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背景:的微生物诊断感染性腹泻使用传统的技术可能需要几天的时间。为了确定是否可以使用屁快速诊断,与腹泻相关的挥发性有机化合物进行分析。
方法:感染性腹泻患者粪便样本收集从35和六个健康对照。气态化合物提取从顶部空间利用固相微萃取和分析了使用气相色谱法和质谱法。
结果:挥发气体的特征模式被发现在医院感染性腹泻的主要原因。呋喃物种没有吲哚艰难梭状芽胞杆菌,乙基dodecanoate表示轮状病毒,氨乙基dodecanoate建议其他肠道病毒,没有碳氢化合物和萜烯表示弯曲杆菌感染。
结论:这些结果可能是快速接近病人传染性腹泻的诊断的基础。
- 气相色谱法
- 质谱法
- 肠胃炎
- 艰难梭状芽胞杆菌
- 轮状病毒
- 诺沃克病毒
- 弯曲杆菌
- ELISA,酶联免疫吸附测定
- 挥发性有机化合物的仪器,挥发性有机化合物
- SRSV、小圆形结构的病毒
- BMT,骨髓移植
- 萃取,固相微萃取
- GC,气相色谱法
- 女士,质谱法
- PPV,阳性预测值
- NPV,消极的预测价值
来自Altmetric.com的统计
- ELISA,酶联免疫吸附测定
- 挥发性有机化合物的仪器,挥发性有机化合物
- SRSV、小圆形结构的病毒
- BMT,骨髓移植
- 萃取,固相微萃取
- GC,气相色谱法
- 女士,质谱法
- PPV,阳性预测值
- NPV,消极的预测价值
感染造成的腹泻发病率和死亡率的主要原因。在英格兰和威尔士,大概有15 000例艰难梭状芽胞杆菌每年感染(www.PHLS.co.uk)。据估计,平均大小的地区综合医院100例C固执的感染可以预计每年每年额外费用的£400 000年和2100年失去了睡觉的日子。1这相当于£60米的英格兰和威尔士。在美国,轮状病毒感染占病毒性肠胃炎的48%和56每年000人住院,2而在发展中国家每年有600 000名儿童死于轮状病毒。3
尽管酶联免疫吸附分析(elisa)的发展和分子技术来确定感染性腹泻的病因学,在大多数情况下,之间有一个延迟几天收集粪便样本和微生物诊断。事实上,8.2天的延迟最近报道。4部分延迟是由于运输的样品一个适当的实验室,但主要是由于所需的时间完成常用的诊断技术。昂贵的微生物技术的有限的可用性问题在发展中国家化合物。在一些流行,粪便样本已经飞往美国微生物处理。根据病人的情况下,诊断延迟的结果可能会从生产力损失长期住院或死亡。有一个迫切需要快速准确诊断所有的病人。
腹泻有各种各样的物理特性被用来试图确定其病因学,有限的成功。腹泻没有附带的蒸汽用于诊断目的,也没有这些挥发性有机化合物的特性(挥发性有机化合物的仪器)收到任何详细的注意。
来测试假设挥发性有机化合物的仪器存在特定于导致腹泻,粪便样本的研究从各种引起的腹泻患者和健康志愿者进行。
材料和方法
病人
粪便样本得到来自38个科目与腹泻和六个健康对照。35,腹泻的病因学先前由常规微生物评估。样本混合物的新鲜粪便和冷冻样品存档。腹泻的原因是为每个但没有其他临床数据记录。这些样品,腹泻是由于C固执的(n = 6),弯曲杆菌(n = 5),轮状病毒(n = 5),小圆结构化病毒(SRSV, n = 9),腺病毒(n = 5), astrovirus (n = 2),和贾第虫病(n = 3)。
三个受试者的临床诊断炎症性肠病的恶化涉及结肠微生物评估。没有标本被派进行微生物检测虽然收到了抗生素和每个回应治疗复发。
