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摘要
背景与目的:许多神经内分泌胃肠道肿瘤表达调节肽生长抑素的受体。在现有的五种生长抑素受体(sst)亚型中，sst2A在这些肿瘤中表达最频繁。然而，关于sst2A在相应的非肿瘤性上皮组织中的细胞位置的信息很少。
方法:我们在非肿瘤性胃肠道组织中寻找sst2A免疫反应细胞，并利用神经内分泌标志物评估其数量和免疫组化特征。
结果:胃窦中可见大量sst2A细胞，位于上皮细胞中，与含有胃泌素的神经内分泌细胞相对应，而胃体中基本没有sst2A细胞，包括肠染色质样细胞。其余的前肠，即十二指肠和空肠近端，也含有大量的sst2A细胞，都是神经内分泌细胞，其中许多具有胃泌素细胞的特征。在中肠中也检测到Sst2A细胞，在远端空肠和回肠的上皮中数量较少，但在阑尾、盲肠或后肠中没有，尽管该区域存在大量的神经内分泌细胞。此外，sst2A细胞在整个胃肠道的肌内神经丛和粘膜下神经丛中均有发现。
结论:虽然胃窦胃泌素细胞上的sst2A受体可能介导生长抑素抑制胃泌素分泌，但生长抑素对下胃肠道运动和离子运输的影响可能是由神经丛中的sst2A受体介导的。这些数据为生长抑素在人体胃肠组织中的生理作用提供了分子基础。
- 生长抑素受体
- 发射极耦合逻辑,enterochromaffin-like
- TBS, Tris缓冲盐水
- CgA, chromograninA
- HDC，组氨酸脱羧酶
- 生长激素抑制素受体
- 非肿瘤性胃肠组织
- 生理学
- 上皮细胞
- 神经内分泌肿瘤
数据来自Altmetric.com
生长抑素受体(sst)经常在肠道的神经内分泌肿瘤中表达1，2因此，为生长抑素类似物在体内靶向这些肿瘤提供了基础。3 -5例如，奥曲肽治疗的有益作用，一种稳定的生长抑素类似物，在表达肠道神经内分泌肿瘤的生长抑素受体中激素分泌3.有很好的记录。此外,(111In-DTPA0-奥曲肽已成功地用于体内受体闪烁检测这些肿瘤。4此外，放射治疗90Y-DOTATOC已在临床I期研究中进行，显示大多数终末期癌症患者病情缓解或稳定。4
与癌症相比，关于sst蛋白在非肿瘤性人类肠道组织中的细胞定位的信息是有限的。体外放射受体自显影法在非肿瘤性肠黏膜、淋巴组织、神经丛、黏膜缘圆形平滑肌和脉管系统中检测到sst2，6 -8但没有精确的细胞定位，也没有受体亚型说明。在非肿瘤性结肠组织中，原位mRNA杂交和逆转录聚合酶链反应检测到所有亚型，最常见的是sst2或sst5，定位于上皮和固有层。9，10
在目前的研究中，我们利用了一种非常典型的sst抗体R2-88，11发现了神经内分泌肿瘤中最丰富的sst亚型之一，即剪接变异sst2A。12免疫组化可在福尔马林固定组织上进行，这是最常用的固定组织，可检测到单细胞。因此，我们评估了sst2A蛋白在人类肠道不同部位的非肿瘤性福尔马林固定组织中的存在。我们将结果与连续切片上的神经内分泌标志物进行比较。在胃窦中，冷冻组织的sst受体自放射成像结果与sst2A免疫组化结果相关。sst2在正常人体组织中的分布知识为生长抑素的生理学提供了新的见解。它也可能对了解sst2阳性神经内分泌肿瘤的致癌作用有价值。
材料与方法
组织
从病理研究所收集的切除标本中选择福尔马林固定石蜡包埋的组织样本，显示垂直于粘膜表面的切片上组织学正常的非肿瘤组织。每个解剖位置收集组织样本(表1)。
受体放射自显影法
将冰冻的胃窦和胃体切片在室温下孵育2小时125I-labelled[酪氨酸3.-奥曲肽，优先识别sst2，或与125我-亮氨酸8, DTrp22,酪氨酸25] -SS-28 (125I-LTT-SS-28)为通用配体，如前所述。1用sst选择性类似物评估这些配体从结合位点的位移，2即sst2选择性的L-779,976, sst3选择性的315-164-15(也称为sst3- odn -8)，以及sst5选择性的L-817,818125I-labelled[酪氨酸3.]-奥曲肽，以及sst1选择性的CH-288和sst4选择性的L-803,087125I-LTT-SS-28。清洗切片后，用BiomaxMR胶片(柯达，洛桑，瑞士)对映一周x雷磁带。在平行切片中，用相同浓度的标记肽在10−6mol/l的未标记奥曲肽或SS-28。
