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条文本gydF4y2Ba

菜单条gydF4y2Ba
肝gydF4y2Ba
实验性胆管炎大鼠肝T淋巴细胞糖皮质激素受体下调gydF4y2Ba
免费的gydF4y2Ba
  1. K TjandragydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  2. T勒gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  3. M G SwaingydF4y2Ba
  1. 胃肠研究组，卡尔加里大学，加拿大阿尔伯塔省卡尔加里T2N 1N4gydF4y2Ba
  1. 通信:gydF4y2Ba
    M G Swain博士，胃肠研究组，健康科学中心，3330医院路西北，加拿大艾伯塔省卡尔加里T2N 1N4;gydF4y2Ba
    求爱者在{}ucalgary.cagydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

背景与目的:gydF4y2Ba原发性硬化性胆管炎是一种Th1细胞因子驱动的疾病，对糖皮质激素治疗的临床反应性较差。我们之前已经在胆汁淤积大鼠中发现循环糖皮质激素水平升高，并且在胆管炎大鼠模型中发现Th1细胞因子干扰素γ (IFN-γ)的肝脏表达增加。因此，我们研究了胆管炎大鼠模型中循环糖皮质激素水平、肝脏IFN-γ表达和肝T细胞糖皮质激素受体(GR)表达之间的关系，以深入了解胆管疾病中肝T细胞糖皮质激素耐药的可能机制。gydF4y2Ba

方法:gydF4y2Ba采用口服低剂量α-异硫氰酸钠(ANIT)诱导雄性sd大鼠胆管炎。第14天，处死ANIT喂养大鼠和对照组大鼠，采集血清，通过逆转录聚合酶链反应和western blotting检测肝、脾和外周血T淋巴细胞中GR的表达。gydF4y2Ba

结果:gydF4y2BaANIT喂养的大鼠循环糖皮质激素水平明显升高。与对照组相比，经ANIT处理的大鼠肝脏T淋巴细胞GR mRNA和蛋白水平显著降低。相比之下，两组脾脏和循环T淋巴细胞中GR mRNA和蛋白的表达相似。此外，ANIT喂养大鼠肝脏T细胞GR表达降低与肝脏CD4降低相关gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞对地塞米松抑制作用的敏感性(即抑制白介素2受体的表达)。gydF4y2Ba

结论:gydF4y2Ba我们得出结论，实验性胆管炎大鼠肝脏T淋巴细胞对内源性糖皮质激素水平升高的抵抗，部分是由GR表达降低介导的。gydF4y2Ba

  • 肝细胞因子gydF4y2Ba
  • 原发性硬化性胆管炎gydF4y2Ba
  • 糖皮质激素的敏感性gydF4y2Ba
  • PSC，原发性硬化性胆管炎gydF4y2Ba
  • ,白介素gydF4y2Ba
  • IL-2R, IL-2受体gydF4y2Ba
  • 干扰素,干扰素gydF4y2Ba
  • 脱氢表雄酮、脱氢表雄酮gydF4y2Ba
  • IBD，炎症性肠病gydF4y2Ba
  • GR，糖皮质激素受体gydF4y2Ba
  • PBC，原发性胆汁性肝硬化gydF4y2Ba
  • 雕像,α-naphthylisothiocyanategydF4y2Ba
  • PBS，磷酸盐缓冲盐水gydF4y2Ba
  • FITC，异硫氰酸荧光素gydF4y2Ba
  • PE、藻红蛋白gydF4y2Ba
  • RT-PCR，逆转录聚合酶链反应gydF4y2Ba
  • 肿瘤坏死因子gydF4y2Ba
  • 荧光激活细胞分选器gydF4y2Ba
  • ConA，刀豆蛋白AgydF4y2Ba
  • 朝鲜，自然杀手gydF4y2Ba
  • 甘油醛-3-磷酸脱氢酶gydF4y2Ba
  • PBMC，外周血单个核细胞gydF4y2Ba