健康对照组(40 - 65岁;三个男性)提供了粪便样本的形式,是正常的;没有胃肠道症状,没有一个曾被诊断出患有慢性肠胃失调。
此外,样本来自九个科目(-49 - 0.5岁;两位女性)开发腹泻后骨髓移植(BMT)。每个收到预防广谱抗生素。完整微生物评估常见的细菌和病毒性腹泻原因进行以及ELISAC固执的毒素。没有发现细菌病原体。这些样本被用作控制与患者进行比较C固执的。然而,随着病因学BMT后腹泻通常是无法解释的,这些样本被排除在研究的其余部分中使用,而不是一代的汇总统计。
分析
粪便样本切块在10毫升(约0.75克)是密封的顶空瓶(Supelco)为固相微萃取(SPME)而设计的。顶部空间内气体被采样和分析了使用气相色谱法(GC)和质谱分析(MS)。是基于我们所使用的技术用来确认患病的蔬菜。5,6
样本平衡在水浴(37°C)及其挥发性化合物吸附的顶部空间到萃取纤维(Supelco 85μm carboxen /聚二甲硅氧烷)。任何样品提取的一个小时内集合存储在瓶在−18°C。样品挥发性化合物被而眠纤维热通过离注入(惠普5890 II, 1.5分钟,250°C)到一个厚膜柱(Supelco SPB-1硫30 m×0.32毫米,β20)。挥发性化合物筛选了列(35°C(5分钟)×10°C /分钟−250°C(2分钟),1毫升/分钟)直接到四质谱仪(惠普5971)全扫描(积极的模式,15-60阿姆河,2分钟,19 - 350年阿姆河直到28.5分钟)。化合物的光谱分析进行使用专有的惠普软件(G1034C V1.05)运行NBS75K库,也被他们的洗脱顺序。
统计数据
样本的比例,从每一组的患者,表现出特定的特征是与其余的比例使用χ表现出相同的特征2测试耶茨的修正。阳性和阴性预测值,敏感性和特异性也基于这些比例计算。
结果
挥发性有机化合物的仪器被成功地吸附到短1厘米的纤维使用最近开发的萃取技术。热解吸和通过小板凳上进行gc - ms分析系统。凳子的成分的挥发性有机化合物的仪器正常受试者非常相似(图1显示了一个典型的例子),但在各种类型的腹泻患者,挥发性有机化合物的仪器一直不同的分布。特性的变化波动模式与特定类型的腹泻发生(图1 b从患者显示了一个典型的例子C固执的)。
(一)典型的气相色谱-光谱(GCMS)色谱正常的话题。(B)的典型例子GCMS色谱在患者艰难梭状芽胞杆菌。
正常的课程
释放的挥发物的分析从正常人的凳子(n = 6)显示的主要类挥发性酚类化合物,占20 - 50%的总挥发物(图2),4-methylphenol是迄今为止最普遍。吲哚和3-methylindole也丰富(5 - 25%)在正常的话题,是一群挥发物的分类,没有详细的分化,萜烯和碳氢化合物(10 - 20%)。一系列的有机酸也出席,但酸类化合物存在于所有的样本,因此不能视为标记化合物的腹泻。正常的原理挥发组分屁因此4-methylphenol,吲哚,3-methylindole,柠檬烯。苯甲醛是无处不在的虽然不丰富。
代谢轮廓的挥发性类粪便样本的正常人和患者感染性腹泻(通常平均每个样本类型)的六个样品。
吲哚在场大多数科目与腹泻(图2)。他们的发生是与色氨酸的代谢有关大肠杆菌。实际上,一个简单的实验室测试大肠杆菌基于检测吲哚自1963年以来已经在临床使用。7
艰难梭状芽胞杆菌
