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摘要
背景:最近在丙型肝炎患者中发现了具有向肝细胞和胆道上皮分化能力的双性肝前祖细胞(卵形)。动物研究表明，肿瘤坏死因子家族的成员，包括淋巴素β (LT-β)，在肝病中调节卵形细胞增殖，但其在人类肝病中的作用尚不清楚。
目的:本研究旨在建立LT-β在丙型肝炎相关肝损伤中的作用，并提供其表达增加与卵形细胞存在相关的证据。
方法:肝活检标本取自慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染患者(n=20)。对照组肝脏样本(n=5)来自肝脏切除或移植手术。采用实时定量聚合酶链反应和免疫组化技术研究肝活检标本中LT-β的表达。
结果:在无纤维化的HCV肝和对照组中，LT-β mRNA水平相似。在门静脉纤维化的受试者中，LT-β mRNA水平比对照组肝脏水平升高2.2倍(p=0.04)。在桥接性纤维化的受试者中，LT-β mRNA水平比对照组肝脏水平增加4.4倍(p=0.02)。与对照组相比，肝硬化患者的LT-β mRNA水平增加了3.3倍，与轻度肝损伤患者相比增加了2.6倍(p=0.02)。免疫组化分析表明，LT-β在卵圆细胞、炎性细胞和小门静脉肝细胞中表达。
结论:在慢性HCV感染中，在多种肝细胞类型中观察到LT-β的表达，包括卵圆形细胞。当存在纤维化或肝硬化时，LT-β的表达显著增加，提示LT-β在慢性丙型肝炎的发病机制中起作用，并可能在卵形细胞介导的肝脏再生中起作用。
- 椭圆形细胞
- 肝
- 纤维化
- 肿瘤坏死因子
- 丙型肝炎病毒
- 肝细胞癌
- 肿瘤坏死因子
- 肿瘤坏死因子受体1
- LT,淋巴毒素
- LT-β r, LT-β受体
- NFκB，核因子κB
- CDE，缺乏胆碱补充乙硫氨酸
- PCR，聚合酶链式反应
- 甘油醛-3-磷酸脱氢酶
- M2-PK, m2 -丙酮酸激酶
- 谷胱甘肽s转移酶
- LCA，白细胞共同抗原
- 增殖细胞核抗原
数据来自Altmetric.com
- 丙型肝炎病毒
- 肝细胞癌
- 肿瘤坏死因子
- 肿瘤坏死因子受体1
- LT,淋巴毒素
- LT-β r, LT-β受体
- NFκB，核因子κB
- CDE，缺乏胆碱补充乙硫氨酸
- PCR，聚合酶链式反应
- 甘油醛-3-磷酸脱氢酶
- M2-PK, m2 -丙酮酸激酶
- 谷胱甘肽s转移酶
- LCA，白细胞共同抗原
- 增殖细胞核抗原
丙型肝炎病毒(HCV)感染与慢性肝炎、纤维化、肝硬化和最终肝细胞癌(HCC)的发展有关。卵圆细胞是一种由祖细胞组成的双性肝细胞群，具有分化为肝细胞和胆道上皮的能力。它们已在慢性丙型肝炎病毒感染的人类受试者中被发现。1卵圆细胞作为兼性肝干细胞室，当成熟肝细胞的再生能力受损时，卵圆细胞被诱导增殖。2，3.卵形细胞数量与HCV感染导致的肝损伤严重程度之间有很强的相关性。1此外，在啮齿动物和人类中，卵圆细胞增殖与发生HCC的风险增加有关，特别是当肝硬化存在时。2，3.
