条文本
PDF
摘要
背景与目的:我们验证了囊性纤维化跨膜调节基因突变的实际或预测后果与胰腺表型和定量外分泌胰腺功能相关的假设。
方法:我们评估了742例有基因型和临床资料的囊性纤维化患者。诊断时，610例胰腺功能不全，110例胰腺功能不全，22例胰腺功能充分患者诊断后发展为胰腺功能不全。
结果:我们在633例患者(85.3%)中发现双等位基因突变，在95例患者(12.8%)中发现单等位基因突变，在14例患者(1.9%)中发现双等位基因突变。鉴定出76种不同的突变。变异最多的是ΔF508(71.3%)，其次是G551D(2.9%)、G542X(2.3%)、621+1G→T(1.2%)、W1282X(1.2%)。根据每种突变的预测功能后果，将患者分为五类。超过95%的病人严重的I、II和III类突变为胰腺功能不全或发展为胰腺功能不全。相比之下，病人温和的IV类和V类突变在胰腺中持续充足。除4例外，所有病例的基因型都与胰腺表型完全相关。93例患者有腺泡和导管分泌的定量数据。与IV或V类突变患者相比，I、II和III类突变患者腺泡和导管功能明显降低。
结论:特定突变等位基因的预测或已知功能后果与囊性纤维化中胰腺疾病的严重程度相关。
- 囊性纤维化
- 囊性纤维化跨膜调节剂
- 胰腺功能不全
- 胰腺
- CF，囊性纤维化
- CFTR，囊性纤维化跨膜调节剂
- PI，胰腺功能不全
- PS，胰腺功能充足
数据来自Altmetric.com
囊性纤维化(CF)影响多个器官，包括胰腺、肠道、汗腺和呼吸道。囊性纤维化基因鉴定1 -3.导致其蛋白产物，囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)的阐明，一个cAMP调节氯通道。4基因突变雌性生殖道基因导致上皮细胞顶端CFTR氯通道功能缺失或缺陷。最常见的致病突变(占全球CF染色体的66-70%)导致CFTR产品508位(ΔF508)的一个氨基酸苯丙氨酸缺失。2超过1000个额外的突变(http / / www.genet.sickkids.on.ca雌性生殖道/ mutations.html)或假定的基因突变雌性生殖道基因已鉴定，均为不常见或罕见。
患有CF的婴儿有进行性胰腺损伤，导致胰腺功能不全(PI)导致消化不良的体征和症状。然而，10-15%的患者保留了足够的胰腺储备，无需酶治疗即可正常消化。5，6一般来说，那些具有“胰足”(PS)表型的患者的疾病表现不太严重。6我们之前已经证明，外分泌胰腺的表型和基因型之间有很强的临床相关性。7，8通过研究CF的临床表型，然后对基因型进行假设，初步研究CF的表型-基因型关系。例如，研究人员注意到R117H存在于PS患者中，因此假设这是一种轻度突变。9从这些研究中可以确定，大多数PI患者都有两个严重的雌性生殖道而具有PS表型的人只有一到两个突变温和的突变。然而，这种相关性是有限的，因为它不是基于特定突变的分子机制。在本研究中，我们试图通过分类来克服这一限制雌性生殖道基于其功能后果的突变，然后评估与胰腺表型的关系。
雌性生殖道基因突变可以根据其对CFTR介导的阴离子分泌的预测影响进行分类。9 -11在一个五类系统中，属于I、II和III类的突变被预测会通过不同的分子机制对CFTR功能产生严重的功能后果。IV类和V类突变则被认为具有CFTR介导的通道功能，并具有较温和的后果。
我们假设CFTR基因突变的分子后果与CF患者的外分泌胰腺表型相关。本分析的目的是从基本分子机制出发，然后评估与临床表型的联系，验证先前对表型-基因型关系的研究。在本报告中，我们提出了描述基因突变的预测结果之间关系的独特数据雌性生殖道CF患者的基因和定量外分泌胰腺疾病。
方法
病人确定
我们评估了所有在多伦多诊所接受基因型分析的CF患者。CF的诊断是基于1998年的共识会议标准。12每个病人的临床资料和基因型都被记录在计算机数据库中。定义每位患者在诊断时的胰腺状态(PS或PI)以及随后的胰腺状态变化(PS→PI)。选择接受胰腺刺激试验的患者进一步分析外分泌胰腺功能与基因型之间的关系。这项研究得到了机构伦理审查委员会的批准。
外分泌胰腺功能评估
用以下一种或多种方法评估胰腺功能。
粪便脂肪