免疫组织化学
我们使用针对sst2A受体羧基末端区域一个独特序列的兔多克隆抗体R2-88，该序列与大鼠蛋白中的339-359氨基酸相对应。在人、大鼠和小鼠的sst2A受体蛋白中发现了相同的序列，因此该抗体在新鲜冷冻和福尔马林固定的石蜡包埋样品上都显示出高度特异性。12福尔马林固定石蜡包埋切片，切成2 ~ 3 μm，脱蜡，再水合，在100 mM Tris中加5%尿素，pH 9.5，高压锅中煮5分钟。预处理后(并遵循所有后续步骤)，切片在Tris缓冲盐水(TBS)中清洗。切片与sst2A抗体在含1%牛血清白蛋白、5%正常山羊血清和0.1% NaN的TBS中1:2000稀释后室温孵育过夜3.．切片用生物素化的山羊-抗兔抗体(1:200;缓冲液与一抗相同;DakoCytomation, Glostrup，丹麦)，然后用亲和素-生物素复合物/辣根过氧化物酶(DakoCytomation;1:120 TBS)。最后，用0.05% 3,3 ' -二氨基联苯胺和H2O2用苏木精微弱地反染，并装好。对于所有病例，额外的相邻组织切片与染色前预吸收过量(100 nM)肽抗原的主sst2A抗体孵育，作为特异性对照。
此外，我们用以下市售兔多克隆抗体对一系列切片进行免疫组化染色:胃泌素(1:300)，嗜铬粒ina (CgA;1:30 00)，蛋白S100(1:800，作为周围神经细胞的标记)(均来自DakoCytomation)，组氨酸脱羧酶(HDC;1:20 00;Progen，海德堡，德国)。脱蜡和复水后，切片在10mm柠檬酸缓冲液中，pH为6.0，在高压锅中煮5分钟(CgA，胃蛋白酶)或10分钟(HDC)。预处理后，切片在室温下用CgA、蛋白S100、HDC或胃泌素稀释在含0.5%酪蛋白钠盐和5%山羊血清的TBS中孵育60分钟。随后，切片用生物素化的二抗(1:500)孵育，然后用链霉亲和素-生物素复合物/碱性磷酸酶(1:200 TBS)孵育(均为DakoCytomation)。切片用新型紫红-萘酚AS-BI显影，用苏木精弱反染，并裱片。
在前庭标本中，我们对福尔马林固定石蜡包埋切片进行免疫荧光双染色。一抗包括上述兔多克隆抗体sst2A和小鼠抗人CgA单克隆抗体(克隆daka - a3;DakoCytomation)。切片以2 ~ 3 μm的高度切割，脱蜡，再水合，在100 mM Tris中加入5%尿素，pH 9.5，在微波炉中煮沸。切片在室温下用1:100稀释的CgA和1:100稀释的sst2A在含0.5%酪蛋白钠盐和5%山羊血清的TBS中孵育过夜。用红色(Alexa Fluor 546)和绿色(Alexa Fluor 488)荧光色素标记的二抗(Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA)来观察目标结构。山羊抗兔Ig抗体1:60，山羊抗鼠Ig抗体1:300，孵育45分钟。
受体阳性细胞/cm黏膜的估计
组织标本在低倍率(1.25×物镜，目镜10倍)下拍摄。然后测量肌层的长度，拍照切片垂直于粘膜表面切割。在连续切片上，以中等放大倍率(10倍物镜，10倍目镜)计数上皮细胞中免疫组化阳性细胞的数量，以便在视野内看到整个粘膜高度。对于不同的解剖部位，组织样本的粘膜总长度最小为3.3 cm(体)，最大为7.2 cm(结肠)。计算各解剖部位的中位数(SD)计数/cm黏膜。计数/厘米粘膜可以与公布的计数/厘米进行比较2基于2 μm的截面厚度。
结果
Sst2A受体蛋白在非肿瘤性肠道的多个位置进行免疫组化表达(表2)。
在上肠中，sst2A细胞在胃窦粘膜中最多(表2)，位于从凹窝到腺体过渡的上皮细胞中。在低倍放大下，sst2A阳性细胞形成了与CgA和胃泌素阳性区域相当的线性区(图1A)。这与受体放射自显影实验中在同一位置的线性结合区有很好的相关性125I-labelled[酪氨酸3.-奥曲肽(图1B)。配体与未标记的sst2、sst3和sst5选择性类似物的置换揭示了亚型2的优势(图1B)。高倍镜下，sst2A精细地膜结合在位于粘膜凹部基底膜的篮状细胞中(图2)。在连续切片上，这些细胞都属于该区域较大的CgA细胞群。此外，位于细胞质中的胃泌素始终呈阳性(图1,2)。
