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摘要
背景:非血红素铁的吸收主要发生在十二指肠。它涉及二价金属转运蛋白1 (DMT1)在铁(II)铁的吸收和基外侧转运蛋白铁转运蛋白/IREG-1/MTP-1/SLC40A1在其释放。转运铁素是否在肠上皮细胞的其他部位参与这一过程尚不清楚。在这项研究中，在肠样细胞(IEC-6和Caco-2)和新分离的大鼠十二指肠肠上皮细胞中评估了转运铁阻断抗体对铁摄取和释放的影响。
方法:在抗体存在的情况下，研究了细胞对1 μM Fe(II)的吸收和释放。通过western blot检测十二指肠黏膜富集的微绒毛膜、Caco-2细胞、IEC-6细胞和新鲜分离的肠细胞中铁转运蛋白的表达。对体铁储量变化大鼠十二指肠冷冻切片进行免疫荧光检测铁蛋白。
结果:所有类型的细胞均表达铁转运素。在这些细胞中，抗体显著降低(p<0.05)铁(II)的摄取40-50%，但对铁的释放没有影响。在Caco-2细胞中，只有当抗体与根尖膜接触时，Fe(II)的摄取才会减少。微绒毛膜制剂中含有丰富的转运铁蛋白。在缺铁大鼠肠上皮细胞中，运铁蛋白沿其与乳糖酶共定位的刷状边界表达。在基底细胞质和沿基底外侧膜可见运铁素。铁负荷显著降低细胞内转运蛋白的表达。在Caco-2细胞中，转运蛋白也定位于微绒毛、侧膜和基底膜。
结论:除了释放外，转运蛋白可能通过调节DMT1的活性，在根尖膜上对铁的吸收中起作用。
- 铁
- 流出
- 肠
- 吸收
- 运输
- 二价金属转运体DMT1
- 金属转运蛋白1
- Fe(II)，亚铁
- IEC-6，肠上皮细胞系6
- BSS，缓冲盐溶液
数据来自Altmetric.com
铁是一种必需的微量元素，是许多细胞功能所必需的，但有能力产生活性氧，可以损害组织。1因此，需要摄入足够的铁来维持个人的代谢需求。铁供应与人体铁需求的匹配发生在十二指肠肠细胞铁吸收的水平上，但尽管进行了广泛的研究，铁吸收机制的许多细节和调节铁吸收的因素仍然不清楚。
最近的研究描述了铁转运蛋白二价金属转运蛋白1 (DMT1)。2，3.转运蛋白/ irg -1/金属转运蛋白1 (MTP1)/SLC40A14 -6分别在肠上皮细胞的顶端和基底外侧膜上矢量移动铁。DMT1在肠上皮细胞的根尖膜上表达，在胃分泌物提供的质子梯度的存在下，DMT1将亚铁(Fe(II))从根尖膜共转运到细胞内。2，7，8此外，在小细胞贫血小鼠和贝尔格莱德大鼠中，DMT1的G185R突变极大地损害了铁从肠腔的摄取，这表明DMT1在铁摄取中的重要性。3.9 -11
相反，转运铁蛋白/IREG-1/MTP1/SLC40A1，以下统称为转运铁蛋白，主要沿十二指肠肠细胞基底外侧表面表达，提示其在铁释放中起作用。5，12支持这一点的是，表达系统表明，在氧化铁酶铜蓝蛋白存在的情况下，转运铁蛋白参与了铁的输出4 -6或apotransferrin5但另一些人在没有这些化合物的情况下表现出释放。4此外，在HEK293T细胞中过表达的铁转运蛋白减少了铁蛋白的合成，增加了铁反应蛋白的活性，结果与通过增加释放而消耗细胞铁水平一致。4此外，单独的研究报告了三种涉及铁转运蛋白的突变，导致了类似血色沉着的表型。其中两个是导致N144H的错义突变13和A77D14第三个是缬氨酸的缺失。15目前尚不清楚转运蛋白的功能是丧失还是获得16但受影响的个体表现为网状内皮系统铁超载，随后肝脏也出现铁超载，这表明这些突变增加了肠道铁的吸收。
在本研究中，我们通过研究铁(II)的摄取和释放，以及分离的十二指肠肠上皮细胞、大鼠十二指肠黏膜的微绒毛膜和肠源细胞系IEC-6和Caco-2，报道了一种抗铁转运蛋白活性的功能性抗体的作用。
材料与方法
细胞培养
