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摘要
背景:的受潮湿腐烂基因编码一种酪氨酸激酶受体，参与不同的人类神经病变，如特定的神经内分泌肿瘤和巨结肠病(HSCR)。基因表达受发育调控受潮湿腐烂大多数成年细胞，包括淋巴细胞，都检测不到转录本。不可能进行功能研究受潮湿腐烂迄今为止，mRNA限制了在HSCR病例中传统DNA基因组筛查无法识别的基因异常比例的检测和表征。
目的:开发一种适合激活的协议受潮湿腐烂表达受潮湿腐烂阴性细胞株，因此需要直接调查受潮湿腐烂mRNA，将传统的基因突变分析扩展到检测剪接异常和表达受损受潮湿腐烂基因。
方法:组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠(NaB)对抢救的影响受潮湿腐烂通过一轮逆转录-聚合酶链式反应，从HSCR患者和对照组接受治疗的淋巴母细胞的总RNA中检测表达。
结果:分析受潮湿腐烂经NaB处理后可表达受潮湿腐烂阴性细胞，如淋巴母细胞。这种治疗使我们能够检测到受损受潮湿腐烂两名先前被认为没有任何基因异常的HSCR患者出现了基因表达和剪接缺陷。
结论:在大多数无法解释的高可控性国家案件中充分应用所提议的协议将使我们能够确定的确切作用受潮湿腐烂不仅是HSCR发病的诱因，而且是发病的易感因素。
- 巨结肠疾病
- 受潮湿腐烂原癌基因
- 丁酸钠
- 分子筛选
- 表达的缺陷
- 自动取款机,ataxia-telangiectasia突变
- DHPLC，变性高效液相色谱
- G3PDH，葡萄糖3-磷酸脱氢酶
- HSCR、巨结肠疾病
- 男性，多发性内分泌肿瘤
- NaB,丁酸钠
- NF1，神经纤维瘤病1型
- RET，在转染过程中重排
- 逆转录聚合酶链反应
- SNP，单核苷酸多态性
- SSCP，单链构象多态性
来自Altmetric.com的统计
- 自动取款机,ataxia-telangiectasia突变
- DHPLC，变性高效液相色谱
- G3PDH，葡萄糖3-磷酸脱氢酶
- HSCR、巨结肠疾病
- 男性，多发性内分泌肿瘤
- NaB,丁酸钠
- NF1，神经纤维瘤病1型
- RET，在转染过程中重排
- 逆转录聚合酶链反应
- SNP，单核苷酸多态性
- SSCP，单链构象多态性
的受潮湿腐烂原癌基因(转染过程中重排)编码一种酪氨酸激酶受体，主要表达在神经嵴发育过程中，并参与不同的人类神经病变。1生殖系受潮湿腐烂突变已被发现与两种遗传癌症综合征相关，包括多发性内分泌瘤2A型(MEN2A)、2B型(MEN2B)和家族性甲状腺髓样癌，以及巨结肠病(HSCR)，一种发育障碍，特征为远端消化道可变长度的肠神经元缺失。2功能丧失，渗透率低受潮湿腐烂只有10-40%的HSCR病例中发现了突变，而一小部分患者(5-10%)显示出其他基因的改变，这些基因通常与神经嵴细胞的发育程序有关。3.4通过使用sibpair分析，最近的一项研究确认了3个HSCR易感位点3p21, 10q11和19q12，这可能澄清了大部分无法解释的HSCR病例的分子基础。510q11的位点可能对应于受潮湿腐烂证实了该基因在HSCR发病机制中发挥的核心作用。考虑到持续失败的检测受潮湿腐烂编码序列突变的比例家族病例被发现与基因有关，最近有人认为，在某些情况下，在内含子和启动子区域的遗传缺陷可能有助于HSCR表型。5 -7
此外，还有几种常见的多态性受潮湿腐烂原癌基因与HSCR发展的可变风险相关。特别是在不同的人群中受潮湿腐烂与对照组相比，HSCR患者中单核苷酸多态性(SNP)等位基因的出现频率不同，8，9而特定的单倍型已被证明显示保护或易感作用，和/或调节结果表型的严重程度。10日,11
到目前为止,没有受潮湿腐烂SNP等位基因已被证实对Ret功能有影响;另一方面，负责诱发或保护作用的功能变异则具体表现为受潮湿腐烂单倍型，以及期望与它们连锁不平衡的单倍型，尚未被鉴定出来。后一种变异可能表现为调节区域的遗传缺陷，通过降低正确和活性Ret受体的表达水平，促进HSCR的发生。