将收集的3 - 5天的粪便储存在4°C下，采用van de Kamer和Weyers方法测定粪便脂肪含量13或者用Jeejeebhoy和Kozak的方法。14通过称重食物摄入量并参考标准食物含量表计算粪便脂肪损失，以平均每日脂肪摄入量的百分比表示。PI定义为6个月以上患者的粪便脂肪损失超过测量脂肪摄入量的7%，或6个月以下婴儿的粪便脂肪损失超过15%。15
血清阳离子胰蛋白酶原
如前所述，这种放射免疫分析试验可靠地区分了七岁后PS患者和PI患者。16伴有CF的PS患者表现出在正常范围内或高于正常范围的广泛波动值。患有小儿麻痹症的婴儿血清胰蛋白酶原水平高，到7岁时下降到低水平或无法检测到的水平。诊断时为PS但进展为PI (PS→PI)的患者血清胰蛋白酶原水平进行性但迟发性下降。17PS患者每6-12个月检测一次。如果血清胰蛋白酶原值下降，或临床症状提示胰腺功能衰竭，则进行验证性研究(脂肪平衡和/或胰腺刺激试验)。
定量胰腺刺激试验
患者采用标记灌注技术进行评估。18酶(脂肪酶，总脂肪酶和胰蛋白酶)，18和流体19和电解质(Cl−Na+, HCO3−）20.在校正注入标记物的部分恢复后，输出以每公斤体重/小时表示。如果脂肪酶产量低于120 u/kg体重/小时或胰蛋白酶产量低于50 u/kg体重/小时，则将患者定义为PI。如果执行了多次测试，则使用最近测试的结果。
基因型分析
用标准方法从外周血细胞中提取的人类总基因组DNA进行基因型分析。的每个外显子雌性生殖道基因经聚合酶链反应扩增，SSCP和MDE凝胶分析筛选。21直接测序分析被用来描述一个疑似突变的DNA序列。基于回顾性数据，该方法能够检测95%以上的已知CFTR基因突变。这一检出率不包括患有罕见的未知突变或可能位于CFTR基因边界之外的突变(即在调节元件中)的患者。
基因型分类
基因型根据其已知或预测的功能结果进行分类。9 -11除了ΔF508纯合子的患者外，大多数患者是复合杂合子，突变属于一个以上的类别。我们在ΔF508后台使用了第二个突变的函数类。该方法用于评估携带一个ΔF508突变的患者的第二个突变的影响。例如，携带I类突变(例如G542X)并结合ΔF508 (II类)的患者被归类为I类，尽管该基因型实际上是I/II类的复合杂合子。由于IV或V类突变具有显性影响，因此根据显性突变的假定后果对具有这些突变的患者进行分类。
统计分析
患者特征以平均(SD)表示，组间比较使用学生的t测试;χ2测试被用来比较比例。定量胰腺刺激试验的结果产生了几个测量值，在待比较的亚组中分布偏斜，方差估计不相等。因此，Kruskal-Wallis秩和检验22用于检测胰腺分泌测量的亚组差异。
结果
病人
我们评估了742例在1990年至1997年间被确诊为CF的患者(表1)。在诊断时，610例(82.2%)为PI, 110例(14.8%)仍为PS。在诊断时为PS的22例患者在随访时变为PI (PS→PI)。如前所述，6，7PS组患者确诊年龄较晚，平均汗液氯化物值较低，肺功能较好，营养状况较好，死亡率较PI组低。PI组与PS→PI组在汗氯、1秒用力呼气量、身高体重、诊断年龄等方面差异无统计学意义。
基因型分析
雌性生殖道633例患者(85.3%)在两个等位基因上都发现了基因突变，只有95例患者(12.8%)在一个等位基因上发现了基因突变。在仅发现一个突变的组中，40人在诊断时为PS。没有雌性生殖道14例(1.9%)患者在任何一个等位基因上均发现了基因突变，其中7例诊断时为PS。七十六个不同的雌性生殖道在662个家族的1324条染色体中鉴定出基因突变(表2)，最常见的突变为:ΔF508(943条染色体，71.2%)、G551D(39,2.9%)、G542X(31,2.3%)、621+1G→T、W1282X(16,1.2%)和R117H(11,0.8%)。不太常见的突变包括G85E和5T (n=5条染色体)，A455E和R1162X (n=4条染色体)，R347, Y1092X, R334W和V520F (n=3条染色体)。在46条CF染色体中发现了在其他被测家族中不存在的突变，在116条CF染色体中未检测到突变。