肠上皮细胞系6 (IEC-6)和Caco-2细胞来自美国类型培养集(Rockville, Maryland, USA)。IEC-6细胞的培养和制备如前所述。12Caco-2细胞在含有15%胎牛血清，1%非必需氨基酸，1%的Dulbecco 's改良Eagle 's培养基中维持l-谷氨酰胺，50 μg/ml青霉素，50 μg/ml链霉素，在第19 ~ 50代之间使用。Caco-2细胞以1×10的密度播种4细胞/厘米2在细胞培养插入物上(孔径0.4 μm;猎鹰，富兰克林湖，新泽西州，美国)。使用BCA蛋白测定试剂盒测量细胞的蛋白质含量，以纠正细胞数量变化的数据。
动物
西澳大学动物福利委员会批准在这项研究中使用动物。4周龄雄性Wistar大鼠饲喂半纯化饲料17，18低，正常或高的铁改变铁的吸收。9两周后，大鼠过量服用0.5 ml 60g /l的戊比妥。肝脏和小肠被切除。
绒毛肠细胞的分离
从喂食正常铁水平的大鼠十二指肠被移除，肠细胞分离如前所述。19将来自绒毛中部区域的肠细胞聚集，在磷酸盐缓冲盐水中洗涤三次，并立即用于Fe(II)的摄取。用相位对比显微镜和台盼蓝排除法评估细胞活力。
刷状边界膜的隔离
从缺铁的十二指肠粘膜擦伤中分离出刷状边缘膜。20.通过碱性磷酸酶活性测定微绒毛膜的富集程度。21
IEC-6细胞和绒毛肠细胞对Fe(II)的摄取
采用指数生长期的IEC-6细胞。12分离的肠细胞在MEM中重悬，得到1×106细胞/ml，每个时间点取悬浮细胞500 μl。细胞用1:50稀释的转运蛋白抗体孵育12(以下称为抗体)在摄取1 μM Fe(II)的铁之前和期间，加入或不加入250 ng/ml免疫肽在摄取培养基中30分钟。细胞也与免疫前血清孵育。
研究了含1 μM铁的溶液对Fe(II)的吸收59FeCl3.而且56FeSO4以1:10的摩尔比，加上100倍摩尔多余的新制的抗坏血酸钠，加入含有20mm Hepes-Tris (pH 5.5)和1%牛血清白蛋白的MEM等渗溶液中。IEC-6细胞在缓冲盐溶液(BSS)中洗涤三次以去除介质，然后在1 μM Fe(II)溶液中，在37°C, 5%CO的气氛中孵育30分钟2空气/ 95%。肠细胞在37°C的Fe(II)溶液中孵育40分钟。细胞在BSS中洗涤五次，在1% Triton X-100/0.1 M NaOH中裂解，并在γ计数器中计数放射性(Packard, Connecticut, USA)。
从IEC-6细胞和绒毛肠细胞释放铁
IEC-6细胞和肠细胞用1 μM Fe(II)孵育1小时后，4℃BSS洗涤。在此之后，将它们在含有抗体或免疫前血清的BSS中在37°C下孵育30分钟。在这项研究中，没有使用铜蓝蛋白或载铁转铁蛋白来研究释放，因为这些化合物不影响这些细胞对铁(II)的吸收或释放。12离心后测量释放到介质中的放射性标记铁。细胞在0.1 M NaOH/1% Triton-X100中洗涤和裂解，并计数放射性。铁的释放量表示为从细胞释放的量与被细胞吸收的量的百分比。
Caco-2细胞摄取和释放Fe(II)
21天后，当获得一种绒毛表型的分化细胞融合培养时，使用Caco-2细胞。这是使用毫厘电阻系统(Millipore，悉尼，澳大利亚)测定的。22当经上皮电阻超过260 Ω/cm时使用细胞2在空白插入件上减去电阻后。
细胞在BSS中洗涤三次，并在顶端室的1 μM Fe(II)溶液中孵育1小时，如上所述。插入物在BSS中洗涤五次，细胞裂解。计数基底室和Caco-2细胞的放射性。摄取代表细胞中放射性标记铁的量加上基室中的量，而释放代表基室中的放射性。使用Caco-2细胞进行的初步研究表明，基底室中的铜蓝蛋白或载铁转蛋白对摄取没有影响。因此，这些化合物没有被使用。在根尖室用抗体研究了Fe(II)的摄取和释放。此外，在从根尖室摄取铁(II)一小时后，彻底清洗细胞和两个室，并在30分钟内测量铁在根尖室和基室的释放量。
全十二指肠和Caco-2细胞中铁转运素的免疫荧光检测
