条文本
PDF
摘要
背景与目的:结直肠上皮细胞易发生恶性转化。因此，鉴定从正常结肠隐窝到低级别发育不良腺瘤过程中基因表达的差异对于进一步了解早期肿瘤发生至关重要。为了实现这一目标，我们进行了一种新的基因表达分析策略，在小的组织学定义的组织样本中筛选表达的转录本。
方法:首先，使用激光介导的显微解剖分离正常和腺瘤隐窝从结肠冷冻切片。然后，采用嵌套RNA任意引物聚合酶链反应(RAP-PCR)进行差异显示，筛选mRNA群体，生成cDNA表达阵列的杂交探针。cDNA表达阵列评价后，通过免疫组化在蛋白水平上证实差异表达。
结果:对6名不同患者的正常结肠隐管与腺瘤性结肠隐管的基因表达谱进行评估后发现，总体而言，所有分析基因中高达11%的表达异常(总数n=588):具体而言，6名患者中有4名p21-rac1表达上调，6名患者中有3名有丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) p38α表达上调，6名患者中有3名干扰素γ受体表达上调。相反，6例患者中有3例发现FAST激酶下调，6例患者中有3例发现p53下调，6例患者中有3例发现血栓反应蛋白2下调。
结论:本文首次利用激光显微解剖技术结合RAP-PCR技术和cDNA表达阵列技术，展示了结肠腺瘤内异常发育区不同的基因表达谱。在这些样本中，增殖相关基因(ras-癌基因相关p21-rac1和MAPK p38α)的上调以及凋亡相关基因(FAST激酶和p53)的下调很可能反映了低级别发育不良腺瘤的特异性改变。基于p21-rac1和MAPK p38α的上调，MAPK通路的激活似乎是结肠癌发生的早期事件。
- 激光介导的显微解剖
- 基因表达模式
- 腺瘤
- 低度发育不良
- RAS / MAPK通路
- 激光介导的显微清扫术
- RAP-PCR, RNA任意引物聚合酶链反应
- MAPK，丝裂原活化蛋白激酶
- IFGR，干扰素受体
- SSC，标准柠檬酸盐
- 十二烷基硫酸钠
- AEC, 3-amino-9-ethylcarbazole
数据来自Altmetric.com
- 激光介导的显微清扫术
- RAP-PCR, RNA任意引物聚合酶链反应
- MAPK，丝裂原活化蛋白激酶
- IFGR，干扰素受体
- SSC，标准柠檬酸盐
- 十二烷基硫酸钠
- AEC, 3-amino-9-ethylcarbazole
在工业化国家，结肠癌是最常见的癌症死亡原因之一。虽然诊断和治疗在过去十年中取得了很大的进展，但仍然需要开发新的诊断系统来检测结肠癌的早期阶段。
Fearon和Vogelstein1提出了一种基于“腺瘤-癌序列”的结肠癌多步骤癌变模型。不同的关键肿瘤抑制基因以及癌基因与该模型相关。腺瘤性大肠息肉病基因失活或丢失，以及高甲基化在“腺瘤-癌序列”早期发生，随后是其他肿瘤抑制基因的顺序丢失(在结肠癌中缺失)DCC，p53)和激活细胞癌基因(k -）.1然而，我们对结肠癌发生早期的基因调控和生长调控信号转导途径的认识仍然非常有限。
因此，鉴定从正常结肠隐窝到低级别发育不良腺瘤过程中基因表达的差异对于进一步了解肿瘤发生具有重要意义。
目前，组织样本中基因表达研究的特异性大多受到混合细胞群的限制，这种细胞异质性问题一直是对正常或病变组织进行详细分子分析的重要障碍。因此，通过引入激光介导的显微解剖(LMM)，制备精确定义的显微组织样本成为可能。2 -4具有分析更具体和精确的优点。
本文提出了一种新的基因表达分析策略5结合RNA任意引物聚合酶链反应(RAP-PCR)指纹鉴别显示方法和cDNA表达阵列，鉴定和验证LMM制备的低级别发育不良腺瘤不同结肠隐窝的基因表达谱。
材料与方法
组织部分
在常规结肠镜检查中，从正常结肠活检和腺瘤性息肉中提取的新鲜组织立即被快速冷冻在液氮中。所有冷冻块存储在−80°C，直到切割。
玻璃载玻片用膜固定(PEN膜;PALM, Wolfratshausen，德国)和聚l-赖氨酸包被(0.2%聚l-赖氨酸在无菌DEPC处理H2O)在无RNase条件下。在低温恒温器中制备5 ~ 8 μm的冷冻切片，用乙醇/乙酸(20/1)在−20℃下脱水10分钟，苏木精和伊红染色。
