条文本gydF4y2Ba
PDFgydF4y2Ba
摘要gydF4y2Ba
背景与目的:gydF4y2Ba为了阐明胃上皮细胞和粘膜T细胞之间的相互作用，我们研究了上皮细胞释放的细胞因子在对胃粘膜T细胞的反应中的作用gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba水提物蛋白(HPWEP)在调节T细胞环氧合酶2 (COX-2)表达和活化中的作用。gydF4y2Ba
方法:gydF4y2Ba用HPWEP培养48小时的MKN-28细胞培养基加入Jurkat T细胞和人外周血T细胞。采用western blot法和ELISA法检测MKN-28细胞培养基中C-C和CXC趋化因子浓度，以及T细胞中COX-2、干扰素γ (IFN-γ)和白细胞介素(IL)-4分泌物的表达。COX-2阳性T细胞和单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)在组织标本中的分布gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba相关胃炎免疫组化诊断为单标记或双标记。gydF4y2Ba
结果:gydF4y2Ba在HPWEP培养的MKN-28细胞培养基中检测到MCP-1、IL-7、IL-8和RANTESgydF4y2Ba．gydF4y2Ba介质作为一个整体和MCP-1单独刺激COX-2表达和外周T细胞增殖。抗mcp -1抗体抑制介质刺激cox - 2mrna表达的Jurkat T细胞。培养基刺激外周T细胞分泌IFN-γ而不刺激IL-4，而MCP-1刺激IL-4而不刺激IFN-γ的分泌。特异性COX-2抑制剂NS-398可部分抑制细胞因子释放和外周T细胞增殖。在胃炎粘膜中，COX-2表达于T细胞，MCP-1主要定位于上皮细胞和单核细胞。MCP-1水平与组织样本中COX-2表达强度密切相关。gydF4y2Ba
结论:gydF4y2Ba细胞因子如MCP-1，从胃上皮细胞中释放，以响应HPWEP，似乎调节T细胞免疫反应，至少部分通过COX-2表达。gydF4y2Ba
- 幽门螺杆菌gydF4y2Ba
- T细胞gydF4y2Ba
- 环氧合酶gydF4y2Ba
- cox - 2抑制剂gydF4y2Ba
- 粘膜免疫gydF4y2Ba
- MCP-1，单核细胞趋化蛋白1gydF4y2Ba
- 考克斯环氧酶gydF4y2Ba
- ,白介素gydF4y2Ba
- 干扰素γgydF4y2Ba
- PG,前列腺素gydF4y2Ba
- HPWEP,gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba水萃取蛋白gydF4y2Ba
- FCS，胎牛血清gydF4y2Ba
- NFκB，核因子κBgydF4y2Ba
- MIP，巨噬细胞炎症蛋白gydF4y2Ba
- 酶联免疫吸附试验gydF4y2Ba
- RT-PCR，逆转录聚合酶链反应gydF4y2Ba
- TBS, Tris缓冲盐水gydF4y2Ba
- 有限合伙人,脂多糖gydF4y2Ba
- Th T辅助音gydF4y2Ba
数据来自Altmetric.comgydF4y2Ba
- MCP-1，单核细胞趋化蛋白1gydF4y2Ba
- 考克斯环氧酶gydF4y2Ba
- ,白介素gydF4y2Ba
- 干扰素γgydF4y2Ba
- PG,前列腺素gydF4y2Ba
- HPWEP,gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba水萃取蛋白gydF4y2Ba
- FCS，胎牛血清gydF4y2Ba
- NFκB，核因子κBgydF4y2Ba
- MIP，巨噬细胞炎症蛋白gydF4y2Ba
- 酶联免疫吸附试验gydF4y2Ba
- RT-PCR，逆转录聚合酶链反应gydF4y2Ba
- TBS, Tris缓冲盐水gydF4y2Ba
- 有限合伙人,脂多糖gydF4y2Ba
- Th T辅助音gydF4y2Ba
胃和结肠上皮细胞参与免疫和炎症过程，不仅作为营养吸收的表面，而且作为对摄入的病原体的防御，gydF4y2Ba1，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表达并产生可溶性炎症介质。在gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba与正常黏膜相比，胃粘膜细胞因子如白细胞介素(IL)-1β、干扰素(IFN -γ)和IL-8的浓度显著升高。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba4gydF4y2Ba作为对gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba，胃上皮细胞分泌的IL-8已被证明可诱导中性粒细胞积聚，导致胃粘膜局部炎症。然而，慢性胃炎中观察到的单核细胞(如淋巴细胞和巨噬细胞)的浸润在胃粘膜中是如何被调节的，尚不明确，如IL-8中性粒细胞的调节。gydF4y2Ba
