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摘要
背景:慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染个体发展为肝硬化的速度不同。在肝纤维化模型中，凝血通路活化提示凝血通路组分的变化可能影响纤维化的速率。我们假设凝血因子II和V的多态性会影响HCV感染者发展为肝硬化的速度。
方法:我们研究了352例感染HCV的白种欧洲患者的纤维化率(通过将纤维化阶段除以感染持续时间计算)与特异性凝血途径基因型之间的关系。采用逆行杂交进行基因分型。
结果:V Leiden因子基因型(Arg560Gln)患者的纤维化率明显较高(ANOVA, p=0.004)。在疾病相关性研究中，发现了显著的相关性(Fisher精确检验，p=0.029;如果V Leiden因子杂合，则快速发展为肝硬化(预计在30年内达到肝硬化)的优势比为3.28。因子II基因型与纤维化率之间无相关性。
结论:拥有因子V莱顿多态性显著增加HCV疾病快速进展的风险，提示凝血系统在纤维化肝病的发病机制中的作用。
- 丙型肝炎
- 纤维化
- 率
- 因子V莱顿
- 多态性
- 丙型肝炎病毒
- PCR，聚合酶链式反应
- 方差分析
- ANCOVA，协方差分析
数据来自Altmetric.com
丙型肝炎病毒(HCV)在全世界感染了1.7亿人，大多数与感染相关的发病率和死亡率是由于肝硬化及其并发症的发展。通过纤维组织沉积发展为肝硬化的速度因人而异。纤维化率的变异性中只有一小部分可以用已知的人口统计学和环境因素来解释(一项大型研究中为18%)129%的人2）.
有一些一般和具体的证据表明，宿主遗传因素起着关键作用。宿主基因型已被证明可以决定许多传染病的结局，例如疟疾，3.乙型肝炎病毒，4，5和丙肝病毒。6以前在丙型肝炎方面的工作已经检查了HLA系统在病毒自发清除中的作用6,7以及转化生长因子β1与肾素血管紧张素系统在纤维化阶段的作用。8HFE多态性对HCV感染结局的影响存在争议。9，10一组爱尔兰妇女通过受污染的抗D (RHO)免疫球蛋白感染的病例表明，即使在年龄组、性别和病毒变量得到控制的情况下，HCV的自然史也有很大差异。11确定特定的遗传因素可能有助于预后，治疗决定，甚至治疗发现。
与身体其他部位一样，凝血途径在肝损伤中也很重要，来自四氯化碳诱导大鼠纤维化的支持证据表明，损伤肝脏中纤维蛋白和纤维蛋白原沉积增加。12此外，星状细胞上的凝血酶受体在肝损伤时上调13凝血酶也被认为是一种星状细胞有丝分裂原。14许多凝血因子多态性已被证明对凝血级联和随后的血栓形成风险具有功能性影响。在凝血酶基因的3’非翻译区20210位置上的鸟嘌呤取代腺嘌呤与过量凝血酶生成相关15并增加动脉和静脉血栓形成的风险。因子V Lieden是由Gln 506位的氨基酸取代精氨酸产生的，随后是单核苷酸取代(腺嘌呤取代1691位的鸟嘌呤)。该多态性赋予了对激活蛋白C的抗性，激活蛋白C是抑制激活因子V的负反馈环的一部分，因子V与激活因子X一起将凝血酶原转化为凝血酶。因子V Leiden突变已被证明增加静脉血栓栓塞的风险。16我们检查了由这些多态性所赋予的促凝倾向导致纤维组织沉积增加，从而更快地发展为肝硬化的假设。
方法
病人
在八个欧洲肝病学中心发现的慢性丙肝感染患者17在1990年1月1日至2001年6月30日期间，作为常规临床实践的一部分，至少接受过一次肝活检。所有患者均为已知HCV抗体阳性的欧洲白人，且均为已知RNA阳性。如果患者在活检前接受过抗病毒治疗，如果他们患有肝细胞癌，除了丙型肝炎外，还有其他类型的肝脏疾病的证据，人类免疫缺陷病毒合并感染，或活检不能解释，那么他们就被排除在外。收集有关患者人口统计学细节(性别、出生日期、感染年龄、危险因素、种族)、组织学参数和病毒基因型的数据。记录感染日期;在被血液制品感染的患者中，记录输血日期。当不知道确切的日期，但知道年份时，估计的感染日期被记录为当年的年中。在因静脉注射毒品而感染的患者中，与其他地方一样，估计感染日期为首次使用毒品的年中。1感染日期未知的患者被排除在外。
组织病理学
所有患者活检均用苏木精-伊红和网状蛋白染色。评分由单个病理学家(RG)使用改良组织活性指数(HAI- Ishak)评分系统进行。18该评分系统将纤维化程度划分为0-6分。在感染时假定纤维化阶段为零。
DNA集合
所有患者均知情同意。每个研究中心的当地伦理委员会都批准了这项研究。使用商业试剂盒(Nucleon II, Scotlabs, UK)从收集到EDTA的5毫升全血样本中提取基因组DNA。
基因分型
基因分型采用逆行杂交线性阵列法(Roche Molecular Systems, Alameda, USA)。提取的基因组DNA使用混合引物进行多靶点聚合酶链反应(PCR)扩增。然后，按照Cheng及其同事的描述，PCR产物通过杂交对浸渍在尼龙条上的特定寡核苷酸进行测序，并在比色反应中进行检测，进行基因分型。19然后检查条带是否存在表明等位基因存在的彩色条带。
统计分析
所有统计使用SPSSv10 (SPSS公司，芝加哥，伊利诺伊州，美国)和Microsoft Excel进行。纤维化率计算为活检时纤维化评分与感染持续时间的比率。确定了队列的中位纤维化率，并相应地将任何一方的患者指定为“快速”或“缓慢”纤维化者。快速亚组(预测肝硬化低于中位数)和慢速亚组(预测肝硬化未超过中位数)之间的人口统计学差异采用独立样本进行评估t检验、方差分析(ANOVA)、χ2适当的测试。对纤维化率进行对数变换，得到正态分布。采用方差分析比较不同基因型个体间的发病率。用χ比较快速和慢速纤维化患者亚组间的等位基因频率2或者费雪的精确检验。敏感性分析，采取不同的切断点之间的“快”和“慢”纤维，也进行了。
寻找与基因型相关的纤维化率的变化。此外，基因型和等位基因频率在该队列的快和慢亚组之间进行了比较。为了解释表型组之间的人口学差异，进行亚组分析，并进行协方差分析(ANCOVA)，以检查感染年龄、坏死炎症评分和性别的影响。
在使用ANCOVA校正感染持续时间后，比较基因型之间的纤维化阶段。
结果
纤维化评估的可重复性。
在35个随机活检样本中，观察者内部和观察者间一致(加权kappa分别为0.87和0.82)。
人口统计学特征
中位纤维化率为0.2纤维化单位/年(30年至肝硬化)。表1显示了“快速”和“缓慢”纤维化患者组的人口统计学特征以及整个组的人口统计学特征。正如预期的那样，快速纤维化组男性患者多于男性(p=0.001)，快速纤维化组感染年龄明显高于男性(p<0.001)。在该组中，HCV的获取方式和病毒基因型与纤维化进展率无关。快速纤维患者在活检前感染时间较短，这与感染年龄呈负相关(r=−0.485;p < 0.001)。快速纤维化组的中位纤维化率是慢纤维化组的5倍(0.4个单位/年)v0.08单位/年;p < 0.001)。快速纤维化组的平均纤维化评分和坏死炎症评分均较高(3.67和5.15个单位)v1.68和3.7单位;P <0.001)(表1)。
纤维化率比较
纤维化率与基因型之间的关系采用方差分析(对纤维化率进行对数变换以达到正态分布)进行检验。共纳入了352例V - Leiden因子基因型的个体(表2)。V因子基因型对纤维化率有显著影响。V莱顿因子突变杂合子患者的中位纤维化率为每年0.37个纤维化单位(四分位数范围0.2-0.89)，而野生型V因子患者的中位纤维化单位为每年0.18个(四分位数范围0.08-0.37)(方差分析，p=0.004)(图1)。没有患者是V莱顿因子纯合子。
基因型纤维化率:log的95%置信区间eV - Leiden基因型对肝纤维化发生率的影响(ANOVA, p=0.004)。
疾病协会
对182个纤维化速率慢的个体和170个纤维化速率快的个体的DNA进行了疾病关联分析。可见显著相关性(Fisher精确检验，p=0.029;快速的优势比3.28(95%置信区间1-12.7)v慢)(表2)。
敏感性分析
对定义快、慢纤维患者的不同截断点进行了疾病关联(表3)。纤维化率的差异越极端，个体拥有V莱顿因子等位基因的可能性就越大。例如，在不到15年的时间内进展到肝硬化的患者比进展到35年以上的患者有12.3倍的可能性有V莱顿因子等位基因(p=0.0005)。
多变量分析
因子V基因型对纤维化率的影响在男性中最为明显(p=0.007, Fisher精确检验;速度的优势比是10v慢纤维化，方差分析，p=0.021)。
为了考虑感染年龄、坏死炎症评分和性别对纤维化率的影响，采用1型平方和模型进行ANCOVA。当考虑感染年龄(p<0.001)、坏死炎症评分(p<0.001)和性别(p<0.001)时，因子V基因型对纤维化进展率的显著影响是持续的(p=0.007)。
纤维化阶段和V莱顿因子的存在
不同纤维化阶段患者的因子V基因型频率见表4和图2。V Leiden因子杂合子患者的平均纤维化评分为3.75单位，纯合子野生型患者的平均纤维化评分为2.61单位(p=0.01)。在修正感染持续时间后，这种差异仍然存在(p=0.011)。
根据V因子基因型判断纤维化分期:V因子Leiden基因型判断纤维化分期的95%可信区间(ANOVA, p=0.01)。
因素二世
因子II基因型与纤维化率之间无显著相关性。在快速组中有112个纯合子野生型和6个杂合子，而在慢速组中分别有175个和7个(优势比1.3;χ,p = 0.62；方差分析,p = 0.59)。
讨论
这些数据提供了证据，证明拥有因子V莱顿突变导致HCV感染纤维化率增加。快速纤维化与FvL突变之间的关联不依赖于潜在的混杂变量，男性的影响程度比女性更明显。在HCV中使用纤维化率作为疾病相关表型是新的。使用度量纤维化率并不被普遍接受，因为它意味着纤维化阶段之间的时间是相等的。纤维化阶段是一个形态学变量，也可能是一个半定量变量。然而，在对包括我们自己在内的患者群体的横断面分析中，1，2感染时间与纤维化程度呈线性关系。此外，一个人群的纤维化阶段随着人口年龄的增长呈线性增加。这已被证明是比较队列疾病进展的可靠手段，而不是单个患者。如果情况并非如此，并且在更高阶段的纤维化中有更快速的过渡，我们的发现仍然有效，因为我们已经表明，尽管在感染和第一次活检之间的时间较短，但快速纤维化组的纤维化评分显著较高。在表4和图2中，我们证明了V莱顿因子的存在与更晚期的纤维化阶段之间也存在关联。这在考虑到感染持续时间后仍然存在。
V Leiden因子的功能意义被很好地描述为这种突变赋予了对活化蛋白C的抗性，而活化蛋白C通常会降解因子V。这一发现表明HCV感染引起的肝脏炎症导致凝血系统的激活。在那些V Leiden因子突变的患者中，激活程度增强，导致凝血酶活性和纤维蛋白产生增加。凝血酶是一种星状细胞有丝分裂原14因此，凝血级联的激活可能会刺激星状细胞的活化和纤维化。因子II多态性出现的频率低于因子V，我们无法排除该人群中的2型错误。然而，数据表明促凝剂杂合子形式与预期方向的快速纤维化之间存在弱趋势。因子V莱顿多态性影响分子的功能，而凝血酶多态性影响血浆水平，这意味着它可能有其他的方式发挥作用——甚至可能独立于凝血级联。
