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摘要
背景:在所罗门群岛，一种严重形式的铁过载与常染色体显性遗传血色素沉着病的临床病理特征已被描述。这种疾病的遗传基础尚未确定。这种疾病与4型血色素沉着症有相似之处，后者是由基因突变引起的ferroportin1．
目的:这项研究的目的是确定所罗门群岛患者铁超载的遗传基础。
患者及方法:基因组DNA从所罗门群岛男子严重铁过载外周血白细胞分离。的整个编码区域和拼接位点ferroportin1基因测序。
结果与结论:一种新的错义突变(431A>C;N144T)被鉴定为基因外显子ferroportin1基因。开发了一种新的基于限制性内切酶的检测方法，可以识别N144T和N144H突变，这将简化所罗门群岛和其他人群中铁超载患者的诊断和筛查。这是在所罗门群岛人群中首次发现的与血色沉着症相关的突变。
- 遗传haemochromatosis
- ferroportin1
- PCR，聚合酶链式反应
- Bp碱基对
数据来自Altmetric.com
遗传性血色素沉着症是最常见的遗传性疾病之一，与体内铁吸收和铁沉积的增加有关。如果不治疗，铁的积累会导致组织损伤，包括肝硬化、糖尿病、关节病、心肌病、内分泌异常和肝细胞癌。1最常见的血色沉着症(1型)是由基因突变引起的HFE基因。2这是一种常染色体隐性遗传特征，大约每200人中就有1人患有北欧血统。
其他非HFE相关形式的铁过载已被描述。青少年血色素沉着症(JH或2型)是一种常染色体隐性遗传特征。最近，两种形式的JH已被确认:一种映射到染色体1q3.1到19号染色体。4编码抗微生物肽hepcidin的基因突变与19号染色体形式有关。4然而，负责1号染色体JH的基因还没有被确定。3.基因突变转铁蛋白受体2基因与另一种类型的血色沉着病(3型)有关。5
最近发现了常染色体显性型血色素沉着症(4型)的一个位点。基因被证明是有责任的ferroportin1．6,7的ferroportin1基因，也被称为SLC11A3，IREG1,MTP1，8 -10编码一个多重跨膜结构域蛋白，负责从细胞中输出铁。三种突变ferroportin1基因N144H6A77D,7和V162del。11 -14这些突变的杂合性导致铁超载的形式，与高血清铁蛋白水平和大量铁沉积在网状内皮细胞。
所罗门群岛的铁超载以前也有报道。15它被描述在一个大的美拉尼西亚血统，包括81个幸存的亲属。通过测量血清铁蛋白浓度和转铁蛋白饱和度，共有31名成员显示出铁过载。所有接受肝活检的受试者均证实铁超载。铁负荷随着年龄的增长而增加，几乎所有受影响的成员都存在某种程度的纤维化或肝硬化。遗传分析提示为常染色体显性遗传模式。排除了与HLA-A和B位点的连锁，提示该疾病与HFE．15
我们报告了一种新的核苷酸取代的鉴定ferroportin1基因(431 C >;N144T)与所罗门群岛的一名患者的严重铁过载有关。我们还描述了一种新的基于限制性内切酶的检测方法，这将有助于筛查N144T和N144H突变。
患者与方法
本研究由昆士兰医学研究所人类研究伦理委员会的伦理标准批准并按照1975年赫尔辛基宣言(1983年修订)进行。本报告中所述的所有研究均获得患者的知情和书面同意。
病人的细节
所罗门群岛一名48岁男子接受例行体检。体检时发现心脏杂音及肝肿大。随后的生化评估显示，其丙氨酸转氨酶水平升高82 U/l，血清铁浓度升高40 μmol/l，转铁蛋白饱和度升高80%，血清铁蛋白浓度升高2937 μg/l。血清铜和铜蓝蛋白水平正常。患者的两种常见突变均为阴性HFE、C282Y和H63D。肝活检显示，4级铁主要存在于实质细胞中，Kupffer细胞和门脉巨噬细胞中有明显的铁沉积(图1)。肝铁浓度为363 μmol/g，肝铁指数为7.6。此外，观察到门脉纤维化，但没有明显的肝硬化。
病人肝活检切片显示门脉纤维化和铁过载。肝活检显示(A)门脉纤维化，(B, C)珀尔斯普鲁士蓝染色显示实质铁大量(4级)堆积，库普伐细胞和巨噬细胞明显铁沉着。(A和B, 100倍放大;C，放大200倍。)
患者出生在所罗门群岛，父母和祖父母都是美拉尼西亚-所罗门群岛血统。他与Eason和同事研究的家庭没有直接关系15但不能排除更遥远的祖先联系。
努力联系和获得血液样本的家庭成员和先前描述的谱系研究Eason和同事。15然而，由于我们无法控制的情况，我们无法联系到任何人。