http://dx.doi.org/10.1136/gut.52.9.1363gydF4y2Ba

数据来自Altmetric.comgydF4y2Ba

    请求的权限gydF4y2Ba

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    原发性硬化性胆管炎(PSC)是一种慢性胆汁淤积性肝病，其特征是胆道的闭塞性炎症性纤维化，慢慢发展为肝硬化和肝衰竭。gydF4y2Ba1 -gydF4y2Ba3.gydF4y2BaPSC的病因尚不清楚，因此对这种疾病的适当治疗对临床医生来说仍然是一个巨大的挑战。PSC是一种假定的自身免疫性疾病，与主要的肝脏Th1细胞因子的发展有关。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba最近，我们证明了大鼠实验性胆管炎与Th1肝细胞因子谱的逐步发展有关，特别是通过肝CD4阳性淋巴细胞过度生产干扰素γ (IFN-γ)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba

    糖皮质激素已被证明可以抑制Th1细胞因子的产生。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba相反，一种主要的肾上腺激素脱氢表雄酮(DHEA)已被证明能增强Th1细胞因子的产生，如白介素(IL)-2和IFN-γ。gydF4y2Ba7，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba因此，在慢性胆管炎等炎症过程中，内源性类固醇环境可能在控制细胞因子微环境中起重要作用。此外，我们之前已经证明了由于胆管结扎导致的慢性胆汁淤积大鼠循环糖皮质激素水平升高。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba

    虽然皮质类固醇通常用于治疗炎症性疾病(例如，炎症性肠病(IBD)和哮喘)，但一些患者对这些药物的免疫抑制作用无反应，被称为“类固醇耐药”。尽管有证据表明糖皮质激素受体(GR)缺陷可能导致所观察到的现象，但这种激素抵抗的机制尚不完全清楚。gydF4y2Ba10 -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba有趣的是，在慢性胆汁淤积性肝病中，如PSC和原发性胆汁性肝硬化(PBC)，单独或联合其他药物治疗似乎对这些假定的免疫介导疾病无效。gydF4y2Ba14 -gydF4y2Ba16gydF4y2Ba然而，尚不清楚这些患者对类固醇治疗的不良反应是否是糖皮质激素抵抗的具体原因。gydF4y2Ba

    本研究的目的是确定实验性胆管炎大鼠循环内源性糖皮质激素水平是否增加，如果是的话，确定肝脏Th1细胞因子谱的发展是否由于胆管炎时肝脏T淋巴细胞的变化，这可能使它们对糖皮质激素的反应降低。gydF4y2Ba

    材料与方法gydF4y2Ba

    慢性胆管炎动物模型gydF4y2Ba

    雄性sd大鼠诱导实验性胆管炎(200-250 g;Charles River, St Constant, Quebec, Canada)通过长期口服低剂量α-萘异硫氰酸酯(ANIT 1 mg/kg粉状鼠粮;Sigma Chemicals，圣路易斯，密苏里州，美国)如上所述。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba对照组和ANIT治疗组的大鼠都被关在一个光照控制的房间里(12小时光照/12小时黑暗周期)，并按照加拿大动物护理委员会的指导方针进行治疗。每天对大鼠进行两次处理，以避免处理压力并保持较低的基线血清皮质类固醇水平。在ANIT治疗后14天处死动物，收集截尾血以检测血清类固醇水平，并对肝脏进行灌注和去除以检测细胞因子蛋白表达。还进行了测定血清皮质酮动力学的实验:(i)在ANIT给药后4天和7天也测量了血清皮质酮水平;(ii)根据Sarlis和同事的研究，在对照组大鼠和接受ANIT治疗的大鼠中检测了皮质酮的日变化。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba在上午(上午8点至9点之间)和晚上(下午7点至8点之间)采集大鼠截尾血。gydF4y2Ba

    血清皮质酮和脱氢表雄酮水平gydF4y2Ba

    对照大鼠和ANIT治疗大鼠的血清皮质酮(啮齿动物中发现的主要肾上腺糖皮质激素)和脱氢表雄酮水平使用市售放射免疫测定法测定。分别为美国加利福尼亚州科斯塔梅萨和美国德克萨斯州韦伯斯特诊断系统实验室公司)。gydF4y2Ba