体内研究已经确定了几种可能在肝损伤过程中介导卵圆细胞迁移、增殖和/或分化的潜在因素。4 -8肿瘤坏死因子(TNF)信号通路在卵形细胞诱导中具有重要作用。4,92-乙酰氨基芴在部分肝切除术后诱导的卵圆细胞增殖被地塞米松预处理抑制，其作用是通过抑制TNF受体1 (TNFRI)下游核因子κB (NFκB)激活介导的。9在缺乏TNFRI的小鼠中，缺乏胆碱的补充乙硫氨酸(CDE)喂养方案诱导的卵形细胞反应减弱了50%，同时增殖下降到野生型小鼠的28%。4因此，TNF信号通过TNFRI似乎是通过卵形细胞室进行肝脏再生的一个不可或缺的中介，尽管在TNFRI敲除小鼠中卵形细胞增殖没有完全消除，必须涉及其他生长因子和/或信号通路。
最近，我们报道了淋巴素β (LT-β)启动子活性可由在慢性肝损伤后的再生反应中起关键作用的细胞因子诱导。10LT-β是TNF配体和受体超家族的成员。它主要以淋巴毒素α (LT-α)的膜结合异质三聚体形式存在，其化学计量特征为LT-α1β2。11这种复杂信号仅通过LT-β受体(LT-β r)传递，对于次级淋巴样器官发生、滤泡树突状细胞发育、脾B和T细胞隔室化以及自然杀伤细胞发育至关重要。12 -16体外研究表明，LT-α1β2/LT-βR结合可转导凋亡和抗凋亡信号通路。17日,18最近的报道还表明，激活LT-β受体诱导产生趋化因子和粘附分子，这是淋巴细胞招募和运输到炎症部位所必需的。15日,19日,20.
HCV的核心蛋白与LT-βR相关，这种蛋白-蛋白相互作用调节由LT-α1β2/LT-βR相互作用引发的细胞溶解活性。21HCV核心蛋白与LT-βR的结合增强了大多数细胞类型中NFκB的激活，这反过来可能有助于HCV感染细胞的慢性持续性。21TNF超家族成员与肝脏疾病之间的关系22日-25LT-α1β2/LT-βR信号通路与HCV、21日,26促使本研究分别采用实时定量聚合酶链反应(PCR)和免疫组化技术对肝活检标本中LT-β蛋白和基因表达进行研究，以建立LT-β在丙型肝炎相关肝损伤中的表达模式。
材料与方法
肝脏标本
对20例慢性丙肝感染患者进行肝活检。根据HCV抗体阳性、HCV PCR阳性和丙氨酸转氨酶升高诊断为慢性HCV。其他肝脏疾病经标准病理检查排除。使用改良的Knodell系统对不同程度的肝损伤进行评分。27非纤维化肝损伤5例(n=5)评分为0分;门脉纤维化(n=5)评分1-2分;桥接性纤维化(n=5)评分3-5分;肝硬化(n=5) 6分。对照组肝脏样本为正常组织，分别来自(1)因继发性恶性肿瘤而接受肝切除术的患者(本身没有潜在肝脏疾病)或(2)移植时的供肝。部分活检组织(约3毫米)在液氮中快速冷冻，并在RNA提取之前保存在−80°C。其余组织用10%缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，进行病理检查和免疫组化。该研究已获得弗里曼特尔医院人类研究伦理委员会的批准。
实时荧光定量PCR分析
根据制造商说明书，使用RNasol B (Bresatec, USA)从肝脏标本中提取RNA。利用Thermoscript逆转录系统(Invitrogen, USA)和oligo-dT从1 μg总RNA合成cDNA。根据制造商说明书，使用FastStart DNA Master SYBR Green I试剂盒(Roche, USA)进行PCR。每个20 μl PCR反应含有0.5 μM引物，3 mM (LT-β)或4 mM(甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)) MgCl2，加2 μl cDNA模板。用于扩增LT-β和GAPDH的PCR引物(Invitrogen, USA)为:LT-β正向引物AAGCTGCCAGAGGAGGAGCC, LT-β反向引物TCCCGCTCGTCAGAAACGC;GAPDH正向引物TGCCCCCTCTGCTGATGCC, GAPDH反向引物CCTCCGACGCCTGCTTCACCAC。使用LightCycler (Roche, USA)进行实时定量PCR。FastStart Taq聚合酶在95°C预孵育2分钟后被激活，然后在95°C, 0秒的条件下循环40次;60°C, 5秒;72°C, 7秒。在72°C延长期后，在86°C测量荧光，以区分特异性PCR产物和引物-二聚体。LT-β mRNA的表达水平通过与外部DNA标准品(由LT-β引物扩增的人类LT-β基因组克隆扩增的纯化PCR产物的10倍连续稀释)进行比较，以任意单位确定。GAPDH mRNA的表达水平通过与GAPDH引物扩增的外部DNA标准品(从人类基因组DNA扩增的纯化PCR产物的10倍连续稀释)进行比较，以任意单位确定。 LT-β was normalised relative to GAPDH to control for variation in the reverse transcription step. Results were analysed according to the Mann-Whitney test. Data are expressed as mean (SEM). A p value of <0.05 was considered significant. PCR product specificity was confirmed by melting curve analysis and 2% agarose gel electrophoresis.