对633例具有两种已确定的CFTR基因突变的患者的分析证实了我们先前记录的胰腺表型与疾病之间的相关性严重的而且温和的基因型,8，10并提供了有关最近确定的基因突变的表型效应的进一步信息。如前所述，突变分为轻度或重度。7几乎没有例外，有两个严重的突变赋予PI和1温和的突变等位基因以显性方式授予PS。在569名携带两种病毒的患者中严重的其中546例(96.0%)为PI，而至少有一种轻微突变的61/62例(98%)为PS严重的两个等位基因的突变在诊断时为PS，但发展为PI。只有4个(0.7%)有两个严重突变的个体保持PS。一名患者(ΔF508/ΔF508)的胰腺刺激测试显示胰腺腺泡功能显著降低，接近发生PI的阈值。18其余三名患者未接受检测。
CFTR基因突变和胰腺表型的功能后果
我们能够根据他们的预测结果对633名患者中的607名进行分类雌性生殖道基因突变(表2)。不携带ΔF508但为不同类别突变的复合杂合子的患者被排除在外。99%(552/557)的I、II或III类突变均为纯合或复合杂合的患者在诊断时为PI(528)，或在诊断后进展为PI。19只有5名I、II或III类突变个体自诊断以来仍保持PS。其中包括一名携带错义突变G85E的患者，该突变似乎对胰腺表型有不确定的影响，因为它已在PS和PI表型患者中观察到。2349名携带至少一种IV类或V类突变的患者中，除一人外，其余均保持PS状态。只有一名携带IV类突变I1234V的患者在慢性胰腺炎症状持续10年后，于25岁时发生PI。
胰腺功能的基因型和定量测量
对95例患者(34例女性)进行了胰腺功能检查，其中46例保持PS, 49例诊断时为PI或诊断后发展为PI。表3是根据功能分类系统对胰腺腺泡和导管的功能数据雌性生殖道基因突变。所有I、II或III类突变的纯合或复合杂合患者的胰腺腺泡和导管功能均严重受损。当以平均输出参考值的百分比表示时(图1)，与IV或V类突变患者相比，I、II或III类突变患者腺泡容量明显不足(p<0.0001, Kruskal- Wallis， χ)2， 4df)。在IV类和V类突变患者中，腺泡功能的酶输出范围很广，从平均控制值的18%到参考范围内的值。同样，在I、II或III类突变纯合或复合杂合患者中，导管功能(液体、碳酸氢盐和氯化物分泌)明显低于IV或V类突变患者(p<0.01)2O;HCO3 p<0.001−和Cl−)．PS→PI的I、II和III类患者与诊断时为PI的患者无法区分。PS→PI组腺泡输出为0 ~ 14.3%。
70例患者静脉输注胆囊收缩素/分泌素后定量胰腺腺泡和导管分泌，以平均控制值的百分比表示。(一)胰蛋白酶;(B)脂肪酶和脂肪酶;(三)液量;和(D)碳酸氢盐(HCO3.−)和氯化物分泌。方框边距代表第25和第75百分位，横条代表中位数。胡须表示数据的范围。I类、II类和III类与IV类和V类比较显示出显著差异:p=0.01(液体)，p=0.001(碳酸氢盐和氯化物)，p<0.0001(胰蛋白酶、脂肪酶和脂肪酶)(Kruskal-Wallis， χ)2，有4个df。
讨论
试图阐明CF的基因型和各种表型表现之间的关系一直受到大量的阻碍雌性生殖道基因突变。在这项研究中，最常见的致病突变(ΔF508)的频率与所有突变的大约70%的频率非常相似雌性生殖道全球报告突变等位基因。在本研究中报道的四个最常见的突变(G551D, G542X, 621+1G→T和W1282X)分别占所分析突变的1%至3%。另外25个突变，包括内含子8中的5个胸腺嘧啶变异，24被鉴定出属于两个以上的家族。因此,31雌性生殖道在一个以上家族中发现的基因突变或变异体占所有突变等位基因的87.8%。在单个患者中发现的45个额外突变或假定突变仅占突变等位基因的3.5%。尽管我们尝试筛选所有的外显子雌性生殖道基因方面，8.8%的突变等位基因仍未鉴定。这些结果与最近发表的CFTR在法国人群中的突变频率一致。25