可惜，搜索非编码受潮湿腐烂与HSCR疾病相关的突变受到以下因素的抑制:(i)基因的大小(52.4 kb);(ii)内含子较大(内含子1跨度超过20 kb);(iii) DNA重复的丰度;(iv)缺乏突变热点。正如已经证明的其他基因如ATM(共济失调-毛细血管扩张突变)和NF1(神经纤维瘤病1型)，12日,13直接研究剪接和表达将非常有用的发现未发现受潮湿腐烂分子的缺陷。目前，由于在包括外周血淋巴细胞在内的大部分成人组织中都检测不到转录本，因此不可能进行这样的研究。14日,15的确，众所周知受潮湿腐烂表达主要局限于胚胎发生的特定阶段，该基因在胚胎神经外胚层和发育中的泌尿生殖系统的组织中转录。16日,17
在过去的几年中，我们和其他学者已经开始研究受潮湿腐烂通过使用从非法转录中获得的RNA和嵌套的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)进行剪接突变(同义突变或剪接位点改变)。18岁20.事实上，在永生化的淋巴母细胞中，有极少量的受潮湿腐烂经过两轮PCR(共70个循环)可检测到产物。21然而，不合理的转录不能反映生理基因的表达，使用它会产生假阳性产物。这些考虑迫使我们确认RT-PCR与迷你基因构建的结果，克隆基因组片段受潮湿腐烂表达载体pSPL3中的基因。18岁20.不幸的是，这种费时和昂贵的方法不能轻易用于快速筛查受潮湿腐烂剪接异常或评估缺陷的等位基因表达。
在之前的一篇报道中，我们证实了组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠(NaB)上调受潮湿腐烂转录的受潮湿腐烂积极的细胞系。22特别是NaB治疗增加受潮湿腐烂在IMR32细胞的转录中，已经显示出低水平的mRNA，而对MTC-TT细胞没有影响，其特征是一个平台水平的受潮湿腐烂信使rna。22因此，我们还证明NaB处理增加了内源性的受潮湿腐烂组蛋白乙酰化(通常与转录活性染色质相关)在IMR32细胞中，但在MTC-TT细胞中没有。这些数据有力地表明NaB治疗模拟了一种生理调节机制受潮湿腐烂基因。
在目前的研究中，我们表明NaB也刺激了两个可检测水平的转录受潮湿腐烂阴性细胞系，SK-N-MC和淋巴母细胞。从这样的观察开始，我们发展了一种原始的方法来研究HSCR的分子基础，并对其进行功能测试受潮湿腐烂从容易获得的细胞来源中提取的mRNA，通常用于基因组DNA提取，如淋巴细胞或淋巴母细胞。对无法解释的HSCR病例(仍然占所有病例的大多数)充分应用拟议的NaB治疗方案将使我们能够确定的确切作用受潮湿腐烂在HSCR的发病机制中
方法
细胞和NaB治疗
来自HSCR患者和对照组的人成神经细胞瘤细胞系SK-N-MC和淋巴母细胞在RPMI培养基中培养(Hyclone Laboratories, Logan, Utah, USA)，添加10%的胎牛血清(Gibco BRL, Life Technologies Italia Srl, Milano, Italy)， 2mml-谷氨酰胺，100u /ml青霉素，100mg /ml链霉素。NaB (B 5887;Sigma-Aldrich Srl，米兰，意大利)溶解在水(1 M原液)中，并以5 mM的最终浓度交付给细胞。处理过夜。第二天，细胞被注入新鲜培养基，NaB再被注入一晚。RNA提取使用市售TRIzol (Gibco BRL)进行。
RNA分析
从500 ng总RNA中制备随机六聚体引物cDNA。人类的管家G3PDH用正向引物5 ' - tgaaggtcggagtcaacggatttggt -3 '和反向引物5 ' - GCAGAGATGATGACCCTTTTGGCTC-3 '扩增葡萄糖3-磷酸脱氢酶基因。人类的受潮湿腐烂用IP18F引物5 ' - ggatttcggcttgtcccgag -3 '和IP20R引物5 ' - CCATGTGGAAGGGAGGGCTC-3 '扩增基因。
我们分析了8个个体(包括HSCR患者和对照组)经NaB处理的淋巴母细胞的RNA。个体1-4携带不同的外显子14基因型。随机六聚体引物总cDNA (3 μl)和200 ng基因组DNA与外显子引物14F(5’-CTCCTCATCGTGGAGTACGC-3’)和14R(5’-CTCGGCCAGATACTGCATCC-3’)进行PCR反应(38个循环)。如前所述，进行了限制性内切酶和单链构象多态性(SSCP)分析。11，235号个体为正常对照，6号个体为携带内含子突变IVS12+19 C>T的HSCR患者。从NaB诱导的后两个个体的淋巴母细胞RNA中进行RT-PCR，如前所述。20.