    肝脏细胞因子水平gydF4y2Ba

    对照组和ANIT处理大鼠的肝脏灌注冰冷磷酸盐缓冲盐水(PBS;pH 7.4)，并提取细胞因子蛋白表达如前所述。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba肝Th1 (IFN-γ)和Th2 (IL-4)细胞因子通过市售ELISA试剂盒定量(Medicorp, Montreal, Quebec, Canada)。gydF4y2Ba

    肝T淋巴细胞分离gydF4y2Ba

    如前所述，分离肝淋巴细胞。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba采用肝淋巴细胞检测GR mRNA/蛋白表达及细胞表面标志物。从对照组和ANIT处理大鼠的脾脏和外周血中分离T淋巴细胞，并稍加修改。取脾脏，切碎，PBS均质。然后用30微米尼龙网(Small Parts Inc.)过滤脾脏匀浆。细胞悬液在淋巴大鼠(Cedarlane, Hornby, Ontario, Canada)上分层，并在1400时离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在室温下放置30分钟。在含有抗凝血剂(0.14 mol/l柠檬酸、0.2 mol/l柠檬酸钠和0.22 mol/l葡萄糖)的无菌管中采集外周血，1400时离心gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。这些颗粒在PBS中重新悬浮到收集到的原始体积的两倍。然后将细胞悬液分层于淋巴哺乳动物(Cedarlane)上，并在800℃下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在室温下放置30分钟。从界面层采集脾脏和外周血T淋巴细胞，清洗，计数。纯化的T淋巴细胞要么立即使用，要么储存在−70°C。gydF4y2Ba

    流式细胞术gydF4y2Ba

    为了确定对照和ANIT处理动物分离的肝源淋巴细胞的细胞表型和分布，我们对这些细胞进行了常见表达的特异性细胞表面标记，并通过流式细胞术进行分析。简单地说，分离的肝淋巴细胞(10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba用10 μl异硫氰酸荧光素(FITC)偶联小鼠抗大鼠CD4细胞(克隆W3/25;Serotec Inc.， Raleigh, New Jersey, USA)，小鼠抗大鼠CD8(克隆MRC OX-8;，小鼠抗大鼠单核/巨噬细胞(克隆ED1;或小鼠抗大鼠B细胞白细胞共同抗原(克隆MRC OX-33;Cedarlane)。用藻红菊酯(PE)标记小鼠抗大鼠NKR-P1A细胞表面标记物(克隆10/78;Pharmingen, Mississauga, Ontario, Canada)，它们与FITC偶联抗cd4或抗cd8单克隆抗体一起标记(见上文)。小鼠FITC (Serotec)和PE (Pharmingen)偶联IgG1阴性同型对照也包括在分析中。孵育后，细胞在PBS中洗涤两次，并在0.2 ml 1%福尔马林的PBS中重新悬浮。固定细胞在4°C下储存一夜，第二天用流式细胞仪分析(Becton-Dickinson, Mountain View, California, USA)。 Cells were counted using an electronic gate set on the lymphocyte cluster on the forward and side scatter plot and analysed using CellQuest software (Becton-Dickinson).

    半定量rt - pcrgydF4y2Ba

    RNA是从Trizol(分子研究中心，Inc.， Cincinnati, Ohio, USA)从各种来源(即肝脏，脾脏和外周血)分离的纯化T淋巴细胞中提取，按照制造商的方案。简单地说，分离的细胞在1毫升冰冷的Trizol中超声处理2-3分钟(Fisher声波分解器300型;Farmingdale, New York, USA)和RNA通过加入0.2 ml氯仿提取。12 000离心后gydF4y2BaggydF4y2Ba将水相转移到Eppendorf管中，在0.5 ml异丙醇中沉淀15分钟。12 000进一步离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下处理15分钟，得到RNA颗粒，用1毫升75%的乙醇清洗，并在7500的温度下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba五分钟。将颗粒空气干燥并溶解在焦碳酸二乙基处理过的水中(Research Genetics, Burlington, Ontario, Canada)，并在−70°C保存。使用Gene Quant分光光度计(Pharmacia, Piscataway, New Jersey, USA)测定最终RNA浓度。所有试剂均来自Sigma，除非另有说明。gydF4y2Ba