显微解剖
LMM的执行如前所述5使用机器人微束激光显微镜(PALM)。感兴趣的组织区域被定位和切割使用聚焦脉冲激光束。通过激光压力弹射在微离心管的盖上收集解剖区。立即将获得的组织盖置于含有300 μl RLT裂解缓冲液的RNeasy旋柱纯化试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)的微移管上，混合裂解。
RNA提取
RNA采用RNeasy旋转柱纯化试剂盒(Qiagen)硅胶结合提取。为了去除剩余的基因组DNA，总RNA在提取柱内用DNase I (Qiagen)在室温下处理30分钟。按厂家说明书提取，最后用30 μl RNase游离水洗脱RNA。洗脱液被反复应用于色谱柱，并通过旋转以增加RNA的产量。5最终浓度范围为0.8 ~ 2.3 ng/μl。
Atlas cDNA表达阵列
Atlas癌症cDNA阵列(Clontech, Heidelberg, Germany)包含588个已知的癌症相关基因，用于评估不同的分子表达模式。
杂交探针的制备
通过套式RAP- PCR扩增cDNA，生成杂交探针。巢式RAP-PCR通过两步扩增进行，如前所述。5简单地说，使用10mer任意引物(OPN23 5 ' - caggggcac -3 ')与总RNA进行第一链合成的反转录。将最终体积为30 μl的RNA (2ng)与20 μl逆转录酶混合物混合，最终反应50 μl，反应中含有50 mM Tris/HCl, pH 8.3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2， 20 mM DTT, 0.2 mM dNTP, 2 μM引物，100 U MuLV逆转录酶(Promega, Madison, Wisconsin, USA)。为了排除DNA污染，在RAP-PCR实验中加入了不含逆转录酶的对照反应。反应在37°C下进行60分钟，从25°C上升到37°C，持续5分钟;在68°C下灭活15分钟。用沉淀法纯化合成的cDNA，在30 μl无核酸酶水中分离。
采用嵌套PCR策略进行第二链合成的PCR。第一步，用10mer任意引物(OPN21 5′- ACCAGGGGCA-3′)进行15次循环预扩增。将cDNA (30 μl)与20 μl PCR混合液混合，最终浓度为10 mM Tris/HCl, pH 8.3, 10 mM KCl, 4 mM MgCl2， 0.2 mM dNTPs, 4 μM引物，2.5 U AmpliTaq DNA聚合酶Stoffel片段(Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut, USA)。循环条件为94°C 30秒，35°C 30秒，72°C 60秒。
PCR产物经沉淀纯化，在30 μl无核酸酶水中分离。第一步扩增产物的样品(10 μl)与嵌套的10mer任意引物(OPN21nested 5 ' - ccaggggcac - 3 ')用于第二步扩增。反应在体积为20 μl，含10 mM Tris/HCl, pH 8.3, 10 mM KCl, 4 mM MgCl的条件下进行2、0.2 mM dNTPs(不含dATP)、4 μM引物、2.5 U AmpliTaq DNA聚合酶Stoffel片段(Perkin Elmer)和28 μCi [α-32P]dATP (3000 Ci/mmol, 2.8 μl;Amersham, Freiburg, Germany)。循环条件为35次循环，94°C 30秒，35°C 30秒，72°C 60秒。所有反应重复进行，以测试RNA指纹图谱的重现性和稳定性。
确认RAP-PCR成功后(通过凝胶电泳和放射自显影5)， PCR反应从未结合物中纯化32P标记的核苷酸和小DNA片段(<0.1 kb)，使用NucleoSpin柱(Clontech)进行柱层析，如制造商所述。
杂交
RAP-PCR产物与Atlas人cDNA表达阵列膜杂交，如最近发表的。5