前列腺素(PGs)是由大多数人体组织和细胞类型合成和分泌的，在调节体液免疫和局部细胞介导免疫、调节细胞因子和Ig的产生以及T细胞的增殖和激活中发挥关键作用。gydF4y2Ba5，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba环加氧酶(COX)催化花生四烯酸向PGH的两步转化gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，是生物合成各种pg所需的第一个反应。COX-2是一种可诱导酶，其诱导和表达受生长因子、有丝分裂原、肿瘤生长促进剂和生理应激动态调控。gydF4y2Ba7，gydF4y2Ba8gydF4y2BaCOX-2的持续激活与肿瘤发生以及肿瘤细胞侵袭潜能的增加有关。gydF4y2Ba9，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba我们前期研究表明，COX-2在巨噬细胞和单核细胞中表达，可能在实验性溃疡动物的黏膜修复机制中起重要作用gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba在人类身上。gydF4y2Ba11 -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba此外，有报道显示，在T细胞中诱导COX-2可调节T细胞细胞因子的释放，从而调节免疫反应。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba研究还表明，T细胞极化可能是决定胃炎恶化或缓解的关键因素。gydF4y2Ba15日,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba在腹腔疾病中，小肠T细胞表达的COX-2被认为有助于病变黏膜的愈合。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba然而，T细胞是否表达COX-2gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba胃炎粘膜或T细胞活化和极化是否与其COX-2表达有关尚不清楚。此外，胃上皮细胞释放的可溶性因子是否对gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba参与COX-2表达和胃粘膜T细胞活化。因此，在本研究中，我们研究了胃上皮细胞和T细胞之间的相互作用，方法是检测胃上皮细胞释放的细胞因子对T细胞的反应gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba水提取物蛋白对T细胞COX-2表达和T细胞活化的影响。gydF4y2Ba
材料与方法gydF4y2Ba
的制备gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba水萃取蛋白gydF4y2Ba
8个临床分离株和菌株NCTC 11637的混合物在蒸馏水中重悬，在涡流搅拌器中中断，并离心。以0、0.2、0.35、0.5 mol/l磷酸钠缓冲液为上清液，逐级进行离子交换层析。使用0.35 mol/l磷酸钠馏分，含有0.45 mg/ml的最终蛋白质浓度作为gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba水萃取蛋白(HPWEP)。gydF4y2Ba
MKN-28胃上皮细胞培养基的制备对HPWEP反应gydF4y2Ba
将融合的MKN-28细胞与添加10%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培养基在37℃下与HPWEP一起孵育48小时。介质以10000度离心1分钟分离gydF4y2BaggydF4y2Ba立即加入T细胞中培养24小时。在一些实验中，培养基储存在−80°C，直到细胞因子测量。gydF4y2Ba
T细胞培养和治疗gydF4y2Ba
Jurkat T细胞在添加10% FCS的完全RPMI 1640培养基中培养。人外周血T淋巴细胞(11gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba未感染的健康男性志愿者，年龄31-45岁)使用顺磁珠(Dynabeads;Dynal, Oslo, Norway)涂有抗cd3抗体。抗cd3抗体免疫染色显示，该方法分离的细胞95%为外周T细胞，与之前报道的结果一致。gydF4y2Ba18gydF4y2BaJurkat和外周T细胞分别用以下每一种刺激:MKN-28细胞培养基，PMA (20 ng/ml;Sigma, St Louis, Missouri, USA)，固定化抗cd3抗体(0.3 μg/ml;Neo marker, Fremont, California, USA)，重组人单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)， IL-7, IL-8和RANTES (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA) 24小时。在刺激前1小时将选择性COX-2抑制剂10 μM NS-398(日本大正制药公司)或选择性COX-1抑制剂0.03 μM SC-560(美国新泽西州法玛西亚公司)添加到外周T细胞培养基中。在一些实验中，Jurkat T细胞也用蛋白酶体抑制剂MG-132 (Peptide Institute, Osaka, Japan)预处理1小时，以防止核因子κB (NFκB)激活。gydF4y2Ba