    稳态T淋巴细胞GR mRNA水平测定采用前面描述的“引物下降”方法。gydF4y2Ba5，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)在Amplitron I热循环仪(Barnsted/Thermolyne, Dubuque, Iowa, USA)中进行。简单地说，通过RT反应生成互补DNA (cDNA)，方法是将2 μg样本RNA与适当的RT反应混合物预孵育，在21°C孵育10分钟，42°C孵育50分钟，95°C孵育5分钟终止反应。以新合成的cDNA 2 μl为模板，在50 μl的PCR反应混合物中进行多重PCR反应，其中1×PCR缓冲液、dATP、dGTP、dCTP和dTTP三磷酸脱氧核苷酸各80 μM，大鼠GR引物各20 pmol (307 bp;Biognostik,德国)。每个PCR循环包括94℃热变性1分钟，引物60℃退火30秒，72℃聚合1分钟。为了正确扩增，确保PCR扩增量在线性范围内，每个样品(肝脏，34个循环;脾和外周血，33个周期)。在第一个变性步骤中加入两个单位的Taq DNA聚合酶(Pharmacia)。等量内标甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH) (222 bp;见Swain和他的同事gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)通过24-26个扩增循环共扩增。PCR反应产物用含0.2 μg/ml溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳。凝胶在紫外光下可见，并使用Quantity One软件(Biorad, Hercules, California, USA)对图像进行计算机密度扫描分析。所有波段都以相对于内部标准信号的任意密度单位表示。gydF4y2Ba

    西方墨点法gydF4y2Ba

    分离T淋巴细胞GR蛋白用western blotting定量。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba简单地说，分离的T淋巴细胞在裂解缓冲液(10 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% Triton-X)中孵育，其中含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(1 mM 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟，0.04 mM bestatin, 0.014 mM E-64(反式环氧琥珀酰-l -亮氨酸胺(4-胍)丁烷)，0.022 mM leupeptin, 0.015 mM pepstatin A, 0.8 μM抑肽蛋白和1 mM原钒酸钠;σ)。每个样品的蛋白质含量使用牛血清白蛋白标准(Biorad)蛋白测定试剂盒测定。蛋白质样品用裂解缓冲液平衡，与Laemmli样品缓冲液(Biorad)混合，煮沸5分钟。将蛋白质装入孔中，在含有十二烷基硫酸钠的8%聚丙烯酰胺凝胶中分离，然后通过电泳转移到硝化纤维膜(Biorad)。膜印迹在室温下用5%脱脂牛奶阻断1小时，以防止抗体的非特异性结合，然后再与一抗(抗大鼠GR的小鼠单克隆抗体:1/200;Affinity BioReagents, Inc.， Golden, Colorado, USA)。然后用山羊抗鼠辣根过氧化物酶联二抗(1/3000;Jackson免疫研究实验室有限公司，西格罗夫，宾夕法尼亚州，美国)。暴露于产生化学发光的底物(Pierce, Rockford, Illinois, USA)后，在印迹上检测到阳性免疫反应。 GR protein band density was quantitated using computer densitometric scanning of the images with Quantity One software (Biorad).