胃窦免疫组化(A)和受体放射自显像(B)的比较。(A)胃窦免疫组化检测细胞的定位。第一排:生长抑素受体2A (sst2A)细胞位于腺体颈部。它们代表一个线性区域，在虚线之间表示。较浅层的染色是非膜性和非特异性的。第2行和第3行:胃泌素和CgA细胞分别定位于与sst2A细胞相同的区域。第四行:肽预吸收作为sst2A的阴性对照，显示残留的非特异性非膜性染色。Bar 100 μm。(B)胃窦中sst受体亚型的自放射成像。第一排:苏木精伊红染色切片。 2nd row: Autoradiogram showing total binding of the ligand125I-[Tyr3]-奥曲肽在腺体颈部。第三行:放射自动显像显示125I-[Tyr3]-奥曲肽结合存在100 nM的sst2选择性配体(L-779,976)。可以看到放射性配基的完全位移。第4和第5行:自动显像显示125I-[Tyr3]-奥曲肽在100 nM的sst3选择性配体(315-164-15)和100 nM的sst5选择性配体(L-817,818)存在下结合。未见结扎移位。第6行:非特异性结合(100 nM奥曲肽存在时)。sst2选择性配体标记的完全取代表明sst2受体的存在。Bar 1000 μm。
连续组织切片和荧光标记双染色对前庭中生长抑素受体2A (sst2A)细胞的免疫组化特征。连续切片免疫组化。(A)腺体颈部篮状细胞中sst2A蛋白特异性很强的膜性染色。(B) (A)中的Sst2A细胞经胃泌素蛋白细胞质染色鉴定为胃泌素细胞。Bar 10 μm。免疫荧光双染色sst2A (C1, Alexa Fluor488)和嗜铬粒ina (CgA) (C2, Alexa Fluor546)。在同一细胞中检测到膜性sst2A和细胞质CgA染色。
序列切片结果经sst2A和CgA联合双免疫荧光染色进一步证实，在腺体颈部的凹处发现单个双阳性细胞，呈篮状或椭圆形，基底膜为基础，如上所述，有膜结合的sst2A和细胞质CgA(图2)。我们在胃体上皮中未检测到sst2A细胞。一方面，通过CgA免疫组化，我们在这个位置识别了所有的神经内分泌细胞。另一方面，我们通过特异性HDC免疫染色检测肠染色质样(ECL)细胞。这些ECL细胞分布于体下部。即使在连续切片中聚焦这些ECL细胞，也未检测到sst2A。与此一致的是，在受体放射自显像中，我们没有在体粘膜中检测到sst2。有趣的是，在含有正常粘膜、增厚性ECL细胞病变和/或ECL细胞肿瘤的样本中，只有增厚性和肿瘤表达了大量膜结合的sst2A(见下图)。
十二指肠和空肠近端也有上皮性sst2A细胞，空肠远端和回肠仅检出罕见的sst2A细胞(表2)。图3为具有代表性的十二指肠组织切片，连续切片进行sst2A和CgA免疫组化染色。染色的上皮细胞为黑色或橙色圆圈。黑圈表示单个sst2A阳性细胞，在序列切片上CgA也呈阳性。在本例中，所有sst2A细胞都被鉴定为CgA细胞。橙色圆圈识别了CgA阳性细胞，这些细胞不是sst2A阳性，给出了该位置不同细胞类型之间的定量比例。sst2A细胞分布不均，常位于绒毛内。
![Comparison of immunohistochemistry (A) and receptor autoradiography (B) in the gastric antrum. (A) Localisation of immunohistochemically detected cells in the gastric antrum. 1st row: somatostatin receptor 2A (sst2A) cells lie at the neck of the glands. They represent a linear zone, indicated between the broken lines. Staining of the more superficial layers was non-membranous and non-specific. 2nd and 3rd rows: Gastrin and CgA cells, respectively, were localised in the same region as sst2A cells. 