RT-PCR和细胞因子测定gydF4y2Ba
按照总RNA分离试剂盒(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)中的说明从MKN-28细胞中分离总RNA。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)如前所述进行gydF4y2Ba19gydF4y2Ba使用表1所示的引物。在琼脂糖凝胶中，用溴化乙锭荧光法观察扩增产物。用市购的特异性酶联免疫吸附试验(ELISA)板测定HPWEP培养的MKN-28细胞培养基中MCP-1、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1α、MIP-1β、IL-7、IL-8、RANTES和IFN-γ的浓度。ELISA检测外周T细胞IL-4和IFN-γ对培养基或抗cd3抗体的反应。根据供应商提供的说明(MCP-1, MIP-1α， MIP-1β， IL-7, IL-8和RANTES(研发系统)使用板;IFN-γ和IL-4 (Endogen, Cambridge, Massachusetts, USA))。MCP-1水平也检测了胃组织样品匀浆的上清液(10000gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下浸泡15分钟)gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba胃炎和12gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba未受感染的科目。所有受试者在内镜检查前均知情同意。gydF4y2Ba
引物和探针，并选择聚合酶链反应(PCR)条件gydF4y2Ba
COX-2 mRNA定量分析gydF4y2Ba
实时定量PCRgydF4y2Ba20.gydF4y2Ba以HPWEP暴露的MKN-28细胞为介质刺激Jurkat T细胞，测量COX-2 mRNA的表达水平。简而言之，如上所述，从Jurkat T细胞中分离出的RNA在7700型序列检测器(PE应用生物合成公司，Perkin Elmer，千叶，日本)中使用引物、双标记荧光探针和Taqman PCR试剂试剂盒(Perkin Elmer, Branchburgh，新泽西，美国)中进行逆转录和随后的cDNA扩增。引物和探针如表1所示。以PCR生成的已知浓度的连续稀释COX-2和β-actin cDNA作为样本cDNA定量的标准。COX-2的cDNA拷贝数与β-actin的拷贝数标准化。gydF4y2Ba
COX-1和COX-2蛋白在T细胞中的表达及活性gydF4y2Ba
COX蛋白部分纯化，如前所述，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba用抗人COX-1抗体(稀释1:25;IBL，群马，日本)或COX-2抗体(稀释1:25;IBL)。COX酶活性测定使用粗T细胞片段，如前所述。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba用含有1.0 mmol/l苯基甲基磺酰氟和1.0 μmol/l pepstatin的100 mM Tris HCl (pH 7.8)在4℃低温下超声干扰Jurkat T细胞24小时。T细胞超声在10000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟，得到的上清液，包括微粒体和细胞质组分，用作测量COX活性的酶源。gydF4y2Ba11gydF4y2BaCOX活性表现为PGE的产生gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，通过ELISA (Assay Designs, Ann Arbor, Michigan, USA)测定pmol/min/mg蛋白。抗MCP-1中和抗体(R&D Systems)在1:1000滴定时完全抑制了Jurkat T细胞中人重组MCP-1刺激(150 pg/ml)的COX活性。因此，我们使用中和抗体以1:1000滴定法检测MKN-28介质刺激COX-2 mRNA表达和COX活性。gydF4y2Ba
改良MTT法gydF4y2Ba
人外周血T细胞增殖从11gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba使用改良的MTT法评估上述未感染的志愿者，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba一种已知对定量活细胞有用的工具。具体来说，MTT测定是一种比色测定系统，通过活细胞线粒体测定四唑组分转化为不溶性甲醛产物。简单地说,1×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba/ml T细胞在96孔板上的RPMI中培养，同时加入MKN-28细胞培养基、抗cd3抗体或MCP-1，培养24小时，然后每孔用10 μl MTT培养30分钟。加入酸化的Triton缓冲液后，反应停止。样品在Bio-Rad平板阅读器595 nm处测量。gydF4y2Ba