属于以下报告的家庭的个体使用基因内多态性分型受潮湿腐烂外显子2、13和19，正如Griseri和他的同事所描述的。11，23个体7(对照组)和个体8 (HSCR患者)均为外显子13的2307T>G SNP杂合子。RT-PCR从总cDNA中提取引物4F (5 ' -GAAAAGTGGTCAAGGCAA-3 ')和18R (5 ' -GAATCTTCATCTTCCGCCC-3 ')(38个循环)，产物用TaqI验证转录本中两个等位基因的存在。
结果
NaB治疗:挽救基因表达受潮湿腐烂消极的细胞
受潮湿腐烂用NaB处理RET阳性细胞系获得的上调迫使我们也测试RET阴性细胞，如淋巴母细胞和成神经细胞瘤SK-N-MC细胞，以寻找NaB依赖的基因表达。
如图1所示，在未处理细胞的总RNA中，与之前的数据一致，24日,25受潮湿腐烂而在NaB处理的细胞系中，无论是淋巴母细胞还是成神经细胞瘤细胞，我们都无法检测到表达受潮湿腐烂单轮PCR后的转录产物。
的出现受潮湿腐烂记录在受潮湿腐烂丁酸钠(NaB)处理后的mRNA阴性细胞。单轮测试后得到的结果受潮湿腐烂从未处理(UN)和NaB处理的SK-N-MC和淋巴母细胞培养物中获得的总RNA的反转录稀释样本进行扩增(38个周期)。葡萄糖3-磷酸脱氢酶(G3PDH)表达作为内标，负号为空白对照。
的比较受潮湿腐烂基因组DNA与NaB诱导cDNA的分析
作为NaB治疗在淋巴母细胞中的首次应用，我们评估了是否受潮湿腐烂cDNA分析可以重现基因组DNA的结果。在图2A中，我们报告了该基因14号外显子内切酶的迁移模式受潮湿腐烂基因2508C>T (S836S)，来自普通T变异(个体1)和CC对照(个体2)的杂合子的cDNA和基因组DNA受潮湿腐烂另外两个个体，一个正常对照(4号个体)和一个HSCR患者(3号个体)的cDNA和基因组DNA外显子14。在4号个体中，只有野生型等位基因存在，而3号个体携带2436C>T错义突变(R813W)，之前在一个不相关的HSCR患者中描述过。18在所有这些样本中，基因组DNA PCR产物的数量和迁移模式都与从NaB诱导的cDNA中获得的产物相当。这一结果为发展一种快速的初级筛选受潮湿腐烂整个cDNA被用作传统突变检测方法的直接底物，如变性高效液相色谱法(DHPLC)、SSCP等。
巨结肠病(HSCR)患者和对照组RNA分析。来自6个个体的淋巴母细胞用于cDNA合成和转录本分析。(A)限制分析受潮湿腐烂基因组DNA和cDNA的外显子14。258c >T多态变异1号个体为杂合型，2号个体仅存在野生型等位基因。(B)比较携带2436C>T突变的个体(个体3)和野生型对照(个体4)的单链构象多态性谱。intronic (C)受潮湿腐烂突变IVS12+19C>T从两个RNA来源进行分析。在前两个通道中，cDNA从携带野生型(N)和突变(M)等位基因的pSPL3结构转染的COS7细胞中获得。20.第5道和第6道是来自丁酸钠处理过的细胞的逆转录聚合酶链反应样本，分别来自一个对照组(5号个体)和携带剪接变体的患者(6号个体)。图中显示了正确处理的和异常的转录本。与异质双工产物相对应的另一个频带出现在最后通道中。
检测受潮湿腐烂HSCR患者异常剪接