    GR敏感性试验gydF4y2Ba

    为了确定慢性胆管炎中肝T细胞GR数量的降低是否与GR对糖皮质激素敏感性的降低有关，表面IL-2受体(IL-2R)表达(IL-2R表达是广泛使用的淋巴细胞激活标记物)gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)对肝脏CD4gydF4y2Ba+gydF4y2Ba如前所述，采用流式细胞仪测定淋巴细胞。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba简单地说，对照组和ANIT喂养大鼠的肝源淋巴细胞在添加5%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素(均来自Gibco BRL)和2 mM的RPMI 1640培养基中培养gydF4y2BalgydF4y2Ba谷氨酰胺(σ)。肝来源淋巴细胞(4×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba用刀豆素A (ConA 2.5 μg/ml;Sigma)在37°C和5% CO下放置24小时gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．然后，地塞米松(10gydF4y2Ba−7gydF4y2BaM;Sigma)或载体添加到细胞培养中，并进一步培养24小时。这种剂量的地塞米松先前已被证明在抗原诱导的小鼠脾T细胞激活过程中抑制IL-2R的表达。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba收集细胞，清洗，并用FITC标记的小鼠抗大鼠CD4双染色(克隆W3/25;血清tec)， PE偶联小鼠抗大鼠CD25 (IL-2R)单克隆抗体(克隆MRC OX-9;Serotec)。FITC和PE偶联小鼠IgG1阴性对照(Serotec)也纳入分析。gydF4y2Ba

    统计数据gydF4y2Ba

    所有数据均以均值(SEM)表示。学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba用检验比较两组间的差异。通过单向方差分析进行多项比较，然后进行Student-Newman-Keul事后检验。p值<0.05被认为是显著的。gydF4y2Ba

    结果gydF4y2Ba

    血清皮质酮和脱氢表雄酮水平gydF4y2Ba

    我们观察到，与对照动物相比，经ANIT治疗的大鼠血清皮质酮水平显著升高(图1A)。早在ANIT治疗后第4天，ANIT喂养大鼠的血清皮质酮水平就显著升高，在ANIT治疗的剩余14天内，这种升高一直保持(图2A)。相反，与对照组相比，接受ANIT治疗的大鼠血清脱氢表雄酮水平显著降低(图1B)。经ANIT处理的大鼠血清皮质酮与脱氢表雄酮的比值明显高于对照组(图1C)。对照组动物的循环皮质酮水平在上午(8-9点之间)较低，但在晚上(7-8点)显著升高(图2B)。相反，ANIT喂养大鼠皮质酮水平无日变化;血清皮质酮水平在早上升高，在晚上保持高水平。gydF4y2Ba

    图1gydF4y2Ba

    对照组和α-萘异硫氰酸酯(ANIT)处理大鼠血清皮质酮和脱氢表雄酮(DHEA)水平。数据为每组至少四只动物的平均值(SEM)。(A)皮质酮水平;(B)脱氢表雄酮水平;(C)血清皮质酮/脱氢表雄酮比值。与对照组相比，*p<0.05， ***p<0.001。gydF4y2Ba

    图2gydF4y2Ba

    (A)用α-萘异硫氰酸酯(ANIT)处理4、7和14天的对照动物和大鼠循环皮质酮水平。数据为每组至少四只动物的平均值(SEM)。***p与对照组相比<0.001;††p<0.01相比第4天和第7天。(B)对照组和ANIT喂养大鼠的早晚血浆皮质酮水平，持续14天。数据为每对照组6只大鼠的均值(SEM)，每ANIT组至少13只大鼠。与对照组AM水平相比，**p<0.01， ***p<0.001。gydF4y2Ba

    肝细胞因子谱gydF4y2Ba

    与对照组相比，ANIT处理大鼠肝脏IFN-γ水平显著升高，但相反，对照组和ANIT处理大鼠肝脏IL-4水平无显著差异(分别为图3A，图3B)。与对照组相比，ANIT处理大鼠的肝脏IFN-γ/IL-4比值显著升高，使ANIT处理大鼠的Th1肝细胞因子显著增加(图3C)。gydF4y2Ba

    图3gydF4y2Ba

    对照组和α-萘异硫氰酸酯(ANIT)处理大鼠肝脏细胞因子蛋白水平。数据为每组至少四只动物的平均值(SEM)。(A) Th1细胞因子(干扰素γ (IFN-γ))水平;(B) Th2细胞因子(白细胞介素4 (IL-4))水平;(C)肝脏Th1/Th2细胞因子比值。*p<0.05， **p<0.01。gydF4y2Ba