免疫组织化学gydF4y2Ba
从胃窦和身体获得的3个活检标本用于组织学评估。连续5 μm切片用苏木精-伊红染色，并使用更新的Sydney系统进行评估。为每位患者准备了三张载玻片，包括一个胃窦和两个身体组织标本。当三张幻灯片的评分不同时，取中值作为代表评分。每个患者的中位数用于计算平均值。gydF4y2Ba
胃粘膜COX-2免疫染色，3 μm切片脱蜡，用5% H阻断内源性过氧化物酶活性gydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba在Tris缓冲盐水(TBS)。用5%兔血清阻断TBS和抗cox -2抗体(IBL;稀释1:100)，用含1%牛血清白蛋白的TBS浸泡2小时。我们通过计数表达COX-2的单个核细胞并评估26个组织的染色强度来量化胃组织样本中COX-2的表达水平gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba胃炎和12gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba未受感染的科目。总体强度任意分级为0(阴性)，1(<5%细胞阳性染色)，2(5-30%)，3(30-60%，强染色)，4(>60%，强染色)。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba然后，在26年检查了COX-2强度和MCP-1水平之间的关系gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba胃炎的主题。在胃粘膜进行MCP-1免疫染色时，立即将组织样本包埋在OCT复合物中。连续切片用兔抗人MCP-1多克隆抗体(1:100)孵育过夜。洗涤后，以二氨基联苯胺为显色剂，使用LSAB 2试剂盒(Dako, Carpinteria, California, USA)检测结合抗体。阴性对照用同型匹配的免疫球蛋白替代一抗。gydF4y2Ba
使用双标记免疫荧光方法和共聚焦激光扫描显微镜来评估小鼠抗人COX-2 (IBL;稀释1:20)和兔抗人CD3 (Dako;稀释1:20)。切片用两种一抗的混合物在4℃下孵育过夜，然后用FITC或德州红偶联二抗(马抗鼠IgG (Vector Laboratories, Burlingame, California, USA)稀释1:100和山羊抗兔IgG (Vector)稀释1:100，分别用于COX-2和CD3)，然后用4 '，6-二氨基氨基-2-苯基吲哚(DAPI;西格玛化学公司)15分钟。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
结果以平均值(SD)表示。对于群体数据的统计评价，gydF4y2BatgydF4y2Ba对配对数据进行-检验，对多重比较进行方差分析(ANOVA)，然后进行Scheffe 's F检验。p值< 0.05有统计学意义。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
MKN-28细胞培养基刺激外周T细胞和Jurkat T细胞COX蛋白表达gydF4y2Ba
在HPWEP暴露的MKN-28细胞培养基刺激的两种T细胞中，COX-2表达(图1中的c和f通道)均明显诱导(图1A)。相比之下，在HPWEP直接刺激两种T细胞时，COX-2的表达仅为一条微弱的条带(d和g通道)，在未刺激的T细胞(e和h通道)中未检测到COX-2的表达。为了排除外周血T细胞制备过程中巨噬细胞污染导致外周血T细胞COX-2表达的可能性，我们用脂多糖(LPS) (1μg/ml)刺激外周血T细胞。然而，我们没有检测到LPS刺激外周T细胞COX-2表达(数据未显示)。受刺激和未受刺激的T细胞COX-1表达水平没有变化(图1B)。gydF4y2Ba
MKN-28细胞培养基刺激外周T细胞和Jurkat T细胞中氧化酶(COX)蛋白表达。(A) MKN-28细胞培养基刺激T细胞中COX-2蛋白的表达。COX-2在体外培养T细胞中的表达gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba水萃取蛋白(HPWEP)暴露的MKN-28细胞(c通道)，HPWEP (d通道)，以及未受到刺激的MKN-28细胞培养基(e通道)。f-h通道:与a-e通道相同，但表现为Jurkat T细胞而不是外周T细胞。a车道和b车道分别为COX-2阳性对照(70 kDa)和COX-1阳性对照(68 kDa)。(B) MKN-28细胞培养基刺激T细胞中COX-1蛋白的表达。巷a, COX-1阳性对照;通道b, COX-2阳性对照;车道c-h，如(A)，除了表示COX-1而不是COX-2表达式。每个面板代表四个独立的实验。gydF4y2Ba