缺铁大鼠和高铁大鼠十二指肠冷冻切片，用7 μm切片，室温解冻5分钟后，用4%缓冲生理盐水固定。该抗体与抗大鼠转铁蛋白受体或大鼠乳糖酶的单克隆抗体共孵育23分别显示基底膜和根尖膜的清晰度。12抗体在MEM或MEM加50 ng/ml免疫肽中孵育过夜。
将抗体置于活Caco-2细胞的顶端或基底腔中，在4°C下放置30分钟。细胞清洗、固定，然后用罗丹明-阳子霉素1:100孵育15分钟，勾勒出丝状肌动蛋白(Molecular Probes, Eugene, USA)。此外，将细胞固定，然后与抗体免疫反应，以显示总运铁蛋白的表达。如前所述，使用种特异性荧光偶联抗体进行免疫检测12切片在共聚焦显微镜下观察(Biorad, Sydney, Australia, MRC 1000)。通过共聚焦显微镜观察丝状肌动蛋白表达来勾勒Caco-2细胞的膜。在选择一个特定的z平面后，对整个细胞进行垂直串行切片，以确定转运蛋白的表达。
Western blot分析
如前所述，从均质细胞和富集的微绒毛膜提取物中提取的蛋白质进行western blot分析。12兔抗大鼠铁转运蛋白(1:3000)12多克隆抗鼠mA33抗体，被认为是肠细胞基底外侧膜的标记物(1:2000)，24和结合生物素的抗兔二抗(1:10000)(Serotech，多伦多，加拿大)。信号被Vectastain ABC试剂盒(Vector Laboratories, Burlingame, California, USA)放大，并使用ECL化学发光法(Amersham, Bucks, UK)检测。使用Scion图像(Scion公司，Frederick, Maryland, USA)分析western印迹。
非血红素铁测定
采用Kaldor法测定肝脏非血红素铁含量。25
统计方法
结果以均值(SEM)表示。使用Instat程序(Graphpad Software, San Diego, California, USA)对数据进行方差分析和Tukey检验，或使用SPSS 8.0统计软件(SPSS Inc.， Illinois, USA)采用线性回归方法检验相关性。p<0.05为差异显著。
结果
铁转运素在IEC-6细胞、Caco-2细胞和分离的肠细胞中表达
转运蛋白抗体在IEC-6细胞、新分离的肠上皮细胞和Caco-2细胞中检测到一个60 kDa的优势条带(图1)。该印迹覆盖的蛋白质重量从206 kDa到15 kDa。
Western blot分析显示，在大鼠IEC-6细胞(通道1)、Caco-2细胞(通道2)和新鲜分离的肠细胞(通道3)中，有一条以60 kDa的速度迁移的条带，可见转运铁蛋白表达。
在铁转运蛋白抗体存在时，IEC-6细胞和大鼠肠上皮细胞对亚铁的吸收减少，但不释放亚铁。
在IEC-6细胞中，抗体在研究的所有时间点减少了大约50%的Fe(II)的摄取(图2A)。当抗体与免疫肽孵育时，这种减少就消失了(图2A)。当IEC-6细胞预先加载铁，然后与抗体孵育，铁释放类似于对照组(图2B)。
铁的摄取和释放的IEC-6细胞存在转运蛋白抗体。(A)将IEC-6细胞单独与抗体(运铁蛋白)、抗体与250ng /ml免疫肽(肽，仅30分钟)或免疫前血清(对照)孵育30分钟，然后在摄取1 μM亚铁(Fe(II))期间孵育。(B) 1 μM Fe(II)加载细胞后释放放射性标记铁。抗体或免疫前血清仅在释放期存在。值为均值(SEM)， n = 3。与对照组相比，各时间点p<0.05。
当新鲜分离的大鼠肠上皮细胞与抗体孵育时，Fe(II)的摄取量减少了40%(图3A)。在抗体存在或不存在的情况下，铁的释放速率没有观察到差异(图3B)。
运铁素抗体对新分离的大鼠十二指肠肠上皮细胞铁摄取(A)和铁释放(B)的影响(详情见图2)。n = 9。
在Caco-2细胞中，铁(II)的摄取在铁转运蛋白抗体的存在下减少