    肝源性淋巴细胞gydF4y2Ba

    对照组和ANIT处理大鼠纯化的肝T淋巴细胞表型和分布无显著差异。然而，从ANIT处理的大鼠中提取的肝T淋巴细胞总数大约是从对照组肝脏中提取的5倍(数据未显示)。分离的肝淋巴细胞主要为CD4(对照组32 (1)%;ANIT 32(4)%)和CD8阳性T淋巴细胞(对照74 (3)%;ANIT 68(5)%)，很少有B细胞(对照2 (1)%;ANIT 1(2)%)和单核/巨噬细胞(对照3 (1)%;Anit 9(6)%)。虽然分离的肝淋巴细胞中也有很大比例的NK细胞标记阳性(对照组62 (2)%;ANIT 70(4)%)， 90%以上的细胞也呈CD8阳性。NK阳性肝源淋巴细胞的平均百分比约为循环T淋巴细胞的10倍(数据未显示)，与其他观察结果一致。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba

    T淋巴细胞GR表达gydF4y2Ba

    与对照组相比，ANIT处理大鼠肝脏T淋巴细胞GR mRNA表达显著降低(图4，上面板)。此外，ANIT治疗大鼠肝脏T淋巴细胞GR在蛋白水平上也被下调(图4，下图)。为了确定ANIT治疗动物T淋巴细胞GR下调是否是循环糖皮质激素升高反应的普遍现象，我们研究了从脾脏和外周血中获得的肝外T淋巴细胞GR mRNA和蛋白表达。与肝T淋巴细胞相比，对照组和ANIT处理动物的脾和外周血T淋巴细胞均表现出相似的GR mRNA和蛋白水平(图5,6)。gydF4y2Ba

    图4gydF4y2Ba

    糖皮质激素受体(GR)在对照组动物和大鼠经α-萘异硫氰酸酯(ANIT)处理14天肝T淋巴细胞中的表达。通过逆转录-聚合酶链反应测定肝T淋巴细胞GR mRNA水平(上面板;N = 3-5)和western blotting检测蛋白表达(下图;n = 4)。与对照组相比，*p<0.05， ***p<0.001。甘油醛-3-磷酸脱氢酶。gydF4y2Ba

    图5gydF4y2Ba

    对照组和接受α-异硫氰酸钠(ANIT) 14 d大鼠脾脏T淋巴细胞糖皮质激素受体(GR)的表达。图上图显示脾脏T淋巴细胞GR mRNA水平(n=9)，图下图显示蛋白表达(n=4)。对照组大鼠与ANIT组大鼠的脾T淋巴细胞GR mRNA和蛋白水平相似。甘油醛-3 -磷酸脱氢酶。gydF4y2Ba

    图6gydF4y2Ba

    对照组和接受α-异硫氰酸钠(ANIT) 14 d大鼠外周血T淋巴细胞糖皮质激素受体(GR)表达。上图为循环T淋巴细胞GR mRNA水平(n= 7-8)，下图为蛋白表达(n=4)。对照组大鼠与ANIT组大鼠外周血T淋巴细胞GR mRNA和蛋白水平相似。gydF4y2Ba

    肝T细胞IL-2R表达gydF4y2Ba

    ConA体外激活肝T细胞导致对照和ANIT喂养动物中IL-2R表达上调。然而，地塞米松降低了从对照大鼠分离的活化肝T细胞中IL-2R的表达，但未能减弱ANIT处理大鼠中IL-2R的上调(图7)。gydF4y2Ba

    图7gydF4y2Ba

    白细胞介素2受体(IL-2R)在CD4表面表达的代表性点图gydF4y2Ba+gydF4y2Ba对照组大鼠和α-萘异硫氰酸酯(ANIT)处理大鼠肝淋巴细胞14天。用刀豆蛋白A (Con A)刺激新鲜分离的肝淋巴细胞，不论有无10gydF4y2Ba−7gydF4y2BaM地塞米松(Dex)。在另外两个实验中也得到了类似的结果。gydF4y2Ba