COX在受刺激Jurkat T细胞中的活性gydF4y2Ba
用HPWEP孵育的MKN-28细胞培养基诱导Jurkat T细胞COX活性显著增加(图2)。直接用HPWEP刺激的Jurkat T细胞也显示COX活性小幅增加。这些结果表明，在对HPWEP的反应中，MKN-28细胞分泌参与COX-2蛋白表达和COX在Jurkat T细胞中活性增加的趋化因子。gydF4y2Ba
Jurkat T细胞中环氧合酶(COX)活性的比较。根据材料和方法测定受刺激和未受刺激Jurkat T细胞中的COX活性。刺激Jurkat T细胞gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba水提取物蛋白(HPWEP+Jurkat T细胞)、HPWEP暴露的MKN-28细胞培养基(HPWEP/MKN-28培养基+Jurkat T细胞)和20 ng/ml PMA (Jurkat T细胞+PMA)。前列腺素EgydF4y2Ba2gydF4y2Ba每个样品中生成的结果一式两份。每个值代表四个独立实验的平均值(SEM)。* p < 0.05。gydF4y2Ba
在MKN-28细胞中刺激细胞因子mRNA表达和蛋白释放到培养基中gydF4y2Ba
接下来，我们通过特异性RT-PCR检测几种细胞因子的mRNA水平(图3A)。HPWEP刺激了MCP-1、IL-7和IL-8 mRNA的表达，而RANTES mRNA的表达水平无明显变化。此外，IFN-γ， MIP-1α， MIP-1β和IP-10 mRNA在与HPWEP孵育或不孵育的MKN-28细胞中不表达。我们还通过特异性ELISA检测了MCP-1、IL-7和IL-8培养基的水平(图3B)。受刺激培养基中含有显著水平的MCP-1 (133 (6.9) pg/ml)、IL-7 (2.8 (1.2) pg/ml)和IL-8 (40.5 (14.5) pg/ml)。然而，对培养基中其他细胞因子的ELISA检测仅揭示了另一种细胞因子RANTES，且与未刺激培养基中的细胞因子水平相同(数据未显示)。western blot分析也证实了HPWEP暴露的MKN-28细胞培养基中MCP-1的存在(数据未显示)。gydF4y2Ba
细胞因子在MKN-28细胞中的mRNA和蛋白表达及其释放到培养基中。(A)单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)、白介素(IL)-7、RANTES和IL-8 mrna在gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba水萃取蛋白(HPWEP)暴露的MKN-28细胞。相反，干扰素γ (IFN-γ)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1α、MIP-1β和IP-10 mrna不表达。每个面板代表四个独立的实验。(B)按照材料和方法测定细胞因子水平。每个样本的细胞因子都是两份。数值为四个独立实验的平均值(SEM)。gydF4y2Ba
MCP-1刺激和MG-132消除了COX-2在Jurkat T细胞中的表达gydF4y2Ba
MCP-1以100 pg/ml的浓度刺激Jurkat T细胞中COX-2的表达，浓度与培养基一致(图4)。然而，MCP-1刺激的COX-2表达水平似乎低于预期，这表明其他因素也参与了COX-2在Jurkat T细胞中的表达。MG-132预处理Jurkat T细胞可以消除MKN-28细胞培养基和MCP-1刺激COX-2在Jurkat T细胞中的表达。另一方面，通过western blot分析，在MKN-28培养基中鉴定的IL-7 (5 pg/ml)、IL-8 (40 pg/ml)和RANTES (600 pg/ml)浓度并未刺激Jurkat T细胞中的COX-2表达。gydF4y2Ba
细胞因子和MG-132对Jurkat T细胞环氧合酶2 (COX-2)蛋白表达的影响A道，COX-2阳性对照;B道，COX-1阳性对照;C通道，COX-2蛋白在Jurkat T细胞中的表达gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba水萃取蛋白(HPWEP)暴露的MKN-28细胞;MG-132预处理的Jurkat T细胞中COX-2蛋白表达，然后用HPWEP刺激的MKN-28细胞培养基培养;100 pg/ml单核细胞趋化蛋白1刺激Jurkat T细胞时，COX-2蛋白表达通路E;人重组IL-8 40pg /ml (F通道)，IL-7 5pg /ml (G通道)，RANTES 600 pg/ml (H通道)刺激Jurkat T细胞，导致COX-2蛋白表达缺失。实验重复四次，所示的是一个代表性实验。gydF4y2Ba
抗mcp -1中和抗体抑制Jurkat T细胞COX-2 mRNA水平和COX活性gydF4y2Ba