小鼠不同肝细胞类型LT-β mRNA表达的检测
为了明确证明LT-β在不同肝细胞类型中的表达，BDF-1小鼠给予CDE饮食4周以诱导卵形细胞增殖。4如前所述，通过离心洗脱进行肝细胞分离，以生成卵形细胞、CDE处理的肝细胞、正常肝细胞和炎症细胞样本。4RNA如前所述被分离。4根据制造商的说明，使用Riboquant多探针RNA酶保护检测系统和mCK-3b多探针模板在20 μg目标RNA中检测和定量LT-β和GAPDH的表达。使用FujiImager (Fuji, Japan)对受保护的产品进行可视化。根据澳大利亚国家卫生和医学研究委员会制定的指导方针，所有动物都得到了人道的照顾。
免疫组织化学
用石蜡包埋的组织标本制备切片(4 μm)。对m2 -丙酮酸激酶(M2-PK)切片进行微波抗原提取(700w 1分钟，70w 14分钟，室温1mm EDTA 15分钟，pH 8.0)。LT-β染色切片用蛋白酶消化(VIII型;Sigma，美国)在37°C下加热4分钟。1采用三步间接法进行免疫组化，并采用液体DAB (Dako, USA)检测。表达LT-β的细胞使用小鼠抗人LT-β (B27克隆，稀释1:50，来自美国Biogen公司Jeffrey Browning博士的礼物)进行鉴定。通过表达M2-PK(稀释后1:50;ScheboTech，德国)和π-谷胱甘肽s -转移酶(GST，稀释1:400;美国NCL)。这些抗体先前已被证明可以在人类活组织检查中染色卵形细胞。1浸润的CD45阳性炎症细胞通过白细胞共同抗原(LCA，稀释1:50;美国Dako)。通过表达增殖细胞核抗原(PCNA，稀释1:100;Dako)。
结果
慢性HCV感染患者肝脏LT-β mRNA水平升高
在所有研究的活检标本中都检测到LT-β mRNA(图1A)。在对照组肝脏样品中观察到低水平的LT-β mRNA表达。对照组和非纤维化肝损伤组的LT-β mRNA水平无显著差异。在门静脉纤维化的受试者中，LT-β mRNA水平比对照组肝脏水平升高2.2倍(p=0.04)。在桥接性纤维化的受试者中，LT-β mRNA水平比对照组肝脏水平增加4.4倍(p=0.02)。与对照组相比，肝硬化患者的LT-β mRNA水平增加3.3倍，与轻度肝损伤患者相比增加2.6倍(p=0.02)。这些数据表明，当存在纤维化或肝硬化时，LT-β mRNA水平升高。
(A)慢性丙型肝炎患者肝脏淋巴素β (LT-β) mRNA表达水平随纤维化和肝硬化显著升高。对照组肝脏(n=5)与非纤维化肝损伤受试者(n=5)之间无显著差异。在门静脉纤维化(n=5)和桥接纤维化(n=5)的受试者中，LT-β mRNA水平分别比对照肝脏高2.3倍和4.4倍。与对照组相比，肝硬化组(n=5) LT-β mRNA水平增加3.3倍。结果以均值(SEM)表示(*p=0.04， **p=0.02)。(B)对肝细胞、卵形细胞和分离自小鼠的炎症细胞中提取的RNA进行核糖核酸保护分析，这些小鼠接受了四周缺乏胆碱的乙硫氨酸补充(CDE)饮食。LT-β mRNA由卵圆细胞(O)和炎症细胞(IC)表达。在正常肝细胞(H)和cde处理的肝细胞(CD-H)中均未检测到LT-β mRNA。甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
卵形细胞表达LT-β
由于发现LT-β表达随着纤维化和肝硬化而增加，我们开始鉴定能够表达LT-β的肝细胞类型，以确定卵形细胞是否与表达增加有关。由于不能从小型人类肝脏活检中分离出足够的卵形细胞，因此使用卵形细胞介导的小鼠肝脏再生模型。对从接受CDE饮食4周的小鼠的肝细胞、卵形细胞和炎症细胞中提取的RNA进行核糖核酸酶保护分析。离心洗脱分离细胞，收集炎症细胞和卵圆细胞组分。卵形细胞部分进一步纯化，以去除任何污染的炎症细胞。4纯化后，椭圆细胞组分中的炎症细胞污染降低至0.96(0.25)%。炎症细胞部分未见卵圆细胞。在卵形细胞中检测到高表达的LT-β mRNA，在炎症细胞中检测到低水平的表达(图1B)。在正常和CDE处理的肝细胞中检测不到LT-β mRNA(图1B)。