一阵风从患者(n = 6)造成的腹泻C固执的、呋喃(主要是2-furancarboxaldehyde并5-methyl-2-furancarboxaldehyde)特别流行(25 - 55%的挥发物)(图2)。3-Methylindole出现在少数的患者C固执的(1/6)。腹泻患者粪便样本BMT后也不太可能包含3-methylindole (0/9)。高水平的5-methyl-2-furancarboxaldehyde被发现在5/6C固执的患者只有在余下的38感染性腹泻患者的样本和炎症性肠病的恶化。单独使用5-methyl-2-furancarboxaldehyde的存在显著相关C固执的感染(χ2= 22.2,p = 0.000002)。此外,没有可衡量的3-methylindole 5-methyl-2-furancarboxaldehyde专门患者发生C固执的(χ2= 20.4,p = 0.000002)。这个组合有阳性预测值(PPV)的100%,但两种情况C固执的会被忽视,降低敏感性66%,阴性预测值(NPV)为95%。相比之下,没有可衡量的3-methylindole 2-furancarboxaldehyde 5/6的病例中发现了两个“假阳性”案件在其余(χ2= 22.2,p = 0.000003, =敏感性83%,特异性为97%,PPV 83%,净现值97%)。所有这些协会和各自的敏感性和特异性,PPV和NPV列于表1。
没有腹泻后抗生素的9个样品与BMT含有呋喃不过3 -甲基吲哚被抑制。这些样本不是用于统计分析,虽然这样做会加强有关的论证C固执的。
轮状病毒
这是一个惊人的发现乙dodecanoate是无处不在的挥发性有机化合物的仪器从病人粪便轮状病毒(n = 5)。只有一个样本,从腺病毒感染而引起的肠炎患者,包含这双重病理学,我们不能排除这种可能性。也感兴趣的月桂酸四的五轮状病毒的样本中,检测出,几乎缺席剩下的39个样本分析。丙dodecanoate没有检测到任何的样品分析除了一个病人轮状病毒。因此乙dodecanoate是一个非常敏感的(100%)和特异性(97%)标记为轮状病毒(表1)。乙醇也是无处不在的轮状病毒,但它也存在于正常人的气息从两个和6个患者腹泻。乙醇的存在在许多饮料排除了使用标记化合物,除了在特定情况下。
诺沃克病毒和其他肠道感染
腹泻病人由于SRSV2(通常称为诺沃克病毒)(n = 9)进行了研究。氨被发现在7个样品,但尚不清楚是否所有九个受试者相同应变的病毒。此外,一个示例产生很少的挥发物和最小的粪便量研究。氨与astrovirus还发现在这两个主题,两个与腺病毒5,与贾第虫病的三个,一个五轮状病毒。因此,氨的不能用于诊断诺沃克病毒虽然我们没有发现患者细菌感染,所以它可能有一个在病毒性肠炎的诊断作用。事实上,氨被发现在12/19 non-rotavirus肠炎病例和贾第虫病只有一个相比,轮状病毒的情况下,剩余的25样品(χ2= 15.4,p < 0.0001)。氨是一种困难的气体检测和波动很大程度上取决于样本的pH值。也许需要一些样品预处理的氨测定是重要的诊断价值。
氨乙基dodecanoate没有被发现在11/19例non-rotavirus肠炎而不是任何其他样本(χ2= 16.3,p = 0.00005)。这个组合有100%的特异性和灵敏度为58% non-rotavirus病毒性肠炎。
空肠弯曲杆菌
患者弯曲杆菌(n = 5),酚类丰富(测量挥发物的10 - 40%)和吲哚(20 - 30%)。还有更多的挥发性有机酸(测量挥发物的30 - 35%)比任何其他组的患者。不挥发性有机化合物的仪器属于萜烯/烃组被发现。相比之下,其他所有样本三萜烯/包含碳氢化合物(χ除外2= 19.5,p = 0.00001)。这敏感性100%,特异性92%与100%的净现值。
