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背景和目的:来验证是否针对缺陷粘膜T细胞死亡构成英夫利昔单抗维持治疗的好处在克罗恩氏病,我们探索其体内proapoptotic效应治疗10周后,固有层及其体外杀活动T细胞(LPT)和外周血T细胞(PBT),与克罗恩病的病人。
方法:内镜小肠活检收集从10克罗恩病病人(6类固醇耐火材料和四个fistulising)之前和之后连续三英夫利昔单抗的注入,在周0,2和6在一个静脉注射剂量(5毫克/公斤),和来自10个受试者被证明有功能性腹泻。TUNEL检测细胞凋亡测定体内,体外isothiocyanate-annexin V / propidium碘荧光素染色在并口和PBT节段性回肠炎患者培养英夫利昔单抗。广泛的半胱天冬酶抑制剂的效果Z-VAD-FMK和中和anti-Fas抗体ZB4测试体外LPT与PBT英夫利昔单抗。Caspase-3活动是由免疫印迹。
结果:在克罗恩病病人,英夫利昔单抗治疗诱导持续LPT凋亡,4周后最后注入仍然明显。体外诱导英夫利昔单抗死的涡轮节段性回肠炎患者通过凋亡而不是发生坏死。下显示对英夫利昔单抗诱导细胞凋亡的敏感性高于PBT在克罗恩病的病人。信号通路的底层恢复英夫利昔单抗通过半胱天冬酶通路涡轮诱导细胞凋亡发生但不是Fas-Fas配体相互作用在克罗恩病。
结论:这些发现表明,细胞凋亡的主要机制是英夫利昔单抗对克罗恩病的涡轮杀害活动。持续LPT proapoptotic英夫利昔单抗的作用,远远超过其循环半衰期,可能负责持续缓解由英夫利昔单抗处理诱导克罗恩病病人。
- 细胞凋亡
- 克罗恩氏病
- 英夫利昔单抗
- 固有层淋巴细胞
- caspase-3
- CDAI,克罗恩病活动指数
- EDTA(乙二胺四乙酸
- FasL, Fas配体
- FCS,胎牛血清
- FITC,异硫氰酸荧光素
- ,白介素
- 下,固有层T细胞
- PBS,磷酸缓冲盐
- PBT、外周血T细胞
- PDAI,肛周疾病活动指数
- π,propidium碘化
- 肿瘤坏死因子,肿瘤坏死因子
- 三磷酸,TUNEL末端转移酶介导的digoxigenin-deoxyuridine尼克结束标签
- -monofluoroketone Z-VAD-FMK Z-Val-Ala-Asp(转化)
来自Altmetric.com的统计
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- -monofluoroketone Z-VAD-FMK Z-Val-Ala-Asp(转化)
肠道炎症是伴随着过度免疫细胞生存在克罗恩氏病,1,2代理有能力增加T细胞凋亡,如图所示最近在实验结肠炎的封锁白介素(IL) -123或il - 6反式信号通路,4可能特别有效治疗这种情况的一种形式。提出了促进免疫细胞凋亡的主要机制,英夫利昔单抗治疗的好处,5,6嵌合单克隆抗体对人体肿瘤坏死因子α(TNF-α),在对照试验证明是有效的在类固醇耐火材料和fistulising克罗恩氏病。7,8
然而,许多问题仍然存在。迄今为止,英夫利昔单抗的proapoptotic活动一直在探索体外周边单核细胞从克罗恩病的病人5和CD3 / CD28 Jurkat激活T细胞,6在固有层,只有体内T细胞(LPT),6英夫利昔单抗行动的主要目标。9此外,英夫利昔单抗也已被证明能够杀死肿瘤坏死因子表达细胞诱导裂解通过补体的激活或抗体依赖的细胞介导的细胞毒性,10应该确定英夫利昔单抗对杀害活动专门通过细胞凋亡在克罗恩病。