认识到CF中不常见或罕见突变的频率，我们通过对个体患者的基因型和胰腺表型进行分类，评估了基因型和胰腺表型之间的关系。雌性生殖道基因突变。在本分析中，没有基于胰腺表型的先验知识对基因型进行假设，因为基因型的分类纯粹基于其对CFTR介导的阴离子分泌的已知或预测后果(图1)。雌性生殖道属于I、II或III类的基因突变对基因转录、mRNA翻译或新生蛋白质的细胞内运输有不同的影响。然而，就功能而言，它们都将导致cAMP调控氯通道功能的完全丧失。本研究结论表明，I、II和/或III类突变的纯合子或复合杂合子与严重胰腺疾病密切相关，因为这些患者绝大多数在诊断时为PI，或在确诊CF后发展为PI。相比之下，IV类和V类突变对cAMP调控的氯通道特性的影响预计不那么严重。在我们的研究中，所有携带至少一种IV级或V级突变的患者在诊断时均为PS，通过胰腺功能检测，除1人外，其余患者均为PS。唯一的例外似乎是由于慢性胰腺炎引起的进行性胰腺损伤而发展为PI。为了支持这些结果，来自欧洲囊性纤维化流行病学登记处的数据显示，IV和V类突变的患者不太可能服用胰酶补充剂。然而，胰腺功能状态并没有得到客观的定义。26
接受胰腺刺激试验的患者的子集也根据他们的预测结果进行了评估雌性生殖道基因突变。不足为奇的是，I类、II类或III类突变的纯合或复合杂合患者腺泡容量严重受损(胰蛋白酶、总脂肪酶和脂肪酶的酶分泌)。在测试时为PS的PS→PI患者中(n=14)，酶分泌也严重受损(接近平均控制值的0-14.3%)。这些病人中大多数携带严重的雌性生殖道两种等位基因都发生突变，在两年内患上PI。相比之下，本研究中的患者至少有一种温和的IV类或V类突变的胰腺腺泡储备明显较好，大多数已维持数十年。胰蛋白酶分泌在该组从11%的平均控制值的值在我们的成人参考范围。18
胰腺导管阴离子(氯化物和碳酸氢盐)和液体的分泌在患者中受到损害雌性生殖道基因突变属于所有五个功能类。这是意料之中的，因为CFTR通常在小叶内和近端导管上皮中高水平表达，而在腺泡细胞中低水平表达。27日,28导管上皮中的CFTR促进富碱性液体的分泌，维持分泌酶的溶解度。CFTR功能的完全丧失导致腔内pH值降低和分泌量降低。29舍勒和同事29研究表明，腺泡腔内pH值的降低抑制了分泌颗粒蛋白的腺泡内吞作用，降低了分泌蛋白在腺泡腔内的溶解度。由于两种等位基因(I类、II类或III类)的突变，CFTR功能的完全丧失似乎通过腺泡管腔和小导管内分泌蛋白的阻塞诱导快速胰腺萎缩。对早产儿和新生儿CF胰腺的死后研究清楚地表明，这一过程始于子宫内30.也解释了婴儿早期胰脏衰竭的快速发展。携带至少一个属于IV类或V类突变等位基因的患者也有导管功能障碍的证据。即使腺泡储备正常，氯化物、碳酸氢盐和液体分泌也明显低于成人对照组。这一观察结果支持了我们之前的假设，即阴离子和液体分泌的主要成分直接归因于胰腺导管上皮的功能性CFTR。19日,20.显然，轻度IV或V类雌性生殖道基因突变，导致一些剩余的导管功能，似乎保护外分泌胰腺从完全破坏在早期。
对于携带IV类和V类突变的患者腺泡储备和导管功能障碍的异质性，有几种可能的解释。属于IV类和V类的特定突变等位基因可能表现出不同程度的氯通道功能障碍，这反过来可能影响疾病进展。其次，携带至少一种IV或V类突变的患者可能会因慢性胰腺炎而发生进行性胰腺损伤。虽然在临床诊断为CF的患者中，急性复发性胰腺炎或慢性胰腺炎的患病率较低，31那些具有PS表型的人出现这种并发症的风险很高。31
这种分类系统的局限性是公认的。如果患者携带“假定的”突变，或者导致突变的疾病的分子特性尚不清楚，则无法进行分类。此外，尽管做了大量的努力来识别所有雌性生殖道基因突变，一个或两个突变等位基因在17%的患者中仍未识别。少数突变(例如G85E)被认为是不确定的，因为它们对胰腺表型的影响不一致。最后，在具有两个不同类别的突变等位基因的复合杂合子中，预测其功能后果更为困难。尽管存在这些局限性，我们通过从预测的或已知的特异性分子结果开始分析，克服了之前分析CF基因型和表型之间关系的假设雌性生殖道突变。在这一患者队列中，我们已经证明了每种基因型的预测功能效应与胰腺表型之间的强相关性。然而，也有一些例外。例如，两个I类突变(875+1G>C)的兄弟姐妹具有PS表型。其确切原因尚不清楚，因为875+1G>C会对高度保守的剪接供体位点序列产生不利影响。一种可能性是，附近的另一种剪接可能会保留这种突变等位基因的效果。
总之，我们已经证明，利用分子后果的分析雌性生殖道CF基因型与胰腺表型密切相关。此外，我们提供了独特的数据表明雌性生殖道基因突变与胰腺腺泡和导管功能的定量测量相关。
致谢
由加拿大囊性纤维化基金会和国家卫生研究所(NIDDK-DK 49096)资助。Ahmed博士是医学研究理事会(加拿大)研究奖学金的获得者。