→G的相关性1364与HSCR多态性。这种关联可能是由于a→G的直接贡献1364HSCR表型或A→G1364在LD中有另一个易感位点。A→G的直接参与1364在HSCR疾病中的作用可能是通过改变内含子序列来实现的，内含子序列对剪接和/或基因表达的调控至关重要PHOX2B基因。根据我们的分支位点序列分析，A→G1364多态涉及到的可选拼接PHOX2B记录。作为独联体代理监管要素为PHOX2B基因尚未被定义，目前还不清楚A→G1364多态性可能直接影响PHOX2B基因的表达。这是有可能的PHOX2B→G1364的多态性或其他突变PHOX2B需要与RET和/或EDNRB信号通路基因中的其他突变一起发生或联合作用，以产生HSCR表型。这些信号通路的多个基因的特定变异组合可能会提供对疾病的保护或易感性，甚至改变表型。共存的受潮湿腐烂带有突变或多态的突变GDNF而且EDNRB已经描述了HSCR患者的基因。13日,14研究发现，当没有基因突变的患者受潮湿腐烂编码区检测表明A→G1364-或ld中的一个位点可以直接促进HSCR表型。然而,→G1364可能与许多多态的结合起作用受潮湿腐烂在健康人群和受影响个体中都存在的基因，或者受潮湿腐烂突变可能发生在非编码区域。基因突变分析EDNRB，EDN3,GDNF在同一组患者的基因中，目前正在研究与PHOX2B多态性。最近，加布里埃尔和他的同事22描述了两个位点- 3p21和19q12-as受潮湿腐烂受短节段神经节增多症影响的家族中的依赖修饰因子分离。的PHOX2B基因定位在4p12区域，这不是一个预测的修饰位点受潮湿腐烂在家族HSCR。本文报道的患者主要是HSCR的散发病例，其突变在受潮湿腐烂仅占病例的15%，而约50%的家族性HSCR病例是由于受潮湿腐烂突变。23然而，表型效应tPHOX2B的贡献可能取决于基因多态性和/或突变的数量、严重程度和共发性受潮湿腐烂．我们的研究为可能的贡献提供了证据PHOX2B到HSCR单独或联合作用。
A→G的表现不足1364多态性可能表示A→G的转变1364从进化的角度来看，等位基因G在种群中出现的频率相对较低。如果小等位基因G具有保护作用，那么它在群体中的频率就会上升，成为主要等位基因。24我们在三个分布超过1.2 kb的多态性中发现了LD，考虑到它们的物理距离，这是意料之中的。有趣的是，两两不平衡检验显示A→G之间缺乏LD1364而德尔2609→C之间2607而德尔2609它们之间只有两个碱基对。这表明DEL2609多态性可能处于重组的热点。对该多态性所在的3号外显子(核苷酸2290 ~ 2805)进行详细的序列检测，发现其GC含量较高，这些均为CGG重复序列，可作为重组的靶点。跨越热点的重组可以解释两两不平衡检验和单倍型分析的结果。这表明，如果有其他多态或突变在及其周围PHOX2B与HSCR有关的基因，它们应该位于A→G的上游1364多态性。这些其他可能的易感位点不会存在于具有多态(DEL2609)在定义LD块断点的重组热点中找到。25因此,▽2609在进一步的基于链接的关联测试中，多态性不应被用作标记。
由于标记逐个标记的方法忽略了HSCR疾病的多基因性质，也没有考虑易感基因之间可能的相互作用，因此研究描述的HSCR不同易感位点的snp集将是有趣的。因此，有必要收集这些候选基因中的snp的广泛目录，并将所有候选基因放在一起进行关联研究。解剖HSCR疾病的遗传病因将有助于我们了解其他多基因复杂疾病和先天性畸形，认为是多因素的起源。
致谢
我们向所有参与研究的受试者表示感谢。我们要感谢YQ Song博士对手稿的严格审查和SK Yung的宝贵技术支持。本研究由香港研究资助局(HKU 7358/00M)及美国国家人类基因组研究所(HG00008)资助。
电子数据库信息
在线孟德尔人类遗传:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/(用于HSCR [MIM 142623];RET (MIM 164761);EDNBR (MIM 121244);PHOX2B (MIM 603851);WS4 (MIM 277580);和GDNF [MIM 600837])。
下载EH软件http://linkage.rockefeller.edu/ott/linkutil.htm．
基因库:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch．html (PHOX2B基因序列登录号:AF117979;AB015671)。