HCV感染肝脏中LT-β表达的细胞定位
在连续切片上进行免疫组化，以确定LT-β在中度纤维化HCV感染肝脏中的组织分布(图2A-F)。丙型肝炎病毒感染期间出现以门静脉三联管周围血管袖结为特征的慢性免疫反应(图2A)。根据LCA (CD45)表达，浸润门脉三联征周围区域的大量小细胞为白细胞(图2B)。这些白细胞大多没有增殖，因为它们是PCNA阴性(图2E)，似乎没有进行克隆扩增。在炎性细胞团的外围，通过椭圆细胞标记物π-GST(图2C，小箭头)和M2-PK(图2D，小箭头)的形态和表达来鉴定椭圆细胞。
免疫组化染色显示人丙型肝炎病毒(HCV)感染的肝桥接纤维化中淋巴素β (LT-β)的细胞定位。(A-F)苏木素和伊红(H&E)、白细胞共同抗原(LCA) (CD45)、π-谷胱甘肽s转移酶(GST)、m2 -丙酮酸激酶(M2-PK)、增殖细胞核抗原(PCNA)和LT-β序列染色提示HCV感染肝脏的卵圆形细胞表达LT-β。(A) H&E染色显示慢性丙型肝炎淋巴细胞对门静脉周围的袖扣。门静脉标记为(pv)。(B) LCA (CD45)表达提示门静脉周围聚集的大量小细胞CD45阳性。通过π-GST (C)和M2-PK (D)的表达鉴定出该区域外围的卵圆形细胞(小箭头)。(E)门静脉周围聚集的小细胞为PCNA阴性，卵圆形细胞(小箭头)为弱PCNA阳性，位于中心的大肝细胞(大箭头)为强PCNA阳性。(F) LT-β表达局限于炎性细胞团的外围，这表明大多数LCA阳性细胞不表达LT-β。表达LT-β的细胞类型包括小门静脉肝细胞(大箭头)、卵圆细胞(小箭头)和炎症细胞(箭头)。胆管和大肝细胞阴性。(G)慢性丙型肝炎、门脉纤维化患者的淋巴细胞对门静脉周围的袖结。此区域内有LT-β阳性卵形细胞(小箭头)和邻近门静脉的小肝细胞，膜质和细胞质LT-β染色(大箭头)。 LT-β expression is observed in some inflammatory cells (arrowhead). (H) Chronic hepatitis C with cirrhosis shows similar LT-β staining patterns, with oval cells (small arrows) and some inflammatory cells (arrowhead) staining positive for LT-β. Hepatocytes adjacent to fibrous septae also express LT-β (large arrow). Magnification bars represent 100 μm.
在正常肝脏的组织学切片中未检测到LT-β蛋白(数据未显示)。然而，在慢性丙型肝炎受试者中，观察到LT-β蛋白(图2F - h)，集中在炎症细胞团的周围(图2F)。具体来说，在卵圆细胞(图2F-H，小箭头)、小门静脉肝细胞(图2F-H，大箭头)和一些炎症细胞(图2F-H，箭头)中观察到LT-β。卵圆细胞以其特有的卵圆形状和嗜碱性核为特征，分布于炎性细胞团周围;椭圆细胞标记π-GST(图2C，小箭头)和M2-PK(图2D，小箭头)表达的区域。炎症细胞通过密集染色的不规则核来识别。肝纤维化患者肝脏中LT-β染色更广泛，纤维间隔附近的肝细胞(图2H，大箭头)表达LT-β。
值得注意的是，小的LT-β阳性肝细胞呈膜质和细胞质LT-β染色(图2F, G，大箭头)，这与先前的报道一致，LT-β作为一种与LT-α相关的细胞表面结合蛋白存在。炎症病灶周围的卵圆形细胞呈弱PCNA阳性(图2E，箭头)，中心位置的大肝细胞呈强PCNA阳性，表明两种细胞类型都在增殖。然而，小肝细胞PCNA呈阴性。由于非增殖的小LT-β阳性肝细胞的门脉位置，这些肝细胞可能是由LT-β阳性卵形细胞分化而产生的。