洗
过滤器在1号洗涤液(2×标准柠檬酸盐(SSC)和2%十二烷基硫酸钠(SDS))中洗涤三次，每次在68°C下洗涤30分钟。两步用洗涤液2 (0.1× SSC和0.5% SDS)在68°C下洗涤20分钟，一步在2× SSC中在室温下洗涤5分钟，然后暴露在磷成像仪屏幕(Molecular Dynamics, Sunnyvale, California, USA)中大约5天。
数据分析
使用Ambis软件(ImageQuant, Molecular Dynamics)对扫描的磷成像仪屏幕进行分析，使用AtlasImage 2.0软件进行基因表达评估，该软件是专门用于分析Atlas cDNA表达阵列(Clontech)的。
微分表达式的确认
确认差异表达的第一步是在相同条件下在两个平行反应(扩增和杂交)中进行重复实验(微解剖)，只有那些在两个反应中都显示差异表达(双重或更多失调)的杂交结果才被认为是进一步感兴趣的。
第二步，采用p21-Rac1多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA)和干扰素γ受体单克隆抗体(IFGR;Santa Cruz Biotechnology)使用AEC(3-氨基-9-乙基卡唑)过氧化物酶底物试剂盒(Vector Laboratories, Burlingame, California, USA)在蛋白质水平上确认差异表达基因。剪断速冻切片(4 ~ 6 μm)，在丙酮中固定5分钟，在室温下覆盖4%脱脂干牛奶2%正常山羊血清缓冲液30分钟，以阻断非特异性结合。在pH 7.6的Tris NaCl中冲洗后，将一抗在含2%脱脂干牛奶的Tris NaCl中1:50-1:200稀释，室温下孵育45分钟。将载玻片在Tris NaCl中冲洗，并在室温下分别用二级生物素化的抗鼠和抗兔IgG抗体(Pharmingen, San Diego, California, USA)在含2%脱脂干牛奶的Tris NaCl中1:400稀释孵育30分钟。与AEC底物(Vector Laboratories)在室温下孵育30分钟。在显微镜下用水冲洗，停止显色(10至30分钟不等)。苏木素染色后，立即安装载玻片(Gel Mount, Biomeda, Foster City, California, USA)。
结果
组织学和LMM
用LMM分离6例不同患者正常和腺瘤(低级别发育不良，D1)黏膜的结肠隐窝。区分正常隐窝和腺瘤隐窝的特征分别为:隐窝大小、隐窝形状、上皮层厚度、细胞质数量、有无杯状细胞(图1)。
苏木精-伊红染色的结肠黏膜切片，正常(A, B)和腺瘤样绒毛状(C)或管状(D)结肠隐窝(低级别发育不良，D1)。箭头标记激光捕捉显微解剖的对象(B, C, D)。
cDNA阵列杂交及差异基因表达的评价
每个阵列实验揭示了大约55-120个杂交事件(在588个可能的事件中)。使用AtlasImage 2.0软件，这些事件可以与cDNA斑点进行清晰的协调。
对所有6例患者的cDNA表达阵列的评估显示，比较腺瘤和正常结肠隐窝，68个基因(588个分析基因中的11.6%)有可重复的差异表达;在所分析的588个基因中，7.7%的基因仅在6例患者中的1例中存在差异表达。其余3.9%的差异表达基因在2-4例患者中存在失调(表1)。
仅对与正常结肠隐管相比的6个发育异常中至少3个存在调控异常的基因进行了进一步检查(全部分析的588个基因中的1%，标记在表1中)。这些基因包括:p21-rac1、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) p38、IFGR、血栓反应蛋白2、p53和FAST激酶。表2列出了失调基因的表达水平。图2显示了正常结肠黏膜和腺瘤结肠黏膜表达强度的差异。
p21-rac1、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) p38a、干扰素γ受体(IFGR)、血栓反应蛋白2 (TSP2)、p53和FAST激酶的表达强度。每个符号表示一个阵列杂交的一个表达强度。所有患者都被包括在内，但表达值有很大的重叠，导致可见符号的数量较低。N，正常结肠隐窝;A，腺瘤性结肠隐窝(低级别发育不良，D1)。