用HPWEP孵育的MKN-28细胞培养基诱导Jurkat T细胞COX-2/β-actin mRNA水平显著升高(图5)。直接用HPWEP刺激的Jurkat T细胞COX-2/β-actin mRNA也显示出中度升高。抗MCP-1中和抗体(1:1000滴定法)显著抑制mcn -28培养基刺激Jurkat T细胞中COX-2 mRNA的表达，表明培养基中的MCP-1刺激了Jurkat T细胞中COX-2 mRNA的表达。然后我们研究了中和抗体是否能够抑制Jurkat T细胞中的COX活性。抗mcp -1中和抗体(1:1000滴定)在用MKN-28细胞培养基刺激的Jurkat T细胞中显著抑制COX活性38%，但更高浓度的抗mcp -1中和抗体(1:30 00滴定)没有进一步抑制COX活性(39%)。相反，正常兔血清IgG (1 mg/ml)对培养基刺激的Jurkat T细胞的COX活性没有影响。gydF4y2Ba
Jurkat T细胞中环氧合酶2 (COX-2) mRNA表达的比较。通过实时聚合酶链式反应测定受刺激Jurkat T细胞的COX-2/β-actin mRNA水平，如材料和方法所述。COX-2/β-actin mRNA水平在Jurkat T细胞孵育后升高gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba水提取物蛋白(HPWEP)或HPWEP/MKN-28培养基(如图2所示)，并被抗单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)中和抗体(HPWEP/MKN-28培养基+Jurkat T细胞+抗mcp - 1ab)预孵育抑制。每个值代表四个独立实验的平均值(SEM)。* p < 0.05。gydF4y2Ba
外周T细胞增殖gydF4y2Ba
用刺激的MKN-28细胞培养基和抗cd3抗体作为阳性对照处理的外周T细胞增殖显著增加(分别为188(6)%和308(16)%)，与单纯使用未刺激的MKN-28培养基相比。NS-398能显著抑制培养基刺激的外周T细胞增殖(157(6)%)，而SC-560不能抑制这些T细胞的增殖。重组MCP-1蛋白显著增加外周血T细胞的增殖(161(6)%)。NS-398还能显著抑制MCP-1刺激的外周T细胞增殖，而SC-560则无影响，表明MCP-1从mcn -28细胞中释放，通过COX-2激活参与T细胞增殖(图6A)。gydF4y2Ba
T细胞细胞因子的产生和增殖。(A)根据材料和方法测定活化的外周T细胞的增殖。抗cd3抗体(0.3 μg/ml)刺激外周血T细胞，gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba水提蛋白(HPWEP)/MKN-28培养基，HPWEP/MKN-28培养基+NS-398 (HPWEP/MKN-28培养基中存在10 μM NS-398)， HPWEP/MKN-28培养基+SC-560 (0.03 μM)， 100 pg/ml单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)， 100 pg/ml MCP-1+NS-398 (10 μM)， 100 pg/ml MCP-1+SC-560 (0.03 μM)。MKN-28培养基，未受刺激的MKN-28培养基处理外周T细胞。对于每一种MTT试验，样品均重复测定三次。* p < 0.05。(B)干扰素γ (IFN-γ)的产生是根据材料和方法来确定的。(C)白介素4 (IL-4)的生产按照材料和方法进行测定。每个值代表11个独立实验的平均值(SEM)。gydF4y2Ba
体外培养T细胞上清中的IFN-γ和IL-4gydF4y2Ba
外周T细胞上清液中的IFN-γ浓度对HPWEP暴露的MKN-28细胞的刺激反应显著增加(172 (15.8)pg/mg蛋白)，而IL-4浓度(2.0 (0.8)pg/mg蛋白)对刺激反应不显著增加。IFN-γ浓度对抗cd3抗体刺激的反应也有所增加(218.3 (24.8)pg/mg蛋白)，而IL-4没有反应(1.8 (0.9)pg/mg蛋白)。NS-398显著抑制这种介质刺激的IFN-γ释放(134.2 (11.2)pg/mg蛋白)，而SC-560不显著抑制IFN-γ释放(161.8 (14.1)pg/mg蛋白)。MCP-1刺激T细胞100 pg/ml后，基础IFN-γ水平(27.2 (6.2)pg/mg蛋白)没有增加(图6B)，而IL-4浓度(22.5 (1.9)pg/mg蛋白)显著增加。NS-398显著抑制MCP-1刺激的IL-4释放(14.6 (1.3)pg/mg蛋白)，而SC-560对IL-4释放没有影响(20.2 (2.5)pg/mg蛋白)(图6C)。gydF4y2Ba
胃粘膜中COX-2阳性T细胞和MCP-1阳性细胞的分布gydF4y2Ba
图7A中固有层的FITC标记(绿色)细胞显示COX-2免疫反应性。图7B显示了在同一切片上用德克萨斯红偶联抗cd3抗体标记的粘膜T细胞。COX-2和黏膜T细胞双免疫染色显示，COX-2阳性黏膜T细胞存在于大鼠固有层gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba感染的胃炎粘膜(图7C)。与此相反，血清中无COX-2阳性T细胞gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba未感染的胃炎粘膜，只有少量CD3阳性细胞(图7D)。在图7E中，我们可以看到MCP-1在表面上皮细胞中的免疫反应性，以及在一些单个核细胞中。gydF4y2Ba