控制
研究人员对100名正常健康的澳大利亚人作为对照组进行了研究，以确定阅读一本小说的频率ferroportin1替换和排除它作为一个常见的多态性。来自所罗门群岛人口的对照组没有用于这项研究。
分子研究
从外周血白细胞中分离的基因组DNA被用作聚合酶链式反应(pcr)的模板。整个编码序列和拼接位点ferroportin1被放大和测序，如前所述。11
基因外显子5核苷酸序列分析ferroportin1揭示了新的核苷酸取代431A>C可以通过限制性内切酶检测。扩增部分外显子5(引物IRG5F 5 ' CTGCTATATCCTGATCATCACTAT3 '和IRG5R 5 ' GAAAGCCAAATTACTTGCTAGTT3 ')的结果为136个碱基对(bp)。当用酶消化时茶匙509I (New England Biolabs, Massachusetts, USA)野生型序列有两个条带，分别为37和99 bp。431A>C取代(和430A>C, N144H突变)破坏酶识别位点，导致没有裂解产物。DNA片段在2%琼脂糖- tbe凝胶上运行，并用溴化乙锭进行观察。
结果与讨论
DNA序列分析ferroportin1来自所罗门群岛的一名严重血色沉着症患者的研究显示，外显子5中出现了新的单核苷酸取代(431A>C)(图2A)。取代导致残基144从天冬酰胺变成苏氨酸(N144T)。
DNA测序和限制性内切酶多态性检测突变。外显子5ferroportin1使用引物IRG5F和IRG5R进行扩增。(A)野生型(上)和突变型的DNA序列ferroportin1(底部)。(B)第1、3、5道是未切割的DNA;第2、4和6行是被消化的DNA茶匙509我。1号和2号车道是野生型DNA, 3号和4号车道是从所罗门群岛患者身上分离出来的DNA, 5号和6号车道是在430A>C突变质粒中克隆的外显子5 DNA。得到的聚合酶链反应产物长度为136个碱基对(bp)。当用茶匙509I，野生型序列给出了37和99 bp的两条条带(2巷)。患者(4巷)的431A>C突变是杂合的;结果得到三个条带，一个未切割的条带为136 bp，两个切割的条带为37 bp和99 bp。突变体对照是一个合成质粒对照(430A>C)，因此是纯合的(6道)。
431A>C取代的存在是用a茶匙509I限制性内切酶消化试验(图2B)。有趣的是，该方法也可用于检测430A>C (N144H)突变，该突变在一个荷兰4型血色素沉着症家庭中被发现。6
对照组由100名正常健康个体组成，并对其进行分析茶匙509I限制性内切酶测定，以确定431A>C取代在一般人群中的频率。在对照组中未检测到，提示431A>C可能是一种致病突变，而不是常见的多态性。
多年来人们已经知道，一种形式的遗传性铁超载无关HFE这种疾病在所罗门群岛存在，但以前从未研究过这种疾病的分子基础。15在Eason和同事研究的家族中，这里描述的突变是否是血色沉着症的原因15还有待确定。
我们在所罗门群岛患者身上发现的突变与Njajou及其同事描述的突变影响相同的氨基酸6(430A>C;N144H)，然而，天冬酰胺被苏氨酸取代，而不是组氨酸。这种天冬酰胺残留物在物种间高度保守，可能在铁转运蛋白1的正确功能中起重要作用。Njajou和他的同事6提示N144H为功能突变增益。然而，与蒙托西及其同事的看法一致，7我们认为N144T, N144H和所有其他先前报道的突变的杂合度ferroportin1导致功能丧失，导致铁输出受损，体内铁平衡异常和铁过载。
总之，我们发现了一种新的核苷酸取代ferroportin1这会导致氨基酸N144T的变化。这种变化与所罗门群岛的一名患者严重的铁过载有关。虽然以前曾在这一人群中描述过常染色体显性形式的铁过载，15分子基础尚未建立。这是首次在该人群中鉴定出与血色沉着症相关的突变。这种突变是否与先前报道的铁超载病例有关仍有待确定。一种新型可靠的检测N144T和N144H突变的方法的描述，将使所罗门群岛和其他人群中4型血色素沉着病的快速筛查和诊断成为可能。这将使早期识别受影响的个体，并允许治疗，以防止铁相关的组织损伤。
致谢
这项工作得到了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会(953219)和美国国家卫生研究院(5R01DK057648-02)的资助。
参考文献
脚注
K E Arden和D F Wallace对这项工作做出了同样的贡献。