    讨论gydF4y2Ba

    糖皮质激素具有广泛的生物效应，具有强大的抗炎功能，部分原因是它们能够抑制炎症细胞因子如IL-2和IFN-γ的表达。gydF4y2Ba25gydF4y2BaTh1细胞因子在本质上是典型的促炎因子，在细胞介导的免疫中起着核心作用。增强和过度的Th1反应可能对组织有害，并且已知在几种自身免疫性疾病的发病机制中发挥重要作用。gydF4y2Ba26日—gydF4y2Ba28gydF4y2Ba尽管实验性胆管炎大鼠血清糖皮质激素水平显著升高，但我们观察到主要的肝脏Th1细胞因子分布，我们之前已经证明这是由于肝脏CD4增强了IFN-γ的产生gydF4y2Ba+gydF4y2BaT淋巴细胞。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba我们的数据表明，ANIT治疗大鼠的肝T淋巴细胞对内源性糖皮质激素的免疫调节作用不敏感。肝T淋巴细胞对糖皮质激素介导的抑制作用不敏感，预计会直接加重肝脏炎症。有趣的是，临床研究表明，皮质类固醇治疗慢性胆管疾病(如PSC和PBC)患者，无论是单独使用还是与熊去氧胆酸等其他药物联合使用，似乎都不有效。gydF4y2Ba14 -gydF4y2Ba16gydF4y2Ba

    T淋巴细胞对糖皮质激素作用的抗性已在包括哮喘和IBD在内的许多慢性炎症性疾病中得到证实。gydF4y2Ba13日,gydF4y2Ba29gydF4y2Ba在这些情况下，类固醇抗性至少部分归因于GR缺陷。在IBD患者中，与类固醇应答者和健康受试者相比，类固醇无应答者的外周血单个核细胞(pmcs) GR数显著降低。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba此外，与对照组相比，IBD患者的血清皮质醇水平升高，血清脱氢表雄酮水平较低，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba这与我们在实验性胆管炎大鼠身上的观察结果相似。我们的研究结果表明，与对照组相比，ANIT处理大鼠分离的肝T淋巴细胞GR表达降低，我们认为这直接导致这些细胞的糖皮质激素不敏感。GR下调似乎不是循环糖皮质激素升高的结果，因为从对照组和ANIT治疗大鼠的脾脏和外周血中分离出的T淋巴细胞中记录到了类似的GR表达。gydF4y2Ba

    GR的表达在不同的组织或细胞群中可能存在差异;因此，我们确保比较相似的细胞群。荧光激活细胞分选仪(FACS)对分离的肝来源淋巴细胞的分析表明，ANIT处理大鼠肝T细胞GR下调并非由于对照组和ANIT处理大鼠之间的细胞群差异，因为对照组和ANIT组显示出相似的细胞类型和分布。对照组和ANIT喂养大鼠的肝淋巴细胞主要由T细胞和NK细胞组成，单核/巨噬细胞和B细胞数量很少或可以忽略不计。在PBC和PSC患者的肝淋巴细胞中也观察到类似的现象。gydF4y2Ba31gydF4y2Ba有趣的是，我们的双染色研究显示，从对照组和ANIT处理过的动物中分离出的肝淋巴细胞中绝大多数NK阳性细胞也是CD8阳性，这与其他观察结果相似。gydF4y2Ba32gydF4y2Ba虽然NK细胞通常不表达CD3，但它们已被证明表达CD4或CD8表面标记物。在我们的研究中，对照组和ANIT治疗大鼠的肝来源淋巴细胞中NK/CD4的百分比要低得多gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞比NK/CD8细胞多gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞。虽然我们没有测量ANIT喂养大鼠外周血中NK阳性细胞的相对百分比，但我们确实在对照组大鼠中观察到低百分比的循环NK阳性细胞。NK细胞在肝脏的积累可能直接或间接地在肝脏免疫功能障碍中起作用;然而，它们在慢性胆管炎发展中的作用尚不清楚。gydF4y2Ba