环加氧酶2 (COX-2)阳性粘膜T细胞和单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)阳性细胞在胃粘膜的定位。(A) COX-2阳性细胞在固有层gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba感染性胃炎(原始放大，×150)。(B)固有层中CD3阳性细胞gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba感染性胃炎(原始放大，×150)。(C)双阳性染色(黄色细胞)显示COX-2阳性黏膜T细胞gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba感染性胃炎(原始放大，×150)。(D)双染色gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba抗cox -2抗体和抗cd3抗体(原始放大，×90)。(E)固有层中MCP-1阳性上皮细胞和单个核细胞，见图gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba感染性胃炎(原始放大，×200)。gydF4y2Ba
胃粘膜样品中MCP-1水平与COX-2表达强度的相关性gydF4y2Ba
MCP-1水平显著高于gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba感染组织样本(166.1 (32.6)pg/mg蛋白)高于未感染黏膜样本(81.6 (7.7)pg/mg蛋白)。两者之间有显著的相关性(gydF4y2BargydF4y2Ba=0.869, p<0.0001)gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba感染。我们还发现MCP-1在体外诱导了T细胞COX-2的表达，这促使我们研究MCP-1水平与COX-2表达强度之间是否存在显著关系。我们发现了显著的相关性(gydF4y2BargydF4y2Ba当定量评估COX-2表达水平时，胃粘膜样品中COX-2表达强度与MCP-1水平之间的差异=0.835,p<0.0001)(图8)。gydF4y2Ba
胃粘膜单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)水平与环加氧酶2 (COX-2)表达强度的相关性采用Pearson相关分析评估MCP-1水平与COX-2表达强度之间的相关性gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba被感染的胃炎。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
在这项研究中，我们调查了gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba诱导胃上皮细胞释放的细胞因子在T细胞COX-2的表达和激活，体外和体内。本研究中的一些证据表明，MKN-28细胞在HPWEP刺激下分泌多种细胞因子，包括MCP-1，从而诱导T细胞COX-2的表达和活性。首先，HPWEP暴露的MKN-28细胞培养基刺激了T细胞COX-2 mRNA和蛋白的表达。其次，RT-PCR和特异性ELISA结果显示，HPWEP在MKN-28细胞中表达MCP-1 mRNA，并释放MCP-1蛋白。第三，在Jurkat T细胞中，MCP-1刺激了COX-2的表达水平和COX活性，而抗MCP-1中和抗体抑制了mcn -28细胞培养基刺激的COX-2 mRNA表达和COX活性。因此，MCP-1可能在T细胞COX-2的表达中起作用。尽管迄今为止的其他研究表明IL-8gydF4y2Ba2gydF4y2Ba从胃上皮细胞释放CXC趋化因子，可能参与粘膜中性粒细胞浸润，很少有人考虑MCP-1表达，一种C-C趋化因子，在胃上皮细胞中的作用。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba据我们所知，这是第一份显示胃上皮细胞释放MCP-1与诱导COX-2表达导致T细胞激活之间关系的报告。然而，培养基刺激的Jurkat T细胞的COX活性并没有被抗mcp -1中和抗体完全抑制。这表明MKN-28细胞培养基中的其他细胞因子也参与了COX-2蛋白的表达和COX在T细胞中的活性。最近，CXC趋化因子和C-C趋化因子被证明可以作为T细胞的趋化剂，并诱导T细胞产生细胞因子。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba然而，在本研究中，我们无法在刺激介质中检测到任何MIP-1α或MIP-1β。此外，IL-7、IL-8或RANTES不能刺激Jurkat T细胞COX-2蛋白的表达。因此，除了MCP-1外，其他因素可能参与T细胞COX-2的表达。在MG-132预处理的Jurkat T细胞中，MCP-1不能刺激COX-2蛋白的表达，因此MCP-1可能通过激活NFκB来刺激COX-2的表达。gydF4y2Ba