当将运铁蛋白抗体和Fe(II)放在根尖室时，Fe(II)的摄取被抑制了50%(图4A)。然而，释放速率不受影响(图4B)。放射性标记的铁只被释放到基腔，一旦被取走就不会再进入根尖腔(图4C)。
转运蛋白抗体对Caco-2细胞摄取1 μM亚铁(Fe(II))及其释放的影响(A)铁加抗体(铁转运蛋白)或免疫前血清(对照)在根尖室，铁释放到基室(B)。(C)放射标记的铁释放到根尖室或基室当细胞在根尖室装载铁。n = 3。*与对照组相比，15 - 60分钟时p<0.05。
转运铁蛋白在十二指肠肠上皮细胞和Caco-2细胞中的定位
缺铁大鼠(7 μg/g肝脏重量)和富铁大鼠(243 μg/g肝脏重量)肝脏铁储量相差35倍。
在缺铁肠细胞中，沿肠细胞的基底膜和侧膜以及基底细胞质中可见到最强的转运蛋白表达(图5A, D)。转铁蛋白受体被用作基底外侧膜、基底细胞质和核上区域的标记物(图5B)。在这些位点与运铁蛋白有很强的重叠(图5C)。正如预期的那样，在根尖膜上没有看到转铁蛋白受体的表达(图5B)。转运蛋白沿根尖膜表达(图5A,C, D)。当微绒毛膜标记乳糖酶(图5E)与转运蛋白共定位(图5F)时，证实了这一点。
铁缺乏大鼠十二指肠(A, C, D, F =红色荧光)和活的(G, I)和固定的Caco-2细胞(H =绿色荧光)中转运蛋白的表达。转铁蛋白受体(A-C)和乳糖酶(D-F)的表达。在十二指肠组织中，转运蛋白主要表达在基底膜(b)和外侧膜(箭头)，但也存在于根尖膜(a)。转铁蛋白受体(b, C)定位于基底膜(b)、外侧膜(箭头)和核上区(上方箭头)，并且在这些位置与转运蛋白表达重叠((C)中黄色)。乳糖酶(E, F)定位于根尖(微绒毛)膜(a)，并在此位置与运铁素共定位(F中黄色)。在存活的Caco-2细胞中，当抗体在根尖腔时，在微绒毛上可见表达(a)。由于抗体不能穿透细胞膜，因此未检测到细胞内表达(绿色荧光)。(G)在固定的Caco-2细胞中，转运蛋白定位于基底膜、侧膜和根尖细胞质(C)。丝状肌动蛋白发出红色荧光，用于勾勒Caco-2细胞，并与发出黄色荧光的转运蛋白重叠。(I)将抗体与基底腔和基底膜接触，从上方观察，铁转运素呈0.4 μm圆盘状荧光。比例尺= 10 μm。
与缺铁组织相比，铁负荷降低了基底细胞质和沿基底外侧膜的转运蛋白表达(数据未显示)。
当组织与免疫肽共孵育时，未见转运蛋白表达(数据未显示)。
在暴露于根尖介质抗体的活Caco-2细胞中，转运蛋白仅在微绒毛上表达(图5G)。免疫检测前固定的Caco-2细胞在根尖细胞质和侧膜中可见强的转运蛋白表达(图5H)。将抗体置于基底膜腔中，在基底膜上可见直径为0.4 μm的荧光圆盘。这种模式与插入物中允许抗体与基底膜接触的孔的直径一致(图5I)。
十二指肠肠上皮刷状边缘膜富含铁转运素
与起始匀浆相比，刷状边界膜制剂的碱性磷酸酶活性提高了6倍。在刷状边缘膜中，与起始匀浆相比，转运铁蛋白的表达增加了两倍(图6,60 kDa)，而肠细胞基底外侧膜的标记物mA33(图6,40 kDa)减少了四倍。
Western blot分析十二指肠刷状边缘膜(1-3车道)和起始匀浆(4-6车道)中运铁素(60 kDa)和肠细胞基底外膜标记物mA33 (40 kDa)。蛋白通道1、4 = 80 μg，通道2、5 = 40 μg，通道3、6 = 20 μg。N = 9只老鼠。
讨论
在研究一种抗运铁素抗体的功能效应之前，我们用四种方法测试了它的特异性。首先，从IEC-6细胞、新鲜分离的肠上皮细胞和Caco-2细胞中获得的蛋白质经western blot分析显示，从编码铁转运蛋白的cDNA中获得了一条预测大小的显性条带。4 -6其次，细胞中过表达的运铁素导致在未转染的细胞中检测到适当大小的条带，而该条带未被扩增。12第三，当抗体与用于产生抗体的免疫肽预孵育时，转运铁蛋白的免疫荧光检测丢失(见下文)。第四，当抗体与免疫肽共孵育时，抗体产生的功能活性的损失恢复(见下文)。因此，我们得出结论，产生的抗体是特异性的运铁蛋白。
该抗体使用预测位于最大细胞外结构域中间的肽序列生成，横跨膜结构域3和4。先前，我们用免疫荧光法证实了该抗体和运铁蛋白之间存在细胞外相互作用，其定位于活细胞的细胞表面也证明了这一点。12因此，这种细胞外相互作用使我们能够评估在IEC-6细胞、新分离的肠上皮细胞和Caco-2细胞中，阻断铁转运素的特定区域对Fe(II)摄取和释放的功能影响。令人惊讶的是，我们在极化的肠上皮细胞和非极化的IEC-6细胞中发现，运铁素抗体特异性地减少了Fe(II)的摄取，但对其释放没有影响。然而，目前尚不清楚抗体对摄取的影响是否由于与顶端或基底外侧膜上的转运蛋白相互作用，因为在研究过程中，两个表面都暴露于抗体。因此，我们使用极化的Caco-2细胞生长在两室插入物上，并表明当抗体与根尖膜相互作用时，Fe(II)的摄取被抑制。虽然用于产生抗体的大鼠和人转运铁蛋白序列中有3个氨基酸不同，但在啮齿动物细胞(分离的肠细胞和IEC-6细胞)和人来源的Caco-2细胞中看到的类似程度的抑制摄取表明，转运铁蛋白中的保守区域在与抗体相互作用时很重要。
如果转运蛋白在铁的吸收中起作用，那么它必须沿微绒毛膜存在。为此，我们从十二指肠粘膜制备微绒毛膜蛋白，并通过western blot检测铁转运蛋白的表达。微绒毛膜蛋白的富集可以通过碱性磷酸酶活性的增加以及伴随的基底侧膜蛋白mA33表达的减少来证实24与起始匀浆相比。在这些条件下，转运蛋白的表达增加，表明它沿十二指肠肠细胞的微绒毛膜存在。
这一发现与之前的免疫荧光研究不同，包括我们实验室的一项研究，该研究没有使用低功率成像将运铁素定位到微绒毛膜上。4 -6鉴于此，我们用共聚焦显微镜重新评估了载铁和缺铁十二指肠中转运铁蛋白的表达，重点是肠细胞微绒毛膜上的表达。高倍显像可在微绒毛上观察到运铁素。当乳糖酶(一种微绒毛膜标记物)与铁转运素共定位时，这一点得到了证实。当研究运铁素在铁负载组织中的分布时，与缺铁组织相比，细胞内表达减少，这与身体铁储备对运铁素的调节一致。4 -6,26此外，利用活Caco-2细胞在微绒毛膜的胞外区域检测了运铁蛋白的表达。然而，McKie和他的同事6使用表位标记的运铁素，没有观察到沿Caco-2细胞根尖膜的表达。这可能是由于融合蛋白未能靶向根尖膜，或者表达量低于可检测水平。
基于上述证据，我们提出铁转运素存在于根尖膜上，并参与了Fe(II)的吸收。转运铁蛋白不太可能作为摄取转运蛋白，因为有令人信服的证据表明这是通过DMT1。2由于Caco-2细胞吸收的铁没有被释放回根尖腔，因此也不太可能是铁转运素在根尖膜上释放过量铁。可能是运铁素在根尖表面调节DMT1的表达和/或活性，进而导致铁摄取的改变。如果这是正确的，那么这就表明除了参与铁的外流，铁转运素还在根尖膜上作为铁摄取的调节剂。虽然我们试图确定抗体在Caco-2细胞基底膜上的作用，但我们没有看到反应。部分原因可能是由于所使用的内固定物限制了基底膜对基底基质的暴露。然而，转运蛋白在基膜上表达，抗体与基膜表面接触，通过与插入物内孔直径相似的荧光盘证明。这一发现与McKie及其同事的发现是一致的6他们注意到，利用计算机通过Caco-2细胞单层生成的垂直切片，转运蛋白沿侧膜和基膜表达。当抗体出现在基底腔时，不影响外排，这与IEC-6细胞和新分离的极化肠细胞得到的结果一致。这些观察可以让我们深入了解相互作用的本质。我们假设，在根尖膜上，运铁素可能与另一种蛋白质(如DMT1)相互作用，抗体干扰这种相互作用，导致摄取减少。由于DMT1在基底膜和侧膜上不表达，这种相互作用不会发生，因此在抗体存在时释放不受影响。
致谢
澳大利亚国家健康和医学研究理事会为这项工作提供了资助。我们感谢Evan Morgan的有益讨论，Alan Light的技术支持，Joan Heath的mA33抗体，Andreas Quaroni的乳糖酶抗体。