现在在转基因因子V莱顿小鼠模型中证实了凝血和纤维化之间的联系20.所有组织中的纤维蛋白沉积都增加了。此外，对博莱霉素反应的肺纤维化在这些动物中显著增加。21V Lieden因子与肝纤维化快速发展的相关性似乎在男性中占优势，而在女性中仅观察到一种趋势。正如Poynard和同事之前报道的那样，1在我们的研究中，发现感染年龄和男性性别与快速纤维化率相关。纤维化与动脉粥样硬化在病理上有很大的相似性，动脉粥样硬化在男性中也更常见。这可能是因为雌激素保护女性免受纤维化的影响，就像绝经前女性免受缺血性心脏病的影响一样。鉴于Poynard的发现，在我们的人群中，酒精与纤维化率之间缺乏关联是令人惊讶的1这可能与我们人群中不同的饮酒模式有关。有可能在我们的患者组中，承认酗酒被认为是禁忌，从而导致对真实消费的错误描述，特别是因为数据是在患者意识到他们的HCV诊断后收集的。这一领域的数据收集是出了名的不准确，大约一半的队列报告了禁欲，而有些则根本没有反应。对那些病情更严重的患者进行选择性回忆，可以给出与严重程度相关的结果，但不会对发生率产生影响。我们只能记录当前的饮酒量，并且患者知道他们的诊断可能已经根据医生的建议改变了他们的饮酒行为。然而，很难假设酒精摄入量和V莱顿因子基因型如何相互作用产生混杂效应。病毒基因型仅适用于大约60%的队列，我们没有证明对纤维化率有任何影响。对于酒精和病毒基因型，在慢纤维化组和快纤维化组中缺失数据的比例相同，减少了任何偏倚的可能性。
V莱顿因子可能影响其他病因肝炎的纤维化率，但我们在本研究中无法解决这一假设。许多因素影响纤维化的发展速度。个体基因在个体之间的整体变异性中只起很小的作用。显然，拥有V莱顿因子既不是快速纤维化的必要原因，也不是充分原因，这可以通过发现证明，即使在快速纤维化组中，它也只占少数病例。然而，这些数据可能暗示凝血在纤维化途径中的普遍参与，那些有促凝倾向的人也有促纤维化倾向。
致谢
逆行杂交系统由Roche Molecular Systems, Inc, Alameda, California, 94501 USA捐赠。
HENCORE是欧洲丙型肝炎合作研究网络。参与者有:Pierre Pradat博士(Hopitaux de Lyon, Place de l ' hospital, 69288 Lyon, France);胡安·埃斯特班医学博士(西班牙巴塞罗那，希布伦市，帕西亚·瓦莱，希布伦S/U o8035);Stephanos Hadziyannis医学博士(雅典大学医学院第二学系希波克拉丁医院，希腊雅典610号Vasilissis Sophias大道114号);Michael Manns博士(意大利都灵Molinette医院消化内科);Hans Tillmann MD(汉诺威医学高等学校，Carl Neuburg街1,30623汉诺威，德国);Alfredo Alberti医学博士，Liliana Chemello医学博士(临床和实验医学系，Via Guistiniani 2,35126 Padova，意大利);Giorgio Saracco医学博士，Mario Rizzetto博士(意大利都灵Molinette医院消化内科);Jean-Henrik Braconier医学博士(瑞典伦特大学医院传染病科);Christian Trepo(里昂医院，1 Place de l ' Hopitaux de Lyon Cedex 02, France)。
这项工作的一部分是由Roche Discovery, Welwyn, UK和Charmot-Horton Foundation捐赠的资金慷慨支持的。通讯作者是英国医学研究理事会临床培训研究员。