确定NaB治疗是否可以有效检测受潮湿腐烂我们对携带内含子的HSCR患者的总RNA进行了RT-PCR分析受潮湿腐烂IVS12+19C>T突变，已经被证明会导致RNA处理异常。20.我们之前通过使用迷你基因构建证明，这样的内含子突变引入了一个新的剪接供体位点，在RNA剪接过程中被识别并积极使用，导致了一个包含17个额外核苷酸的替代转录本，该转录本位于内含子12的5 '端。在目前的工作中，我们评估了NaB处理的淋巴母细胞是否能够保持之前在体外证实的相同的选择性剪接模式。如图2C所示，患者和对照组的cDNA样本中都出现了一个预期的187 bp片段，对应于正常拼接的转录本，而只在HSCR个体中检测到一个204 bp的更大的产物，对应于异常拼接的转录本，与使用迷你基因构建获得的拼接模式一致(见图2C的注释)。这一结果表明，我们的方法可以用于未知的初级筛选受潮湿腐烂剪接异常，标准基因组分析检测不到。
杂合子性的丧失受潮湿腐烂家族性HSCR病的cDNA研究
在HSCR疾病,受潮湿腐烂编码突变仅占病例的一小部分，提示非编码变异的存在受潮湿腐烂基因和/或其他遗传风险因素。5
为了识别受潮湿腐烂否则无法检测到的表达缺陷，我们对患有家族型先天性巨结肠的HSCR患者的淋巴母细胞样细胞进行了NaB治疗。此前的连锁分析表明，本病表型复发与本科密切相关受潮湿腐烂基因标记(图3)。26然而，对所有21个外显子和内含子连接的筛选没有显示出任何类型的突变。调查可能存在的受潮湿腐烂我们对沿着整个基因分布的三个snp的基因组DNA进行了特征分析。然而，SNPs 2、13和19先证者的杂合状态排除了涉及这些多态位点的基因组缺失的存在。来自先证者和对照个体的淋巴母细胞，均为已知外显子13 (2307G>T)多态性杂合子，用NaB治疗。RT- PCR产物的内切酶消化用于识别RNA中的两个等位基因:G>T的横转消除了Taq1识别位点导致396 bp的变异片段。如图3所示，从对照样本(个体7)中获得的转录本中存在变异等位基因和正常等位基因(396 bp+295 bp+101 bp)消化所预期的不同产物，而在患者(个体8)中只观察到与正常等位基因(295 bp+101 bp)对应的条带。这些数据清楚地表明其中一个表达缺失受潮湿腐烂等位基因，它与谱系中的疾病分离，并证实了非编码突变可以显著促进的假设受潮湿腐烂与HSCR的发病机制密切相关。
讨论
组蛋白乙酰化是一种通过改变转录因子对DNA的可及性来调节基因表达的重要机制。从非活性染色质到活性染色质的转换通常伴随着基因调控区域关键位点的组蛋白高乙酰化。27在之前的一篇论文中，我们证明了组蛋白去乙酰化酶抑制剂NaB增加受潮湿腐烂在mRNA水平较低的细胞中转录，而在mRNA水平较高的细胞中没有效果。22此外，我们确定了两个受潮湿腐烂对NaB处理敏感的上游区域，SOX10/Pax3增强子和最小启动子，支持乙酰化的观点受潮湿腐烂组蛋白是一种重要的生理调节机制受潮湿腐烂转录。22在这里，我们已经表明NaB处理诱导的外观受潮湿腐烂RET阴性细胞，如淋巴母细胞和SK-N-MC细胞系的转录。从这样的观察开始，我们发展了一种新的和有用的方法来分析受潮湿腐烂转录的产品。特别是，我们已经证明，经过NaB治疗后，受潮湿腐烂cDNA可以直接通过酶切法(通常用于分型)进行分析受潮湿腐烂多态性)或SSCP分析(一种常用的研究方法受潮湿腐烂突变)。事实上，我们发现NaB处理后获得的RT-PCR产物与基因组DNA PCR产物具有相似的强度和迁移模式。这些数据清楚地表明了这一点受潮湿腐烂通常用于基因组DNA分析(SSCP, DHPLC，测序和其他)的分析现在也可以应用于全长cDNA。