讨论
LT-β信号转导的生物学意义仍然集中在它在淋巴系统中的作用，尽管LT-β r在非淋巴细胞类型中的表达表明它在免疫功能和发育之外的作用。19在本研究中，我们首次在HCV感染的肝脏中检测到LT-β。LT-β蛋白在多种肝细胞中均有表达，包括卵圆细胞、小肝细胞、部分炎症细胞，可能还包括窦内皮细胞和血管内皮细胞。大部分LT-β阳性细胞在早期纤维化状态下分布于门静脉管束浸润周围，随着纤维化程度的增加，沿纤维化间隔向中心区域扩展。
我们在慢性肝损伤动物模型中观察到由CDE饮食诱导的卵形细胞中LT-β水平升高(未发表数据)。实验同时使用了T细胞系10或卵形细胞衍生系表明TNF可诱导人LT-β启动子的基础活性(制备中的手稿)。在TNFRI敲除小鼠中卵形细胞反应受损表明TNF与TNFRI的相互作用是卵形细胞增殖的整体中介。4由于TNF/TNFRI信号也与部分肝切除术后的肝再生有关，28日,29在部分肝切除术后的再生反应中，卵形细胞室没有被招募，因此下游信号通路的分化必然发生。TNF信号通路也可能激活卵形细胞中的LT-β信号通路，从而提供区分卵形细胞介导的肝再生与肝细胞介导的肝再生所必需的发散信号。通过观察，通过PCNA表达鉴定的增殖卵形细胞位于表达LT-β的小型非增殖肝细胞附近，这支持了这一点。这些肝细胞是由LT-β阳性卵形细胞分化而产生的可能性是目前研究的重点。
炎症细胞中LT-β的表达与以往的研究结果一致。30.慢性HCV感染的一个特征是炎性浸润组织到含有B细胞、T细胞和树突状细胞的淋巴滤泡中，为淋巴细胞募集和保留到慢性HCV感染部位提供微环境。31这些淋巴滤泡的产生机制类似于次级淋巴器官发生，其中LT-α1β2/ LT-βR信号是必不可少的。32淋巴细胞募集和保留的一个要求是粘附分子和趋化因子的表达。在肝脏中，炎症与已知由LT-β诱导的粘附分子和趋化因子的表达相关，包括干扰素γ诱导蛋白10、RANTES(活化调节，正常T细胞表达和分泌)、白介素8、单核细胞趋化蛋白1和巨噬细胞炎症蛋白1α。33 -35因此，我们在门静脉浸润周围细胞中发现的LT-β表达支持了LT-α1β2/ LT-β r相互作用在慢性HCV感染期间细胞运输中的作用。
在需要细胞运动的事件中，趋化因子在吸引细胞中的作用似乎是一种普遍机制，各种趋化因子参与炎症细胞归巢到损伤部位，炎症在与卵形细胞浸润相关的病理中表达。34岁,35这些趋化因子可能在卵圆细胞介导的肝脏再生过程中负责卵圆细胞的募集和迁移。鉴于最近的研究发现，骨髓是卵形细胞前体的来源，卵形细胞前体迁移到肝脏以促进肝脏再生，36 -39LT-β可能在介导趋化因子表达导致肝脏再生中起核心作用。
炎症细胞中LT-β的表达可能导致肝脏中LT-β mRNA表达的增加，但不能完全解释。肝脏LT-β mRNA水平升高并不是丙型肝炎所特有的，因为在遗传性血色病患者中也观察到其水平升高，但通常没有观察到炎症(未发表的数据)。然而，卵形细胞以前曾在遗传性血色素沉着症受试者的肝脏中报道过。1在丙型肝炎和遗传性血色素沉着症中，卵圆细胞数量随纤维化和肝硬化显著增加。1这项研究表明，卵圆细胞数量的增加与存在纤维化和肝硬化时观察到的LT-β mRNA水平的增加平行，进一步支持了LT-β在卵圆细胞介导的肝脏再生中的作用。
我们的结论是，在慢性HCV感染的多种肝细胞类型上观察到LT-β的表达，主要是卵形细胞。当存在纤维化或肝硬化时，LT-β基因表达和卵形细胞数量增加，提示LT-β在慢性丙型肝炎的发病机制中起作用，可能是卵形细胞介导的肝脏再生。LT-α很可能发挥类似的作用，因为它总是与LT-β作为三聚体相关。
致谢
这项研究得到了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会、西澳大利亚癌症基金会和雷恩医学研究基金会的支持。E Croager博士是希利博士后研究奖学金的获得者。我们感谢Jeffrey Browning博士提供的小鼠抗人LT-β抗体。