在目前的研究中,我们测试了体外英夫利昔单抗诱导T细胞的死亡与肠道病变节段性回肠炎患者。此外,调查表明机械转导英夫利昔单抗在克罗恩病、caspase-3活动确定,一个广泛的半胱天冬酶抑制剂和anti-Fas抑制性抗体被添加到LPT培养与英夫利昔单抗。
患者和方法
病人
连续十公司克罗恩病的诊断患者(平均年龄34.2岁(范围22-51)候选人和英夫利昔单抗治疗,因为他们是类固醇耐火材料(6患者对糖皮质激素强的松40毫克当量每天8周或更多的稳定剂至少两周)或受fistulising疾病(四个病人耐火材料标准用抗生素治疗或用药6个月以上,稳定剂包含之前至少8周)。克罗恩病的诊断是根据一般的临床标准确定,11网站和疾病程度经内镜,组织学,在所有的病人灌肠。没有一个病人曾经历了resective手术,一直与环孢菌素、甲氨蝶呤治疗或症状性狭窄,狭窄,或脓肿。
治疗和评估
克罗恩病病人连续收到三个注入英夫利昔单抗(Remicade、先灵葆雅、米兰、意大利)在周0,2,6的剂量5毫克/公斤。伴随治疗5-aminosalicylic酸或sulphasalazine继续。6类固醇难治性患者,类固醇是锥形,然后停止。没有病人收到咪唑硫嘌呤、环孢菌素或甲氨蝶呤在整个研究。
全结肠镜检查和ileoscopy立即执行开始之前的治疗10周后,集合多个大小适当的回肠和结肠活检标本。英夫利昔单抗注入之前,活检是从宏观上发炎领域,治疗后治疗前收集来自同一个地区。回肠和结肠活检标本也从10个科目(平均年龄38.2岁(范围- 62)21日)他们发现功能性腹泻的诊断。
的节段性回肠炎患者的活检样本,英夫利昔单抗治疗前后,并立即控制中性缓冲福尔马林固定在10%,嵌入在石蜡在24小时内,根据标准组织学和免疫组织化学的方法进行处理。患者在治疗和控制的其他样本被用来获得纯化LPT停业。外周血T细胞(PBT)与乙二胺四乙酸(EDTA)治疗血液,来自克罗恩病病人之前,英夫利昔单抗治疗和控制。每个病人知情同意了这项研究。
疾病活动评估克罗恩病活动指数(CDAI)。分数低于150患者被列为与分数高于450缓解而严重的疾病。11与fistulising疾病组中,我们还测量了肛周疾病活动指数(PDAI)这是一个综合得分从0到20,得分越高表明更严重的疾病。12CDAI和PDAI测定一周内输注前和后10周。临床反应定义为CDAI下降70点以上的类固醇难治性患者,或者减少数量,尺寸,排水,或不适与瘘(s)在fistulising疾病有关。完全缓解的定义,分别作为CDAI < 150分或停止瘘引流瘘管和总关闭。克罗恩病的临床特征的病人都是在表1。
体内实验
TUNEL检测
“原位”检测凋亡细胞,末端转移酶介导的digoxigenin-deoxyuridine三磷酸尼克结束标签(TUNEL),根据Gavrieli方法修改和他的同事们,13使用过氧化物酶ApopTag工具包(美国马里兰州Oncor, Gaithesburg)。部分与蛋白酶K消化20μg /毫升(西格玛化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)在室温下15分钟,然后洗了自来水。内源性过氧化物酶就熄了3%氢过氧化物酶20分钟,然后洗在磷酸缓冲盐(PBS)。在调湿平衡后,部分被孵化室与终端deoxynucleotidil转移酶酶一小时37°C。部分随后被浸泡在停止清洗缓冲30分钟,冲洗在PBS和此后孵化antidigoxigenin过氧化物酶在调湿室30分钟,其次是增加diaminobenzidine和过氧化氢1 - 3分钟,使色彩发展凋亡细胞核。最后,部分与哈里斯的苏木精复染色。作为一个积极的控制,一个Apoptag控制幻灯片的负控制是由疏忽而使用终端deoxynucleotidil转移酶酶在连续的部分。