4th row: Peptide preabsorption as a negative control for sst2A showing residual non-specific non-membranous staining. Bar 100 μm. (B) Receptor autoradiographic illustration of sst receptor subtypes in the gastric antrum. 1st row: Haematoxylin and eosin (HE) stained section. 2nd row: Autoradiogram showing total binding of the ligand 125I-[Tyr3]-octreotide at the neck of the glands. 3rd row: Autoradiogram showing 125I-[Tyr3]-octreotide binding in the presence of 100 nM of an sst2 selective ligand (L-779,976). Complete displacement of the radioligand is seen. 4th and 5th rows: Autoradiograms showing 125I-[Tyr3]-octreotide binding in the presence of 100 nM of an sst3 selective ligand (315-164-15) and 100 nM of an sst5 selective ligand (L-817,818). No displacement of binding was seen. 6th row: Non-specific binding (in the presence of 100 nM octreotide). Complete displacement of labelling by the sst2 selective ligand indicates the presence of sst2 receptors. Bar 1000 μm.](http://www.marcconsult.com/content/gutjnl/53/10/1431/F1.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
十二指肠连续切片上生长抑素受体2A (sst2A)和嗜铬粒氨酸(CgA)免疫组化的代表性数据。Bars 100 μm。右图插图为框区放大图(柱状图25 μm)。第一排:Sst2A免疫组化;第二行CgA免疫组化。染色的上皮细胞周围呈黑色或橙色。黑色圆圈表示在第二行序列切片上也进行CgA染色的单个sst2A细胞。在本例中，所有sst2A细胞均被鉴定为CgA阳性。作为比较，橙色圆圈识别的CgA阳性细胞不是sst2A阳性。Sst2A细胞分布不均，多位于绒毛内。 Tall and flask-like cells revealed mainly membranous sst2A and cytoplasmic CgA staining.
在阑尾蚓状、结肠和直肠中，尽管检测到大量神经内分泌CgA阳性细胞，但上皮细胞中未检测到sst2A细胞(表2)。相反，在粘膜下层和肌层中，神经节细胞sst2A显著阳性(图4)，并在连续切片上通过其周围神经细胞标记蛋白S100阳性鉴定为神经细胞。我们在整个胃肠道包括胃、十二指肠、空肠、回肠、阑尾、结肠和直肠的肌肠和粘膜下丛中发现了sst2A细胞。
代表性生长抑素受体2A (sst2A)回肠免疫组化。Sst2A细胞通常呈簇状(左上框区)。Bar 100 μm。右边的插图是三个框区的放大图(柱状图25 μm)。上、中:上皮性的、高的、瓶状的sst2A细胞，呈膜性染色。下:神经节细胞显示膜性和/或微弱的细胞质反应性。
需要注意的是，本研究中CgA和胃泌素免疫组化检测的细胞数/cm黏膜均在既往研究范围内。13，14