剪接改变被认为占所有基因缺陷的15%，但当它们位于远离剪接规范位点时很少被检测到。28由于这个原因，人们普遍认为基因突变分析也应该包括内含子，这种方法只适用于以内含子区域数量和大小减少为特征的少数基因。基因转录本分析是检测剪接突变影响的一种有用的替代方法，正如在正常表达于淋巴母细胞(如ATM和NF)的基因中显示的大量异常所表明的那样。12日,13本初步研究的另一项重要成果是证明NaB治疗可以直接检测受潮湿腐烂从HSCR患者的淋巴母细胞mRNA中获得的异常转录本，其本身没有诱导异常剪接，如图2B所示。来自HSCR患者和对照组的淋巴母细胞均接受NaB治疗，但只有携带IVS12+19C>T突变的患者出现异常剪接产物。这些数据证实了我们的方法可以作为剪接突变的快速初步筛选，前提是经过NaB处理的淋巴母细胞获得阳性结果后进行特定的基因组分析，以避免出现假阳性的可能性，例如，来自组织特异性剪接模式的假阳性。
NaB治疗的效力，加上它似乎可以复制转录的生理机制，这一事实说服我们采用基于NaB的方法来研究可能性受潮湿腐烂表达的缺陷。
正如假设的那样，我们证明了缺陷受潮湿腐烂在家族性HSCR病例中，该基因编码区没有突变。在cDNA中观察到的杂合子性的损失可能是由一个尚未确定的缺陷造成的受潮湿腐烂转录调控区(启动子和5 '区)和/或转录后控制(剪接缺陷或等位基因特异性的不稳定受潮湿腐烂mRNA)，两者都损害正确受潮湿腐烂表达式。目前正在调查导致这种效应的功能变异的特征。这一结果与非编码的假设是一致的受潮湿腐烂差异被低估了，这可以解释与之相关的hsr家族比例之间的差异受潮湿腐烂(88%)和已识别突变的比例(<40%)。5因此NaB处理可以检测到广泛的受潮湿腐烂这些缺陷我们无法通过标准的基因组分析来识别。
作为进一步有用的应用，NaB治疗可用于研究可能涉及HSCR易感性的其他元素，如潜在的功能影响受潮湿腐烂多态变异和RET9和RET51两个末端亚型的数量。10日,11，29日,30.事实上，所提出的NaB治疗方案的全面应用可能允许分离snp可能的功能贡献，如基因第2外显子中的135G>A或新发现的受潮湿腐烂启动子。9，11此外，RET9和RET51亚型的表达模式，最近被证实具有不同的生物学和信号特性，可能与HSCR疾病的发展和相关病理如MEN2A和MEN2B的发展有关。29日,30.
总之，我们观察到NaB治疗激活受潮湿腐烂在培养细胞中的表达是一种新的强有力的工具来检测相对数量和质量受潮湿腐烂转录在容易获得的细胞来源，如淋巴细胞或淋巴母细胞。对无法解释的HSCR病例(仍然占所有病例的大多数)充分应用拟议的NaB治疗方案和其他受潮湿腐烂相关的病理将允许建立精确的作用受潮湿腐烂原癌基因在其发育过程中起作用。
致谢
我们感谢L Velo夫人提供的秘书协助，感谢B Pesce、F Lantieri和G Santamaria提供的技术支持。P Griseri, G patone和F Puppo获得了由意大利癌症基金会(FIRC)颁发的奖学金。感谢意大利电视广播公司(授权号为E791)、欧洲共同体(合同号为QLG1-2001-01646)和热那亚大学cebr卓越中心的财政支持。
参考文献
脚注
↵＊P Griseri和G patone对这项工作做出了同样的贡献。