CD3检测
确定TUNEL阳性细胞在T淋巴细胞,连续的部分是处理一个单克隆抗体anti-CD3 (Calbiochem,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。预处理是由孵化与链霉蛋白酶在室温下30分钟0.01 g % (Calbiochem)。
定量的阳性细胞
利用传统的光学显微镜,组织部分专家被蒙蔽的方式检查观察者。计数进行以恒定放大率(×1000)至少500的微分计算固有层单核细胞和结果表达阳性细胞的比例。
在体外实验中
细胞隔离
固有层淋巴细胞分离(如前所述)。14短暂,活检标本被安置在无菌培养基(PBS钙和镁自由、补充与100 U /毫升青霉素、链霉素100μg /毫升、和5%胎牛血清(FCS))。1毫米的上皮细胞层被EDTA(σ)和1毫米二硫苏糖醇(σ)。连续搅拌一个小时后37°C,上层清液被除去,剩下的组织处理1型胶原酶128 U /毫升(σ)与连续搅拌一个小时37°C。原油细胞悬液被允许站五分钟允许沉降的碎片。细胞上清液在Ficoll-Hypaque分层解决方案(法玛西亚精细化学品,法玛西亚公司,乌普萨拉,瑞典)隔离固有层淋巴细胞的密度梯度法。外周血淋巴细胞被Lymphoprep梯度离心法从heparinised外周血分离(Nicamed,奥斯陆,挪威),进一步纯化塑料坚持去除单核细胞。对T细胞净化,固有层和外周血淋巴细胞受到积极的选择使用磁珠控反CD3单克隆抗体(克隆HIT3a;正欲有限公司美国加州圣何塞)VarioMACS磁性细胞分离器(Miltenyi研究公司,奥本大学,加利福尼亚,美国)。产生的细胞群平均95%的可行性和纯度超过94%。
细胞培养
新鲜孤立克罗恩氏病和涡轮控制在37°C和PBT孵化有限公司5%2大气的18个小时anti-TNF-α抗体(英夫利昔单抗;先灵葆雅)添加到培养基不同浓度(1和5μg /毫升)或其同形像匹配控制(人类IgG1)。在平行实验,细胞接受英夫利昔单抗5μg /毫升的浓度或IgG1 preincubated 50μmol / L Z-Val-Ala-Asp(当地)-monofluoroketone (Z-VAD-FMK;Calbiochem),还存在不可逆的抑制剂,包括caspase-1 caspase-3, caspase-4, caspase-7,15或1μg /毫升ZB4 anti-Fas抑制性抗体(美国明尼苏达州Bayport Ancell公司)。细胞培养与抑制剂添加英夫利昔单抗或IgG1之前30分钟。人类Jurkat T细胞,培养在RPMI 1640含5% FCS,孵化用鼠标单克隆抗体反Fas(1μg / ml,克隆DX2;Calbiochem), Fas表达细胞凋亡的诱导物,用作积极控制ZB4 anti-Fas阻塞作用。定量的凋亡细胞培养是由流式细胞术与异硫氰酸荧光素(FITC)膜联蛋白V和propidium碘(π)染色。
细胞凋亡评价FITC-annexin V和π绑定