阵列数据的免疫组化验证
为了进一步证实我们的阵列数据的可靠性，我们使用来自相同患者的组织对IFGR和p21-rac1蛋白进行了免疫组化分析。与cDNA阵列观察到的差异表达模式相似，正常隐窝细胞对IFGR(图3A)或p21-rac1(图3C)没有或只有很少的免疫反应性，而D1发育不良病变的隐窝细胞对这些蛋白表现出强烈的免疫反应性(图3B, D, E)。这些结果进一步支持了我们阵列数据的可靠性，并证明了IFGR和p21-rac1表达在早期腺瘤中的特定位置。
使用抗干扰素γ受体(IFGR)抗体(A, B)和抗p21-rac1抗体(C, D, E)进行免疫组化染色。(A, C)正常结肠隐窝;(B, D, E)主要为腺瘤性结肠隐窝伴低级别发育不良(D1)。黑色箭头表示阳性染色(红棕色)，白色箭头表示未染色的隐窝;阴性对照无染色。原装放大200倍。
讨论
采用LMM、RAP-PCR、6,7和cDNA表达阵列，5，8，9我们首次显示了结肠腺瘤内低级别发育不良区域的不同基因表达谱。这种策略提供了一个独特的机会，将细胞亚群的基因表达与其实际组织环境联系起来。此外，使用LMM，可以对纯和非常小的细胞群进行遗传分析，并且可以最大限度地减少与体内和体外研究相关的限制。
当我们分析6例个体患者时，正常与低级别发育不良腺瘤(D1)的基因表达有明显变化。在低级别发育不良腺瘤中，增殖相关基因(ras-癌基因相关p21-rac1和MAPK p38α)在mRNA水平上表达上调，凋亡相关基因(FAST激酶和p53)在mRNA水平上表达下调。
然而，血栓反应蛋白2的表达通常通过调节血管生成与肿瘤防御有关，10在低级别发育不良病变中被发现下调。这种下调也可能与腺瘤/肿瘤的发展有关。
被认为在结肠肿瘤发生中被激活的通路之一是RAS/MAPK通路，它在调节增殖和转录中起着重要作用。在MAPK信号级联的末尾，转录因子如ATF2, c-Jun, c-Fos, CHOP/GADD153, Max或MEF2的激活11是至关重要的。该信号级联中的不同基因在低级别发育不良腺瘤中被上调:p21-rac1(见表2和图2)，MAPK p38α(见表2和图2)，rho-GDP解解抑制剂2(见表3，在2/6例患者中上调)，p21活化激酶α和MAPK 6(数据未显示，均在1/6例患者中上调)。
p21-rac1是小GTP结合蛋白RAS超家族的成员，可以激活JNK、SAPK或MAPK p38等蛋白激酶。MAPK p38α是不同转录因子的激活因子。11
基于p21-rac1和MAPK p38α在低级别发育不良腺瘤中的上调，MAPK通路的激活似乎是结肠癌发生的早期事件。Wang和同事认为，这种激活似乎是低级别发育不良病变的特征12已经表明MAPK p38, ERK1, ERK2和JNK都是MAPK通路的成员，在结肠癌发生的晚期出现的癌症中下调。
本研究结果也为激光显微解剖在结肠癌组织分子分析中的更广泛应用提供了基础。我们认为，对低级别发育不良腺瘤的检查不仅揭示了确定结肠癌的初步步骤，而且很可能有助于识别快速发展为恶性肿瘤的高危患者亚组。此外，对这些初始步骤的理解也可能为疾病更晚期阶段的治疗策略提供理论依据——例如，在宏观上不可见的癌前病变(例如异常隐窝病灶)中已经发生严重的基因失调，导致局部或远处转移风险高的结肠手术后开发特定药物。
我们已经证明，RAP-PCR和cDNA表达阵列与LMM的结合为深入了解结肠癌发生的早期分子事件提供了可能。我们的研究结果表明p21-rac1和MAPK p38是有趣的候选基因，可能参与导致结肠隐窝恶性转化的关键机制。
致谢
作者希望感谢Olga Wiesner, Wibke Ballhorn和Elena Neumann提供的出色技术支持。本研究由Deutsche Forschungsgemeinschaft (Ku 1024/6-3, Mu 1383/1-3和Mu 1383/3-3)资助。