讨论
我们结合了最近开发的固相微萃取的进展与挥发性剖面分析的新方法粪便样本以确定感染性腹泻的原因。尽管复杂的挥发性有机化合物的仪器在正常大便,我们发现特定疾病的变化。
呋喃是从患者普遍在挥发性有机化合物的仪器C固执的感染但呋喃并没有发现在挥发性有机化合物的仪器从正常对照组和粪便样本中大部分的主题与其他形式的感染性腹泻。呋喃可能与细菌新陈代谢的呋喃糖膳食果糖。许多梭状芽胞杆菌物种能发酵糖类和氨基酸。一直努力快速识别C固执的在文化的存在p-cresol和己酸。8日,9然而,这种方法并不广泛使用与我们的方法需要培养有机体才能被识别。
董事会光谱抗生素抑制的增长大肠杆菌而允许的过度生长C固执的。从而减少生产甲基吲哚在患者感染可能是新陈代谢的破坏的结果大肠杆菌。这个解释为概要文件从粪便样品的挥发性有机化合物的仪器得到事实的支持C固执的不会产生色氨酸的吲哚。10值得注意的是凳子从病人接受抗生素预防在调节BMT不包含3-methylindole,符合镇压大肠杆菌、但是没有呋喃在这些样本,支持之间的关系C固执的和呋喃。
多个酶免疫测定可能会提供一个快速测试C固执的。11elisa有70 - 90%的敏感性和特异性为99%。12尽可能快,他们不是用于病人测试和附近仍依赖于运输微生物实验室。这反映在诊断延迟Johal和他的同事们报告的8.2天。4呋喃单独有一个敏感性(83 - 100%)和特异性(79 - 97%)与elisa附近,但潜在的病人测试。呋喃没有甲基吲哚具有不敏感(66 - 83%),但更具体(97 - 100%)。
乙dodecanoate是轮状病毒的诊断100%敏感。然而,这对轮状病毒标记的敏感性为97%,假阳性的结果。轮状病毒的诊断可能是错过了电子显微镜,特别是当病人有腺病毒和第二个病毒可能被忽视。另外,由轮状病毒引起的腹泻病在儿童比成年人更常见,乙dodecanoate可能仅仅表明粪便来自儿童。乙dodecanoate没有之前报道患者的轮状病毒虽然相对增加丙和丁酸已被报道。13我们发现尽管短链脂肪酸(C3-C5)是最丰富的轮状病毒,患者也有大量患者弯曲杆菌和C固执的,所以他们没有诊断价值。
由于贾第虫病和病毒以外的轮状病毒肠炎可以诊断特异性为100%,虽然灵敏度为61%,如果现在和氨乙基dodecanoate缺席,在挥发性有机化合物的仪器从腹泻病人粪便样本。没有这样的标志病毒性肠炎是前面描述的。
患者的结果弯曲杆菌感染是令人惊讶的。目前,我们得出这样的结论:萜烯和碳氢化合物从这些病人没有出现在挥发性有机化合物的仪器。
这种方法还有待观察是否可以应用于非传染性胃肠道功能紊乱;这是一个领域的积极探索。
我们所描述的结果可能是方法的依赖。改变萃取纤维和gc - ms可能揭示其他的协议相关的波动更加敏感和特定的标记。我们相信有能力改善蒸汽的速度分析。
我们已经表明,感染性腹泻患者粪便样本包含化学指纹特征可以用来做出诊断,而不需要复杂的操作,比如文化、ELISA、电子显微镜。还有待观察其他胃肠疾病可以通过这种方法诊断。气体从一个简单的顶部空间设备的使用应减少交叉感染的风险。附近的一个廉价的设备能力的发展病人诊断测试将会加速,节省时间和金钱。
确认
我们要感谢K加纳,西英格兰大学,布里斯托尔的援助气实验。这项工作是由一个奖项从布里斯托尔美国医院的慈善信托基金。