细胞凋亡是量化使用FITC-annexin V和π,根据制造商的协议(ApoDETECT FITC-annexin V设备;酶实验室Inc .,旧金山,加利福尼亚,美国)。细胞被沾5μl FITC-annexin V 1:10稀释的缓冲区,和2.5μlπ。孵化15分钟后,细胞通过流式细胞术分析标准FACScan设备(Becton Dickinson有限公司)。细胞发生凋亡的早期阶段是沾FITC-annexin V(细胞凋亡的比例)。晚期凋亡细胞被占用的能力杰出FITC-annexin V和π(死细胞的百分比)。活细胞染色负面的FITC-annexin V和π(细胞生存的百分比)。16细胞permeabilised皂素0.1%被用作控制π阳性细胞。
免疫印迹
细胞被洗在PBS和细胞溶解在冰冷的赖氨酸缓冲区包含20毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值7.6,150毫米氯化钠,1毫米phenylmethylsulphonyl氟化物,Triton-X 1%, 1毫米EDTA, 2毫米原钒酸钠,抑肽素10μg /毫升、10μg /毫升亮抑酶肽和10μg /毫升抑肽酶(σ)。在每个溶菌产物蛋白质浓度测定用皮尔斯蛋白质测定(皮尔斯,罗克福德,伊利诺斯州,美国)。等量的蛋白质(12μg)分数在12.5%钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶和electrotransferred硝化纤维素膜(美国加州Bio-Rad实验室、大力神)。膜被封锁与脱脂奶粉5%,其次是孵化90分钟在室温下用鼠标单克隆抗体anti-caspase-3 (Alexis有限公司、Lausen、瑞士)。膜是洗几次ttb和孵化90分钟在室温下与亲和纯化二次辣根过氧化物酶共轭antimouse IgG-horseradish过氧化物酶(美国加州圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯)。广泛的洗涤后,反应是由增强化学发光染色(超级信号;皮尔斯)。人类Jurkat T细胞,培养了七小时的2.5μg /毫升放线菌素D(σ),被用作积极控制。
统计分析
数据分析使用GraphPad棱镜统计电脑程序(GraphPad软件,圣地亚哥,加利福尼亚,美国)通过非参数Mann-Whitney U测试。单向方差分析(方差分析测试)是用于定义不同的凋亡细胞的比例获得的文化接受英夫利昔单抗的不同浓度。p < 0.05的值被认为是具有统计学意义。
结果
临床对治疗的反应
除了一个节段性回肠炎病人的临床改善英夫利昔单抗治疗10周后,如表1所示。中位数预处理CDAI(303)显著降低(p < 0.001) 10周后到191年。fistulising患者的子群,预处理中位数PDAI 10周后(11.5)下降到2.5。英夫利昔单抗冲剂是耐受性良好;只有一个病人经历了过敏反应在第三输液。
涡轮体内诱导细胞凋亡
细胞凋亡在克罗恩病病人的固有层,之前和英夫利昔单抗治疗10周后,使用TUNEL技术和控制检测。图1显示了与克罗恩病病人治疗前相比(图1),在他TUNEL积极性几乎完全被发现的隐窝上皮细胞,相当比例的固有层单核细胞TUNEL阳性在克罗恩病病人治疗后(图1 b)和控制(图1 c)。图1 d证实TUNEL阳性固有层的平均百分比单核细胞显著增加克罗恩病病人英夫利昔单抗治疗后从0.58%(范围0.12 - -1.07)到3.09%(范围1.49 - -6.64)。病人表现出一个完整的对治疗的反应表现出最高水平的固有层单核细胞凋亡,而一个人TUNEL阳性细胞的比例最低。节段性回肠炎患者之间没有显著差异被发现后,英夫利昔单抗和控制(中位数3.69%(范围2.57 - -7.54))。确定TUNEL阳性细胞在T淋巴细胞,连续的部分也与anti-CD3处理。我们观察到,CD3阳性细胞显示好colocalisation TUNEL积极性。LPT凋亡的比例并不受时间或剂量的类固醇治疗的影响。
检测凋亡细胞的末端转移酶介导的digoxigenin-deoxyuridine三磷酸尼克结束标签(TUNEL)染色在克罗恩病的患者,在(A)和(B)英夫利昔单抗治疗10周后,在正常肠粘膜(C),在克罗恩病病人在治疗之前,TUNEL积极性明显的上皮(箭头)但不固有层单核细胞在克罗恩病病人在治疗和控制,相当比例的固有层单核细胞TUNEL阳性(箭头)(原放大,×400)。(D)的百分比TUNEL阳性固有层单核细胞在10克罗恩病的患者和英夫利昔单抗治疗10周后,和10检查控制。四个完整的患者对治疗的反应,一个人用不同的符号表示(方形和三角形,分别)。单杠表示中位数的值。
涡轮体外诱导细胞凋亡
进一步验证英夫利昔单抗对它施加杀死涡轮活动,这些细胞被孤立的从肠道病变节段性回肠炎患者和控制肠道,英夫利昔单抗的培养,通过流式细胞仪分析FITC-annexin V和π染色。平行实验也进行了PBT克罗恩病病人和控制。在图2中,代表克罗恩病病人的结果表明,相比与IgG1 LPT培养(图2),LPT培养的5μg /毫升(图2 b)显示凋亡细胞的比例更高(FITC-annexin V正/π负)。平行结果图2中描述了PBT c和2 d。再次、PBT培养在英夫利昔单抗(图2 d)证明更容易比孵化与凋亡IgG1(图2 c),虽然不太敏感的发现了PBT比并口(图2 b)英夫利昔单抗行动。
流仪分析异硫氰酸荧光素(FITC)膜联蛋白V绑定和propidium碘(PI)的克罗恩病固有层T细胞(LPT) (A, B)和外周血T细胞(PBT)和英夫利昔单抗(C, D)培养。涡轮和PBT孵化与IgG1控制抗体(分别为A和C)和英夫利昔单抗5μg /毫升的浓度(B和D,分别)。每个面板显示了活细胞的左下象限(FITC-annexin V - /π-),右下象限代表凋亡细胞(FITC-annexin V正/π负),和右上象限包含不可行的死细胞(FITC-annexin V积极/π积极)。数字在点阴谋代表凋亡和坏死细胞的百分比。代表执行的实验的数据,在所有患有克罗恩氏病,显示凋亡的比例更高LPT接受英夫利昔单抗(B)相比,这些培养与IgG1同形像控制(A),涡轮的高敏感性(B)接受英夫利昔单抗诱导细胞凋亡与PBT (D)。双染色细胞的百分比低允许我们排除坏死膜损伤英夫利昔单抗治疗的结果。
如图2所示b,低FITC-annexin V积极/π阳性细胞百分比表示,英夫利昔单抗诱导凋亡,但不是坏死,细胞死亡的涡轮节段性回肠炎患者。这是确认在图3中,显示了可怜的百分比LPT坏死孵化后增加浓度(1和5μg /毫升)的英夫利昔单抗(平均2.4(1.2)%,平均3.9(1.8)%,分别)相比,相当大比例的细胞发生细胞凋亡(平均20.7(7.4)%,平均77.3(11.9)%,分别)。
百分比T细胞的凋亡和坏死固有层(LPT)节段性回肠炎患者,评估流仪分析荧光素isothiocyanate-annexin V /碘化propidium绑定。LPT与IgG1孵化的控制抗体和英夫利昔单抗浓度1和5μg /毫升。结果意味着(SD)。