我们还发现，用MKN-28细胞和MCP-1培养基诱导COX-2，可能在外周T细胞细胞因子的产生和增殖中发挥重要作用。NS-398是一种特异性COX-2抑制剂，无论是由培养基还是MCP-1单独刺激，都能诱导T细胞增殖的适度减少。gydF4y2Ba
在培养基诱导外周T细胞增殖的同时，IFN-γ也从外周T细胞中释放出来。这种IFN-γ的释放再次被NS-398部分抑制，这表明COX-2也参与了IFN-γ的产生，IFN-γ是一种与功能性T细胞向T辅助细胞1 (Th1)极化相关的主要细胞因子。因此，来自HPWEP暴露的MKN-28细胞的培养基似乎将T细胞向Th1方向转移。这些数据与最近的一份报告一致gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba诱导的粘膜炎症是由Th1优势介导的。gydF4y2Ba25gydF4y2Ba另一方面，MCP-1也能刺激COX-2的表达和COX-2依赖的T细胞增殖，本研究发现MCP-1能刺激外周血T细胞分泌IL-4，而对IFN-γ的分泌没有影响。这表明MCP-1单独与Th2极化有关。gydF4y2Ba26日,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba本研究的结果也与之前将MCP-1与Th2极化联系起来的研究相一致。虽然我们不知道为什么含有MCP-1的培养基不能刺激外周T细胞分泌IL-4，但培养基中的其他因素可能参与了这些细胞中IFN-γ的分泌和IL-4的抑制。另一种可能是IFN-γ下调了CD30，这是IL-4反应的标志。gydF4y2Ba28gydF4y2Ba在本研究中，我们还发现COX-2在T细胞中的表达明显与Th1和Th2极化有关。NS-398部分抑制HPWEP暴露的MKN-28细胞培养基刺激IFN-γ释放。此外，NS-398还诱导MCP-1的中度减少，培养基刺激外周T细胞增殖和IL-4的释放。因此，尽管胃上皮细胞释放的细胞因子诱导外周T细胞表达COX-2在T细胞功能中起着重要作用，但它似乎对T细胞极化没有显著影响。COX-2在T细胞激活中的作用最近已在人类中得到证实。gydF4y2Ba29gydF4y2Ba这些最近的研究表明，T细胞中的COX-2可能与Th1和Th2极化有关。gydF4y2Ba29日,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba
吉洛伊gydF4y2Ba等gydF4y2Ba也报道了在他们的模型中，COX-2可能通过产生一组替代的抗炎前列腺素来调节急性炎症的消退。gydF4y2Ba31gydF4y2Ba在Kainulainen的一项关于腹腔疾病的新研究中gydF4y2Ba等gydF4y2Ba，黏膜病变固有层可见COX-2阳性T细胞。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba在我们目前的研究中，除了体外外周T细胞COX-2表达外，我们还发现体内COX-2阳性T细胞浸润胃粘膜。综合考虑，我们建议在慢性gydF4y2BaH幽门gydF4y2BaCOX-2可能参与免疫调节反应，但其确切作用尚不明确。gydF4y2Ba
先前的研究报道MCP-1定位于结肠上皮细胞，其表达与炎症性肠病粘膜中的T细胞浸润相关。gydF4y2Ba32岁的gydF4y2Ba33gydF4y2Ba之前的一项研究使用PCR分析表明MCP-1可能在胃上皮细胞系中表达。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba我们在本研究中证实，MCP-1实际上是在HPWEP的响应下从胃上皮细胞系释放出来的gydF4y2Ba．gydF4y2Ba此外，我们首次发现MCP-1主要定位于胃上皮细胞，也部分定位于胃间充质细胞gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba感染的粘膜。MCP-1免疫反应仅限于表面上皮细胞，而在腺细胞和腺细胞中均未见MCP-1免疫反应gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba未感染的上皮细胞。这表明gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba胃炎粘膜中MCP-1的表达可能受到影响。gydF4y2Ba
这些胃炎组织样本中的MCP-1水平与COX-2表达强度密切相关，这与我们的体外研究结果一致，MCP-1刺激T细胞中COX-2表达水平的升高。这导致我们假设MCP-1从胃上皮细胞释放触发COX-2诱导和T细胞浸润gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba胃粘膜感染然而，在体内，胃上皮细胞释放的MCP-1是否真的参与了胃炎黏膜的Th2极化，目前尚不清楚。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
这项工作得到了日本教育、文化和科学部以及卫生部的部分资助。gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba