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背景:霍乱毒素(CT)作用于肠上皮细胞分泌的直接或间接地通过激活神经反射。反射可能释放乙酰胆碱作为其最后的神经递质之一。这打开了三分之一的可能性为CT的作用机制,即两个促分泌素之间的协同交互作用于不同的上皮细胞内第二信使系统。
目的:建立证据胆碱能神经支配人类回肠上皮细胞乙酰胆碱的作用,探讨CT强化是否对人类肠道上皮细胞。
方法:横向部分人类的回肠粘膜胆碱能神经检查和M3毒蕈碱的受体使用胆碱乙酰转移酶和M3受体的抗体。短路电流(Isc)反应和离子通量运动引发了从T84年上皮细胞层设置在美国两院。
结果:人类回肠粘膜免疫组织化学的本地显示的胆碱能神经和毒蕈碱的M3受体位于上皮细胞的基底区域。T的分泌反应84年细胞单层膜乙酰胆碱在CT的出现极大的强。这种效果,用forskolin代替CT,由基底增加镜像86年Rb和顶端125年我流出。Charybdotoxin + apamin Isc和减少86年Rb由乙酰胆碱所引起的射流,在forskolin的存在。
结论:人类回肠粘膜接收直接胆碱能神经支配其上皮细胞。分泌乙酰胆碱对上皮细胞的影响是增强CT的存在。这种协同反应依赖于最佳基底的钾离子通道由CT乙酰胆碱和氯化顶端渠道。的相互作用可能导致霍乱毒素的作用机制诱导分泌性腹泻。
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- 贵宾,——血管活性肠多肽
- PGP,蛋白基因产品
- 聊天、胆碱乙酰转移酶
- TBS,三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐
- M3,毒蕈碱的类型3受体
- TER, transepithelial阻力
来自Altmetric.com的统计
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- M3,毒蕈碱的类型3受体
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霍乱弧菌会导致丰富的水样腹泻的作用主要通过霍乱毒素(CT)在肠道粘膜。在孤立的肠道粘膜准备安装在我们房间,CT营水平和增加短路电流(Isc)。1这个动作明显非神经自然传播有关使用T证实了类似的结果84年人类结肠细胞系2通过观察CT抒发人类回肠粘膜分泌反应处理河豚毒素。3然而,在霍乱和腹泻的大小的可能性访问肠隐窝的细菌可能会限制促使额外调查机制可能放大了的毒素影响的行动。
令人信服的证据表明,CT激活secretomotor神经反射源自观察CT诱发腹泻是降低药物,如局部麻醉药,河豚毒素、六甲铵。4肌间神经丛的存在需要的反射5并利用secretomotor神经元,其中最突出的似乎是那些包含——血管活性肠多肽(VIP)和乙酰胆碱(ACh)。6,7
证据支持的主要身体作为公认的神经递质乙酰胆碱的作用直接参与上皮细胞电解质运输和来自解剖,功能,和受体结合的研究。7 -9然而,调查使用肌肉剥夺了准备的大鼠结肠成立于美国商会证明,课时也间接通过激活uncharacterised secretomotor神经元。10日,11天竺鼠和猪的解剖研究表明胆碱能神经元投射到肠道粘膜。7,12日,13然而,胆碱能神经元不能证明支配人类结肠或回肠粘膜。14日,15这可能代表物种差异或更有可能假阴性(SJ布鲁克斯、个人通信)。
人类因此,如果ACh发布的CT对上皮细胞的直接作用,那么它可能会有两者之间的协同交互促分泌素肠上皮细胞的水平。16日,17
使用本机人类回肠粘膜和肠上皮细胞(T84年),我们一直在调查是否有胆碱能神经支配人类的回肠肠上皮细胞和如果有协同互动CT和神经递质乙酰胆碱。积极的证据都将是临床上重要的代表一个额外的机制腹泻会恶化霍乱。
方法
细胞培养
T84年人类结肠上皮细胞系,细胞从欧洲获得的细胞培养(英国威尔特郡索尔兹伯里ECACC)和段落之间使用70年和85年。一直在前面描述的方法。18一百万或四百万个细胞被播种到12毫米或24毫米内直径collagenised半透膜,分别为(0.4配角Snapwell插入,μM孔径)和9或11天之后插入附加汇合的单层被用于实验。
Isc测量
单层膜12毫米将被插入一个修改我们室Isc的连续记录。单层膜两边沐浴了10毫升的毒气毒死克雷布斯循环缓冲区保持在37°C同位素实验(2.5毫升)。电气测量进行了前面讨论的。18CT应用于单层膜的顶端领域除非另有指示。所有其他药物有管基底。没有单层收到超过一个给定的化合物的浓度。
测量离子流出
我们使用之前验证方法在T84年细胞19测量基底和刺激细胞的流出125年我和86年Rb的测量基底顶端氯和钾离子通道的活动。细胞被播种到12毫米插入所述,培养至汇合的。插入和汇合的单层膜在介质加载180分钟包含2.5μCi /毫升125年我或1μCi /毫升86年Rb。插入后被迅速冲500μl整除的放射性克雷布斯被拆除,代之以同样体积的同位素自由克雷布斯的顺序每隔两分钟22分钟时间从基底顶端或隔间125年我和86年Rb试验,分别。剩余的实验中,同位素在单层0.1氢氧化钠和提取溶液中提取数整除样本。射流的实验中,数据被修正为采样体积(0.5毫升2.5毫升水库)和以前的损失缓冲区置换抽样。流出速率常数计算像Venglarik和他的同事所描述的那样。19短暂,释放层(流出)的同位素的比例计算的总放射性(组织和解决方案)出席一组时期的开始。速率常数(r)的计算是通过以下方程:
在哪里R1和R2在细胞层数的百分比是发布在* 1 (t1)和2 (t2),分别。19实验研究与forskolin阵营依赖受体激动剂,因为它不是在技术上可以使用CT实验的时间框架内,由于发病缓慢行动的毒素。
营的测量
细胞培养(如前所述),然后播种到大24毫米直径的插入。汇合的时候,插入快速清洗,沐浴在pregassed克雷布斯在37°C的5%的股份有限公司2的气氛。3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) 0.1毫米被添加到克雷布斯在每个实验的开始。受体激动剂或拮抗剂被添加到适当的顶端或基底域。最后实验,沐浴液和细胞被冻结在−20°C营前测量。营是由蛋白质绑定然后量化分析如前所述籽棉和他的同事们,20.并表示pmol /厘米2的细胞单层。
数据分析
所有数据都表示为算术平均值(SEM), n =数量的层。统计比较正反学生的使用t测试与p < 0.05被代表的显著差异。
药物和材料
CT是来自瑞士血清和疫苗研究所(伯尔尼,瑞士)。125年我和86年Rb取自Amersham法玛西亚生物技术(英国)。乙酰氯、氯化钡、营地,二甲亚砜,forskolin,组胺盐酸盐,东莨菪碱氢溴酸盐,IBMX, charybdotoxin, apamin,——血管活性肠肽都是来自σ(英国)。
免疫组织化学
材料
福尔马林固定石蜡包埋4μm横向部分回肠,安装在铬矾镀膜玻璃幻灯片,从病理档案收集。组织已经从5名患者(平均年龄33岁(范围29-46))的正确部分结肠切除术non-obstructing盲肠的肿瘤。高级histopathologist报告所有回肠标本作为宏观和显微镜下正常。道德许可使用档案材料从伦敦东区卫生当局获得伦理委员会(T / 02/027)。
方法
主要抗体9.5蛋白基因产物(PGP),总神经组织的一个标志,colocalised与胆碱乙酰转移酶(聊天),被用来识别胆碱能神经在黏膜和黏膜下层。Anti-M3毒蕈碱的受体抗体被用来本土化M3受体在同一层,使用串行部分。幻灯片是deparaffinised使用标准技术。抗原检索是通过孵化2μg /毫升蛋白酶K (Promega,麦迪逊,威斯康辛州,美国)pH值7.6和室温20分钟。部分然后在三羟甲基氨基甲烷缓冲液冲洗盐水(TBS) pH值7.6和室温五分钟之前阻止非特异性结合的第二级抗体与5%马血清。Anti-PGP顺序和anti-ChAT抗体被应用。与主要部分最初孵化anti-PGP抗体在37°C(表1)90分钟。幻灯片在TBS洗和孵化二级生物素化的抗体(Vectastain环球精英ABC工具包,向量实验室,彼得伯勒,英国)在室温下在TBS 30分钟再冲洗。
叔过氧化物酶标记抗生物素蛋白应用在室温20分钟,在发展中与Tyramide信号放大荧光素系统(NEN生命科学产品,波士顿,麻萨诸塞州,美国)5分钟。幻灯片和TBS洗和非特异性结合的第二次要使用5%山羊血清抗体被阻塞。部分被孵化主要anti-ChAT抗体在4°C 18个小时和TBS的冲洗。一个TRITC-immuno共轭二次抗体(北欧免疫学、荷兰)增加了30分钟。幻灯片终于安装在Immuno-Mount(美国宾夕法尼亚州Shandon、匹兹堡)。
M3受体
M3受体抗原表位被暴露在串行部分,使用微波4分钟的柠檬酸缓冲(pH值6.6)其次是本地化anti-M3抗体对PGP使用前面描述的方法。
分析
部分被认为使用徕卡显微镜数字化(徕卡成像系统有限公司、剑桥、英国)和适当的过滤块。粘膜的多个数字图像捕捉拍摄,消化道黏膜,黏膜下层和×200放大,使用徕卡DC200软件,为了评估染色的分布和程度与PGP colocalisation聊天。
结果
T的响应84年单层CT和课时
Transepithelial阻力(TER)的T84年层是595(45)Ω/厘米2。基底Isc 2(1)μA /厘米2。CT(0.0001 - -0.1μg /毫升)应用于T的顶端域84年单层细胞产生浓度依赖增加Isc(图1)。时间的效果,也依赖于浓度峰值的影响。当基底外侧,CT(0.1μg /毫升)的响应更快达到峰值的影响(54(4)μA /厘米2在90分钟;n = 5)相比,当水(46(3)μA /厘米2在130分钟;n = 5, p < 0.05)。与一个水控制相比,CT降低怪兽。水应用毒素,减少后从406年(96年)Ω/厘米2268(32)Ω/厘米2(p < 0.05、n = 5)和基底应用毒素,减少后从633年(111年)Ω/厘米2348(48)Ω/厘米2n = 5 (p < 0.05)。控制价值566(41)Ω/厘米2513(43)Ω/厘米2n = 5 (p > 0.05)。课时(0.1 -100μM)应用基底外侧增加Isc从1(0)μA /厘米2(n = 4)最多11(3)μA /厘米210点μM (n = 6)。响应被站在顶端的应用ACh(10μM)是无效的(0(0)μA /厘米2,n = 4)。
短路电流(Isc) T的反应84年细胞霍乱毒素(CT 0.0001到0.1μg /毫升)超过180分钟。CT应用于顶端表面除非另有指示,当它应用于基底外侧表面(B)。Isc表示为改变当前/厘米2单层。数据意味着(SEM) (n = 5)。
交互的促分泌素
CT和forskolin强反应课时。在CT, T的反应84年细胞ACh强。图2显示了T的浓度响应曲线ACh后接种84年细胞CT(0.01μg /毫升)或H2O汽车(100μl) 180分钟。增强作用的ACh依赖于毒素的浓度。反应ACh(10μM)从104(9)μA /厘米不等2(n = 6)到213(11)μA /厘米2(n = 6),在0.0001和0.1μg /毫升CT,分别。增强作用的ACh也依赖于细胞单层CT的曝光时间。响应从26课时(10μM)不同(9)μA /厘米2(n = 6) 43(4)μA /厘米230分钟后(n = 6)暴露在CT(0.0001μg /毫升和0.1μg / ml,分别)。东莨菪碱(1μM 30分钟前ACh)废除反应ACh(10μM;n = 6)给180分钟后CT(0.01μg /毫升)。东莨菪碱本身没有影响基底Isc或内涵。反应ACh也会使forskolin。五分钟后的预培养forskolin(10μM),反应ACh(50μM) 111(9)μA /厘米2(n = 6, p < 0.05)。独自应对ACh(50μM) 10(1)μA /厘米2(n = 6)。
短路电流(Isc) T的反应84年单层膜乙酰胆碱(ACh 0.1μM - 100μM)给180分钟后早期接触霍乱毒素(CT 0.01μg /毫升)或车辆。反应ACh的CT不包括底层应对毒素。数据意味着(SEM) (n = 4 - 6)。
空调采暖强forskolin但不是CT。的ACh(10μM)鉴于90秒前的毒素,对CT(0.01μg /毫升)经过180分钟的接触毒素27岁(2)μA /厘米2(n = 6, p > 0.05)。相比之下,反应forskolin(1.25μM)五分钟后从32(2)增加μA /厘米2(n = 9)到108(11)μA /厘米2(n = 5, p < 0.05),当ACh forskolin之前是90秒。
CT也会加强对组胺的反应而不是贵宾。在CT(0.01μg /毫升,120分钟的预孵化),对组胺的反应(100μM)从14(4)增加μA /厘米2(n = 6) 60(8)μA /厘米2(n = 6, p < 0.05),而对VIP(0.3海里)减少从51(4)μA /厘米228(4)μA /厘米2n = 6 (p < 0.05)。
钾通道阻断对促分泌素反应的影响
钡(5毫米)减少对CT和forskolin但不疼(表2)。当钡是前20分钟CT,后续反应得到ACh持平(表2)。的组合非常具体的钙依赖性钾通道阻滞剂charybdotoxin(0.5μM), apamin(0.5μM)减少反应ACh的forskolin(表2)。没有阻滞剂使用有任何影响基底Isc或内涵。
基底的促分泌素的影响86年Rb射流和顶端125年我流出
Forskolin(10μM)应用于基底外侧表面产生的速度快速增长125年我流出明显不同于时间匹配控制。此同时在时间和初始Isc由forskolin增加。没有显著改变射流速率常数与空调采暖(50μM)。乙酰胆碱(50μM)应用于基底外侧表面,在forskolin(10μM),产生第二次增加125年我流出。这又明显不同于时间匹配控制(图3、表3)。
forskolin效果(B),乙酰胆碱(C)和乙酰胆碱的存在forskolin (D)的流出125年我从T84年细胞。乙酰胆碱(50μM)给出了五分钟后forskolin(10μM)基底外侧表面。Y轴值流出速率常数(r/分钟)。* p < 0.05 (A)与时间匹配控制。数据方法(SEM) (n = 6)。
独自Forskolin(10μM)引起了一场小延迟但显著增加86年基底Rb射流与时间匹配控制。这是减少钾通道阻滞剂钡的存在。空调采暖也增加生产86年Rb流出。在forskolin面前,每产生一个额外的增加显著大于诱导的ACh独自(图4,表4),这是减少钙激活钾通道阻滞剂的组合charybdotoxin + apamin(表4)。
forskolin效果(B),乙酰胆碱(C)和乙酰胆碱的存在forskolin (D)的流出86年Rb从T84年细胞。乙酰胆碱(50μM)给出了五分钟后forskolin(10μM)基底外侧表面。Y轴值流出速率常数(r/分钟)。* p < 0.05 (A)与时间匹配控制。†与峰值相比p < 0.0586年Rb乙酰胆碱引起的射流。数据意味着(SEM) (n = 6)。
CT和forskolin对营地的影响水平
CT(0.01μg /毫升)和forskolin(1.25μM)引起了与时间有关的阵营增加生产T84年细胞层。forskolin的影响是显著的10分钟后而CT花了120分钟到达意义(图5)。钡(5毫米)前20分钟CT(0.01μg /毫升)没有影响营生产的毒素(图6)尽管相当大的减少Isc反应(表2)。钡独自曾被证明没有影响基底营地的水平。21营生产也影响空调采暖的存在(10μM) 180分钟后早期接触毒素;乙酰胆碱(10μM)本身没有影响营水平(图6)。
测量营地生产T84年细胞。时间进程的影响霍乱毒素(0.01μg /毫升)和forskolin(1.25μM)营地生产测量超过180分钟和60分钟,分别。营水平表示为总核苷酸/厘米2单层。数据意味着(SEM) (n = 6)。* p < 0.05与控制。
营生产T的刺激84年细胞。营水平(pmol /厘米2单层)测定在180分钟后暴露在霍乱毒素(CT)或3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX、控制),并在30分钟后暴露在乙酰胆碱(ACh)。当给定的结合在一起,每150分钟后加入CT和营水平测定在180分钟。钡(5毫米)是前20分钟CT(0.01μg /毫升)。数据意味着(SEM) (n = 6)。
胆碱能神经分布和M3受体在人类回肠粘膜
高比例的神经纤维染色积极为聊天(图7,7 b)的所有层捕获字段。粘膜内的最高密度的神经位于腔的方面相关的固有层,串行部分,M3受体免疫反应性基底区域相邻的肠上皮细胞(图7)。高密度的聊天积极神经和M3受体在消化道黏膜被发现。神经纤维和细胞染色积极PGP和聊天在黏膜下神经丛,M3受体局部粘膜下血管。
Co-localisation(箭头)的蛋白质基因产物(PGP) (A)和胆碱乙酰转移酶(聊天)(B)粘膜内的神经纤维(m),消化道粘膜(毫米),和黏膜下层(sm)的正常回肠,高比例的纤维染色积极聊天。粘膜内的大部分纤维位于固有层,毗邻肠上皮细胞的基底区域。毒蕈碱的M3受体(C)是局部的,在串行的部分中,肠上皮细胞的基底区域(箭头),消化道黏膜,黏膜下层血管(箭头)。酒吧μm代表200人。
讨论
急性感染性腹泻构成全球卫生问题和继续造成重大的发病率和死亡率。腹泻产生霍乱的体积比大多数其他类型的腹泻,这是符合协同机制的提议可能发挥作用产生的急性严重水样腹泻的发病机制霍乱弧菌。动物研究已经证明了胆碱能神经投射到粘膜。7,12日,13胆碱能神经元也被证明在隐窝和扩展人类小肠的绒毛。22日,23然而,这两个调查使用胆碱酯酶和乙酰胆碱酯酶,而不是胆碱乙酰转移酶(聊天)作为胆碱能神经元的标记。胆碱酯酶不视为可靠的胆碱能神经元的标志一样聊天可以与non-cholinergic神经元。24此外,功能性研究支持在人类和动物组织分泌的作用哦。25 -27使用免疫组织化学染色正常人类的回肠切除标本,我们展示了聊天包含神经元和M3毒蕈碱的受体在黏膜下层和相邻的上皮细胞基底区域。这些发现还没有前面描述的在人的小肠。可能CT释放ACh直接到上皮细胞的令人信服的证据,毒素激活secretomotor神经反射,4,5,28,刺激神经纤维在人类回肠粘膜分泌引起阿托品敏感反应。25
T84年结肠上皮细胞CT显示高度的敏感性。时间到出现Isc响应以及峰值效应浓度依赖性。增加基底在Isc应用CT最初的毒素被意想不到的受体是位于肠上皮细胞的顶端膜。29日作为基底应用毒素迅速达到峰值的影响比水应用毒素,毒素被认为是不太可能是穿越单层。一个更可能的解释是,CT受体monosialoganglioside,并不局限于肠上皮细胞的顶端域,这并不奇怪这样一个无处不在的细胞成分。30.管基底的早高峰效应应用CT的位置可能是由于腺苷酸环化酶在肠上皮细胞的基底区域,31日在这种情况下,可能更少的时间花在细胞内的毒素亚单位的交易。或者,可能有更多的毒素神经节苷脂受体在基底膜上。32
在使用本机与调查组织准备,33岁的34CT降低T的怪兽84年单层膜。虽然增加了反应ACh CT的出现被认为在180分钟后,我们不能排除组织损伤的可能性,特别是在没有利用细胞完整性指数。
Isc T的反应84年细胞乙酰胆碱在CT的出现极大地提高了。这种增强作用依赖于浓度和细胞毒素的曝光时间。Isc应对CT就显示被关联到一个与时间有关的营地的水平,增加一个观察支持早期的作品,作者也表现出密切的相关性Isc响应和营地的水平。2很可能增强作用的大小取决于营水平和结果forskolin会支持这种结论。更高浓度的乙酰胆碱与forskolin使用这些数据来自放射性同位素的射流实验,我们希望最大化促分泌素在离子流出的影响。相反的情况(即增强作用营依赖的促分泌素的ACh)只能使用forskolin时演示。这可能是由于空调采暖的短暂的影响消失的时候CT在营地发起显著增加。Forskolin显示提升营水平在10分钟内而引起的显著增加CT直到120分钟才显示。描述的合作似乎促分泌素激活不同的第二信使通路之间的操作。因此,组胺,与空调采暖是一种钙依赖的促分泌素一样,35会使前列腺素E1和大肠杆菌热稳定的毒素,而贵宾并不会使CT。CT和forskolin之间的交互也没有添加剂。3
了解协同交互的本质是复杂的不确定性对于钙依赖的促分泌素的作用机制。人们普遍同意,这些化合物基底钾离子通道开放hyperpolarise细胞,增加氯化顶端分泌的电动力。36然而,有争议,他们是否打开顶端氯通道。例如,在囊性纤维化肠有两个阵营的失败和钙依赖的促分泌素引起氯还分泌这种疾病只会影响营激活氯通道。37同样,Reenstra38不能证明氯化碳酰胆碱诱导T的顶端膜电导吗84年细胞层。因此建议氯电导钙依赖的促分泌素是通过持续开放的营地发起激活氯通道。37与这些研究结果相比,富勒和朔分离和克隆气管上皮细胞的膜蛋白与小说有关钙激活氯离子电导时不同的表达。39猪同系物已被克隆和猪肠上皮细胞中表达。40此外,巴雷特和他的同事们41产生的证据的顶端钙激活氯离子电导正面和负面受钙依赖受体激动剂。负监管(抑制)是通过代肌醇tetrakisphosphate和可以解释的短期行动的课时。
增强作用的内在CT可能发生的第二信使。例如,营地可以抑制负监管机构的一代或行动的钙依赖分泌,肌醇tetrakisphosphate,42岁的43从而减轻ACh autoinhibitory行动。然而,观察,即使是强反应ACh仍然非常简短不可能做出这样的机制。合作的原因更可能是由于离子通道开放的最佳时机。16CT主要顶端膜存在的氯离子通道开放,从而使不受阻碍的氯离子的分泌等分泌的驱动力时增加了基底的ACh激活钾离子通道。这个提议的作用机制一直支持本研究通过铷和碘射流的特点也在增强作用和通过使用选择性钾离子通道抑制剂作用于钙依赖性钾通道。
Forskolin顶端的速度迅速增加125年我从T流出84年细胞。呵就没有任何影响125年我流出,按照先前公布的数据,38虽然在目前的调查,这可能反映了小反应短路电流表明氯离子的分泌。在forskolin面前,Isc应对ACh非常强,与此同时显著增加125年我流出。这表明增强作用与增强氯化顶端分泌有关。另外,forskolin和ACh引起基底的增加86年Rb流出。,当给定的forskolin诱导86年Rb流出进一步增加,支持基底钾离子通道的作用机制。在T84年细胞钾通道阻断剂抑制分泌反应钡营而不是钙依赖的促分泌素,通过阻断不同的基底和特定的钾离子通道。36岁,44这是在目前的调查证实,钡CT和forskolin减毒反应,但不疼。这种减毒Isc反应forskolin与减少的速度86年Rb流出,没有影响营水平(使用CT),确认基底钾离子通道的作用。此外,我们表明,钡没有影响的强化ACh CT尽管衰减短路对CT的反应。评估钙依赖性钾通道的作用我们调查的影响选择性抑制这样的频道forskolin的协同作用和课时。charybdotoxin和apamin的组合45没有影响forskolin Isc反应和86年Rb流出但强Isc反应和大大减弱86年Rb流出的空调采暖forskolin的存在。因此这些结果表明ACh和CT是依赖阵营之间的合作激活顶端氯通道和钙激活基底钡不敏感钾通道。营依赖钡基底敏感钾通道不太可能发挥重要作用。本身没有出现钡在肠上皮细胞影响营水平。21
总之,目前的调查表明有明显的增强作用的分泌的ACh CT在人类上皮细胞。这种相互作用可能导致整个分泌毒素的影响,因为它曾被证明激活肠secretomotor反射。对于人类来说,这些反应可能利用ACh作为神经递质在神经上皮的结我们已经表明,胆碱能神经和毒蕈碱的M3受体位于人类回肠上皮细胞的基底区域。
确认
我们感谢教授LA Turnberg有用的讨论,年代籽棉博士建议,设施,帮助阵营化验,卡琳·费尔南德斯女士的专家与细胞培养的技术援助。我们也承认教授J马丁供应归档组织样本。这个项目是由特殊的受托人的资助支持圣巴塞洛缪医院和斯坦利·托马斯·约翰逊基金会。