如图4所示,在克罗恩病病人的比例凋亡并口(平均2.4(1.3)%)明显提高孵化与1和5μg /毫升英夫利昔单抗浓度增加到20.7 (7.4)% (p < 0.01)和77.3 (11.9)% (p < 0.0001),分别。至于PBT,凋亡细胞的比例(平均13.8(3.1)%)增加到17.5(5.8)%和42.1(6.7)%,但这种差异5μg /毫升英夫利昔单抗后才达到统计学意义(p < 0.01)。在实验中执行控制抗体的存在,显著降低细胞凋亡在克罗恩氏LPT与PBT(意思分别为2.4%和13.8%;p < 0.01)。在涡轮控制和PBT(图4),英夫利昔单抗凋亡细胞的比例增加平均3.5(4.7)% 19.4(6.7)%和45.1(7.3)%,从平均15.1(3.6)% 18.8(5.8)%和41.2(6.4)%,分别有显著差异(p < 0.01)只有在细胞培养控制抗体和英夫利昔单抗5μg /毫升。当比较控制涡轮和PBT、无显著差异被发现在细胞凋亡的比例,控制存在的抗体或英夫利昔单抗。
英夫利昔单抗对固有层的影响T细胞(LPT)和外周血T细胞(PBT)从10克罗恩病病人和对照组。细胞培养与英夫利昔单抗在不同浓度添加到培养基(1和5μg /毫升)或其同形像匹配控制(人类IgG1)。凋亡细胞的比例是由流量仪的分析化验荧光素isothiocyanate-annexin V /碘化propidium绑定。结果意味着(SD)。
验证哪些途径参与LPT英夫利昔单抗诱导细胞凋亡在克罗恩氏病,我们测试的可能影响敌对ZB4 anti-Fas抑制性抗体14Z-VAD-FMK广谱半胱天冬酶抑制剂,15和调查的激活状态效应caspase-3 LPT与英夫利昔单抗治疗。图5显示阻塞Fas-Fas配体(FasL)交互通过预培养中和anti-Fas抗体没有减少LPT英夫利昔单抗诱导细胞凋亡在克罗恩病的病人。Fas表达Jurkat T细胞,刺激进行程序化死亡的细胞凋亡诱导物anti-Fas抗体,被用作一个积极控制ZB4 anti-Fas阻塞作用(图5)。相比之下,半胱天冬酶抑制Z-VAD-FMK显著降低英夫利昔单抗诱导细胞凋亡的涡轮节段性回肠炎患者从平均77.3(11.9)% 6.1(2.1)%(图5 b)。半胱天冬酶依赖英夫利昔单抗诱导细胞凋亡也观察到在克罗恩病病人的PBT(从平均42.1(6.7)% 5.2(1.9)%),而在对照组的并口(从平均45.1(7.3)% 4.9(1.8)%)和PBT(从平均41.2 (6.4)% 7.1 (2.2)%)。在图6中,代表克罗恩病病人的结果表明,与IgG1 LPT培养相比,LPT培养与英夫利昔单抗浓度增加(1和5μg /毫升)体现一个增强caspase-3激活,如图所示的剂量依赖性增加其活性形式,p12亚基。
半胱天冬酶的参与信号转导途径而不是Fas-Fas配体相互作用的英夫利昔单抗诱导细胞凋亡在克罗恩病固有层T细胞(LPT)。涡轮(A) 10克罗恩病肠道病变的患者接受英夫利昔单抗5μg /毫升的浓度或IgG1同形像控制、预培养后ZB4 anti-Fas抑制性抗体。Jurkat T细胞在RPMI 1640培养基培养,以刺激凋亡孵化用鼠标单克隆抗体(摩),反人类的Fas Fas表达细胞凋亡的诱导物,被用作一个积极控制ZB4 anti-Fas阻塞作用。(B) LPT与肠道病变10克罗恩病的患者,接受英夫利昔单抗5μg /毫升的浓度或IgG1同形像控制与Z-Val-Ala-Asp preincubated(当地)-monofluoroketone (Z-VAD-FMK)半胱天冬酶抑制剂。定量的凋亡细胞细胞培养是由流式细胞仪和荧光素isothiocyanate-annexin V和propidium碘染色。结果意味着(SD)。* * * p < 0.0001和Jurkat T细胞培养在缺乏ZB4 anti-Fas抑制性抗体;†††p < 0.0001与细胞培养在Z-VAD-FMK的缺失。