    细胞对GC介导的抑制的敏感性降低可能与GR数降低和/或亲和有关。然而，GR数量的减少并不一定意味着GR功能的减少。SchlagheckegydF4y2Ba等gydF4y2Ba尽管类风湿关节炎患者PBMC中GR数量减少，但GR功能(即GC抑制淋巴细胞增殖和细胞因子释放)并未受到影响。gydF4y2Ba33gydF4y2Ba为了确定慢性胆管炎大鼠肝T细胞GR下调是否与GR功能降低有关，在地塞米松存在或不存在时，使用FACS分析分析肝T细胞ConA刺激IL-2R的表达。GCs已被证明可以抑制活化T细胞上的细胞因子受体(例如IL-2R)表达。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba在我们的研究中，地塞米松减毒ConA诱导对照大鼠肝T细胞上IL-2R的表达，但未能抑制ConA刺激的ANIT处理大鼠肝T细胞上IL-2R的表达。因此，我们的结果表明，在实验性慢性胆管炎大鼠中，肝脏T细胞GR下调似乎损害了GR功能(即抑制IL-2R的表达)。gydF4y2Ba

    ANIT喂养大鼠肝脏T淋巴细胞GR下调的机制尚不清楚。配体诱导的下调、炎症因子和细胞活化等多种因素可能影响GR的表达。已知糖皮质激素在不同水平上调节自身受体的表达(Oakley和Cidlowski对此进行了综述gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)．考虑到ANIT治疗大鼠GR下调是组织特异性的，而不是对循环糖皮质激素水平升高的反应的泛化效应，ANIT治疗大鼠肝脏T淋巴细胞GR下调似乎不太可能仅仅是由于糖皮质激素介导的受体表达的自我调节。gydF4y2Ba

    近年来，许多细胞因子已被证明可以调节GR数和/或亲和力，从而促进糖皮质激素抵抗。金gydF4y2Ba等gydF4y2Ba表明与IL-2和IL-4一起孵育的人pmcs导致GR亲和力下降，而GR数量没有变化。gydF4y2Ba35gydF4y2Ba然而，IL-2和IL-4不太可能在ANIT喂养大鼠肝脏T细胞GR表达降低中起重要作用，原因有二。首先，这些细胞因子似乎并没有导致GR数的减少。gydF4y2Ba35gydF4y2Ba其次，经ANIT治疗的大鼠肝脏IL-4水平与对照组大鼠无差异。然而，其他细胞因子可能在调节慢性胆管炎大鼠肝T细胞GR表达中发挥作用。gydF4y2Ba

    此外，用佛波酯和细胞因子肿瘤坏死因子α (TNF-α)刺激免疫细胞已被证明可以调节细胞GR数。gydF4y2Ba36 -gydF4y2Ba38gydF4y2Ba然而，我们发现脾T细胞与TNF-α或磷-12-肉豆汤酸13-乙酸盐孵育48小时后，细胞GR数并未降低(Tjandra K，未发表数据)。gydF4y2Ba

    总之，肝T淋巴细胞对循环糖皮质激素升高的抵抗在实验性胆管炎大鼠中发生。在该模型中，类固醇抵抗的机制可能至少部分归因于肝T淋巴细胞GR的下调。肝T细胞GR下调在ANIT诱导的实验性胆管炎中是组织特异性的，似乎与循环糖皮质激素水平无关。目前，实验性胆管炎期间肝脏T淋巴细胞GR下调的机制尚不清楚，但在治疗这些疾病方面具有明显的潜在临床意义。我们的发现至少可以部分解释为什么慢性胆管炎患者在临床上对糖皮质激素治疗没有反应。gydF4y2Ba

    致谢gydF4y2Ba

    这项研究得到了加拿大肝脏基金会的资助。MGS是阿尔伯塔省传统基金会医学研究学者。gydF4y2Ba

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