作为比较，图5显示了sst2A在各种肠道神经内分泌病变中的阳性程度，使用相同的免疫组化方法:ECL细胞增生以及胃的ECL细胞肿瘤、十二指肠的胃泌素瘤和回肠类癌，都在增生或肿瘤细胞的膜上强烈表达sst2A。
免疫组化生长抑素受体2A (sst2A)阳性肠道神经内分泌病变。膜结合sst2A染色可见于增生性肠染色质样(ECL)细胞聚集物(箭头，A)和胃体的ECL细胞瘤(B)，以及乳头的胃泌素瘤(C)和空肠的类癌(D)。棒材10 μm。
讨论
这是免疫组织化学首次在非肿瘤性人类肠道上皮细胞水平检测到sst2A蛋白。肠道不同部位的sst2A细胞数量存在很大差异。Sst2A细胞对应于定义的细胞群，但它们不一定与神经内分泌细胞群平行。在肠上皮中，sst2A阳性细胞为神经内分泌细胞。在胃窦中，sst2A细胞主要代表神经内分泌胃泌素细胞，而在下肠神经内分泌上皮细胞中不表达sst2A。然而，sst2A受体在整个胃肠道的粘膜下神经丛和肌肠神经丛中都有清晰的表达，这一发现扩展了我们之前对人类结肠神经丛中sst2A细胞的免疫组化观察。7
sst2A抗体R2-88先前已被很好地描述，并显示出对sst2A受体高度特异性11在动物和人类组织，并与其他方法，如体外sst放射自显影或mRNA原位杂交有良好的相关性。12本研究进一步强调了该抗体的优良特性:体外受体自放射成像与胃窦免疫组化之间的良好相关性，其中sst2A细胞密集且数量足以产生自放射信号;不同恶性肿瘤和不同炎症性病变患者手术样本正常部分结果一致;以及其他免疫组化标记对sst2A细胞的明确表征。
在前肠上皮和整个胃肠道的神经丛中检测到sst2A细胞，增加了我们对人体生长抑素生理作用所涉及的细胞机制的理解。虽然关于生长抑素在小鼠和大鼠胃肠道中的作用已有大量信息，15 -21使用人类组织进行直接调查是必要的，以推断从动物到人类，因为肽和肽受体的物种差异被广泛观察到。5在人类前肠(胃至空肠近端)中，胃窦胃泌素细胞上的sst2A受体蛋白可能是生长抑素抑制胃泌素分泌的分子基础。22通过生长抑素细胞投射到胃泌素细胞的细胞质过程介导的旁分泌方式。23在啮齿类动物中，尚无证据表明sst2A在胃窦胃泌素细胞中表达。21相反，在啮齿动物中有充分的证据表明，生长抑素通过sst2A受体对顶叶细胞和ECL细胞起多种作用17日,20.21(Reubi未发表的数据)而我们目前的人类数据并不表明生长抑素通过sst2A在身体细胞中起作用。然而，正如最近体外受体自放射成像数据所表明的那样，生长抑素在人胃体中的作用可能是由sst1介导的。2目前的人类数据明显支持生长抑素通过sst2A在胃泌素细胞水平上的主要作用:大量表达sst2A的胃泌素细胞和在不同组织样本中标记的一致性可能强调了这种机制在人类组织中的重要性。因此，目前的数据清楚地表明，在人类和啮齿动物之间，sst2A受体在胃中的位置存在物种差异。在十二指肠和空肠近端，sst2A细胞总是代表神经内分泌细胞，最常见的亚型是胃泌素细胞。在中肠(空肠远端到盲肠)和后肠(结肠和直肠)，分别在上皮中发现很少或没有sst2A细胞，生长抑素的作用可能主要是由神经丛粘膜下和肌肠神经细胞上的sst2A受体介导的。这些受体遍布胃肠道的神经丛，可能是sst2介导的生长抑素抑制肠道运动的分子基础。24 -26这些在神经丛粘膜下也可能代表的分子基础生长抑素抑制结肠离子分泌，如在人体外模型显示27去除结缔组织的结肠组织样本。粘膜下神经丛是我们在结肠粘膜和粘膜下层唯一检测到sst2A细胞的位置。在啮齿类动物中，在这个位置也发现了sst2A阳性细胞。20.
目前的研究能增加我们对肠道神经内分泌肿瘤致癌的理解吗?虽然人类肠道的特定区域有大量含有sst2A受体的细胞，但我们的数据显示，其他区域，如胃体以及中肠和后肠，在非肿瘤上皮中没有或很少有sst2表达细胞。有趣的是，中肠和后肠是大多数肠道神经内分泌肿瘤的区域28出现，这些特征为sst2受体的高表达。基于本研究在中、后肠中发现的sst2表达细胞，因此很难确定中、后肠神经内分泌肿瘤的细胞来源。14日,29 -34然而，在胃体中，神经内分泌肿瘤主要是高sst2表达的ECL细胞肿瘤，35有人可能会推测，正常ECL细胞中sst2A的缺失(即使在那些患有sst2A阳性肿瘤的患者中)表明ECL细胞肿瘤和侵袭前增生病变可能会重新表达sst2。