caspase-3参与英夫利昔单抗诱导细胞凋亡在克罗恩病固有层T细胞(LPT)。并口的肠道病变节段性回肠炎患者接受英夫利昔单抗在不同浓度(1和5μg /毫升)或IgG1。Jurkat T细胞,培养了七小时没有或2.5μg /毫升的放线菌素D (D),被用作控制。Caspase-3活动是由免疫印迹分析。32的污点显示了两个乐队和12 kDa,对应proform caspase-3活性形式,分别。执行的实验数据是代表克罗恩病的患者。
讨论
在当前的研究中,我们调查是否针对缺陷粘膜T细胞死亡构成英夫利昔单抗维持治疗的好处在克罗恩氏病和首次探讨了英夫利昔单抗的能力诱导T细胞的死亡与肠道病变节段性回肠炎患者。我们表明,英夫利昔单抗的行为通过诱导细胞凋亡而不是并口的坏死,信号通路的底层这个动作不是由Fas依赖但是需要半胱天冬酶的激活机制。
研究之间的关系的临床反应涡轮英夫利昔单抗治疗和体内细胞凋亡,前后肠活检在内窥镜检查治疗10周分析凋亡细胞使用TUNEL技术。有趣的是,LPT凋亡疗法被发现后不仅显著增加,治疗10周后正常。这一发现进一步增加了我们的知识的体内proapoptotic英夫利昔单抗的活动。后者的特征不仅是行动的迅速出现,已报道出现在治疗后24小时内,6但同样重要的是诱发持续LPT proapoptic行动仍可检测最后灌注后4周。这持续的行动很可能负责持久缓解由英夫利昔单抗处理诱导克罗恩病病人每八周。17实验调查的模式下凋亡再处理期间在我们实验室目前正在接受调查。LPT细胞凋亡之间的关系和临床反应在克罗恩病病人治疗后进一步证实了英夫利昔单抗的作用发挥其治疗效果对有缺陷的T细胞凋亡在这种情况下。
本研究的另一个目的是为了更好地阐明英夫利昔单抗的机制发挥其治疗中获益。TNF-α被认为是集中参与克罗恩病的发病机制和炎症级联中发挥关键作用。18作为英夫利昔单抗中和TNF-α通过阻断可溶性细胞因子和跨膜TNF-α绑定,这种机制已经声称解释其临床疗效。19然而,唯一的抑制TNF-α可能不足以证明所有的临床改善观察,与pentoxifylline最近的一项研究,另一个TNF-α抑制行为通过增加阵营浓度,20.未能在耐火克罗恩氏病是有效的。21这一发现的证据表明,英夫利昔单抗治疗的影响远远超出其循环半衰期,22强烈建议其行动可能不仅仅是中和TNF-α更加复杂。
Scallon和他的同事们10是第一个为了更清楚地了解英夫利昔单抗可能工作机制,进一步表明anti-TNF-α抗体调节小鼠骨髓瘤细胞的裂解表达变异人类TNF-α补体的激活和抗体依赖细胞的细胞毒性。随后,英夫利昔单抗据报道的外周单核细胞诱导凋亡类固醇耐火节段性回肠炎患者。5尽管众所周知,单核细胞和巨噬细胞可溶性TNF-α的主要生产商,23日,24自英夫利昔单抗似乎发挥proapoptotic行动结合膜TNF-α有关,5注意力一直集中在T淋巴细胞,表达大量的跨膜的形式。25最近,十抛等表明,涡轮,已知抗细胞凋亡在克罗恩氏病,26体现快速增加TUNEL积极性英夫利昔单抗后注入类固醇难治性患者。6然而,在研究英夫利昔单抗的proapoptotic行动不是测试直接在粘膜T细胞Jurkat T细胞系,细胞溶菌作用和可能发生的目标,因此英夫利昔单抗的行动,并没有排除十抛和他的同事们。6
在我们的研究中,双重染色FITC-annexin V和π,这使得它可以量化凋亡和受损细胞的百分比,16表明,坏死细胞的比例微不足道相比细胞发生程序性死亡。虽然我们不能排除补体依赖细胞毒性作用在调节体内英夫利昔单抗在低压涡轮杀戮行动,我们的体外系统补充自由,我们可以说明抗体依赖细胞细胞毒性并不扮演重要角色在英夫利昔单抗诱导淋巴细胞死亡。获得的结果之间的差异和Scallon和同事10可能在于使用不同目标的英夫利昔单抗action-human并口和小鼠骨髓瘤细胞表达突变的人类肿瘤坏死因子,分别。很重要的是,在克罗恩氏病,英夫利昔单抗通过细胞凋亡诱导下发生的死亡而不是坏死。这样可以确保更有效和快速行动恢复免疫内稳态肠道发炎,避免炎症介质的释放、细胞碎片,这可能放大而不是阻碍了异常的免疫反应。
相比显著降低细胞凋亡在LPT与克罗恩病的患者似乎PBT加强凋亡不足是粘膜固有缺陷的假设在克罗恩病。因此,当我们比较英夫利昔单抗的影响下对PBT,在克罗恩氏病,我们观察到以PBT凋亡的敏感性较低。这种低磁化率是在良好的协议与之前报道缺乏明显降低英夫利昔单抗治疗后外周血单核细胞计数。6此外,干扰素γ和TNF-α生产减少了刺激固有层单核细胞在缺乏变化的比例外周血单核细胞产生相同的细胞因子在克罗恩病最近报告英夫利昔单抗治疗后患者。27这些数据进一步加强假设英夫利昔单抗在肠粘膜产生局部抗炎作用没有系统性免疫抑制,从而解释了为什么机会性感染患者并未在克罗恩病中观察到这种药。28
克罗恩氏低压涡轮高磁化率与PBT支持十抛的假说和同事6体外实验的基础上他们的CD3 / T细胞CD28刺激和休息Jurkat:英夫利昔单抗的proapoptotic行动主要是T细胞活化相关的。同样,克罗恩氏涡轮凋亡的比例显著高于控制,并口和PBT细胞凋亡的增加,孵化后明显5μg / ml英夫利昔单抗,可能代表这高剂量的非特异性作用。
众所周知,Fas-FasL表达密切相关淋巴细胞激活过程中,是至关重要的,他们的相互交互控制和终止。29日虽然Fas-FasL系统已被证明调解肠道淋巴细胞凋亡在正常肠,30.T细胞从克罗恩病病变对Fas介导细胞凋亡。31日我们目前的结果确实确认阻塞Fas-FasL交互添加中和抗体对Fas并不影响涡轮英夫利昔单抗诱导细胞凋亡。因为它最近报道,还存在有至关重要的作用下凋亡的规定,32,英夫利昔单抗诱导外周单核细胞凋亡蛋白水解激活启动程序需要caspase-8 caspase-9,随后激活效应caspase-3,5我们调查的角色caspase-3 T细胞凋亡信号转导的机械由英夫利昔单抗在克罗恩病。涡轮诱导细胞凋亡的观察英夫利昔单抗原因caspase-3激活,一起的证据明显抑制T细胞凋亡的广谱半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK,15表明,英夫利昔单抗的作用严格取决于半胱天冬酶的激活。还存在的证据表明,遗传多态性33岁的34加强药物基因组学在英夫利昔单抗治疗的关键作用。35
总之,如果我们的研究表明,半胱天冬酶相关的细胞凋亡是细胞死亡的主要形式发生在LPT英夫利昔单抗治疗后,我们不能排除其他机制可能是负责英夫利昔单抗在克罗恩病的有利影响。有趣的是,最近的示威,英夫利昔单抗对骨髓增生异常综合征的治疗作用和相关的类风湿性关节炎慢性贫血,保护骨髓红细胞细胞凋亡36岁,37表明该代理的假定的角色改善克罗恩病相关的慢性贫血的逆转机制发挥对T细胞。因此可以想见,英夫利昔单抗可以赞成或凋亡的方式根据靶细胞的类型。此外,需要注意的是,英夫利昔单抗的信号通路转导proapoptotic行动是不同的在不同的细胞systems-Fas依赖类风湿性滑膜细胞38或在克罗恩氏Fas独立周边单核细胞5和并口。
解剖复杂的机械英夫利昔单抗的作用将提供有趣的答案提出的许多问题的成功使用克罗恩氏病和将显示在任何病理条件下持续治疗的潜在影响T细胞凋亡的一个缺陷。