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背景:Hephaestin是multicopper铁氧化酶从肠上皮细胞基底所需传输的铁。性贫血有关(sla)老鼠有一个缺陷在铁从肠肠上皮细胞进入血液循环的释放由于间隙hephaestin基因删除(heph)。
结果:我们已经表明,hephaestin主要是局部的核上的车厢在肠肠上皮细胞和培养细胞。在正常的肠肠上皮细胞,hephaestin也出现在基底外侧表面。在sla老鼠,hephaestin在场只有在核上的隔间。相比之下,铁通透酶Ireg1局部控制和基底外侧膜sla老鼠。
结论:我们建议mislocalisation hephaestin可能导致功能缺陷sla肠道上皮细胞。
- 铁
- 肠
- 性贫血有关
- 贫血
- haemochromatosis
- 惠普,hephaestin
- Cp,血浆铜蓝蛋白
- sla、性别与贫血
- 总和生育率,转铁蛋白受体
- 轻拍3 3′-diaminobenzidine
来自Altmetric.com的统计
肠道吸收铁是调节全身铁水平的关键步骤,因为哺乳动物具有排泄多余的铁的能力有限。1尽管铁是至关重要的许多蛋白质的功能,铁催化的能力的形成活性氧可能有助于病理损伤。2继承干扰细胞和全身铁稳态说明关键需要维护一个平衡不足和过度的金属。3在哺乳动物细胞中,精心设计的监管机制存在调节铁条目,胞内封存,并动员。4 -6最近的识别关键组件的肠道铁运输透露洞察分子全身铁稳态的调节机制。6
其中一个组件是hephaestin (Hp)膜结合同系物的血浆铜蓝蛋白(Cp)所需铁肠上皮细胞的出口。以前,我们发现这本小说蛋白质中有缺陷的小鼠性贫血有关(sla)。7顶端的肠上皮细胞吸收的铁sla老鼠是正常的基底,但出口却降低了,导致铁在肠上皮细胞堆积。89sla老鼠包含inframe删除582基地Heph基因导致截断蛋白质。10惠普已经像Cp氧化酶活动11这可能会促进铁出口从小肠到等离子体712它在哪里发现绑定转铁蛋白的铁(III)。惠普可能协同工作管基底位于铁(II)透性酶,Ireg1(也称为或MTP1运铁素),13 -15出口铁肠上皮细胞。16例如,氧化铁(III)被惠普可能直接从Ireg1协助释放铁或间接通过维护一个铁(II)梯度。Cp的活动17 -19和年代酵母multicopper铁氧化酶Fet3p20.21铁运输是至关重要的。有趣的是,一个功能性Fet3p合适的质膜需要本地化的酵母铁进口国Ftr1p高亲和力。22
在这里,我们表明,惠普主要坐落在顶端核上的和成熟的肠肠上皮细胞基底膜。惠普的截断版本sla老鼠只在一个核上的检测细胞内的隔间。针对Ireg1不受影响的sla鼠标和基底预测的位置被发现。我们建议不当本地化的惠普导致基底铁运输的缺陷sla老鼠。
方法
抗血清hephaestin Ireg1
我们使用两个亲和纯化anti-Hp肽抗血清为惠普我们以前演示了具体来自多个物种没有交叉杂交Cp。10惠普与Cp相比,具有一个C末端跨膜域和胞质域(图1)。一个抗血清,Hp1a,长大对C肽对应终端15个氨基酸(QHRQRKLRRNRRSIL),预测在细胞质膜的表面。第二抗血清,Hp1b,长大肽氨基酸对应435 - 52 (AFQDETFQERVHQEEETH)鼠标惠普(加入基因库:AAD16035)。这个序列驻留在惠普域2,23同源建模预测的是位于溶剂惠普的访问部分蛋白质。23的sla鼠标包含删除192个氨基酸(黑色在图1所示),不包括的地区抗血清。亲和纯化兔anti-Ireg1 (CGKQLTSPKDTEPKPLEGTH)抗血清是使用相同的协议。之前我们已经证明了Ireg1特异性的抗血清。10
细胞免疫染色
MDCK细胞种植在Transwell过滤器(Costar-Corning生命科学,阿克顿,马萨诸塞州,美国)和Cos7 HT29细胞种植在LabTekII室幻灯片(Nalge Nunc国际,罗彻斯特,纽约,美国)在杜尔贝科修改鹰的媒介。Non-differentiated HT29细胞生长在本人的媒介,直到confluency 70%。手机媒体补充10%胎牛血清和1% penicillin-streptomycin鸡尾酒。细胞在4%多聚甲醛固定20分钟。细胞渗透了0.25%皂苷(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),0.7%的牛血清白蛋白(σ),和0.7%的正常山羊血清(Cappel-MP生物医药公司,欧文,加利福尼亚,美国)。中小学正常山羊血清抗体稀释在1%,0.7%牛血清白蛋白,0.1%皂素。兔子antimouse 1 Hp抗体(1:200)观想使用一只山羊AlexaFluor488 antirabbit IgG抗体(分子探针和细胞核呈现propidium碘;分子探针,尤金,俄勒冈州,美国)或4′6-diamidino-2-phenylindole(分子探针)染色。Co-immunolocalisation研究涉及以下抗血清:老鼠antimouse-CD71(转铁蛋白受体(Tfr))为核内体(美国北卡罗来纳州Serotec,罗利);鼠标anti-TGN38 trans-Golgi网络(转导实验室、BD生物科学、圣何塞,加利福尼亚,美国); mouse anti-GM130 for cis-Golgi (Transduction Laboratories); mouse anti-BiP/GRP78 for endoplasmic reticulum (Transduction Laboratories); rat anti-H69 for rough endoplasmic reticulum (Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, Iowa, USA); mouse anti-Na+K+质膜atp酶(发展研究杂种细胞银行);老鼠anti-ABL70内侧高尔基池(发展研究杂种细胞银行);核内体和鼠标antisyntaxin 13 (Stressgen,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。Alexa 594贴上antirat antimouse免疫球蛋白(分子探针)被用作辅助抗血清。f -肌动蛋白HT29细胞是沾1:4000罗丹明phalloidin(分子探针,r - 415)在室温下一个小时。细胞被检查在100×尼康E800显微镜放大,通过现场II数码相机拍摄的图像。共焦图像视觉效果和捕获Z系列使用Bio-Rad共焦显微镜。
免疫染色的惠普和Ireg1小鼠十二指肠部分
的sla老鼠最初来自杰克逊实验室(美国缅因州巴尔港)和维护C57BL / 6 j背景昆士兰理工学院的医学研究和加州大学伯克利分校(美国加州)九年之前。从C57BL / 6 j小鼠十二指肠或sla老鼠孤立和固定12 - 14小时Bouins固定剂(σ),器官在70%乙醇洗,脱水,石蜡嵌入式,切割(8μm)如前所述。27部分应用使用标准程序与亲和纯化抗血清的C末端惠普(1 a)或Ireg1at 1:200稀释和增强与ABC精英向量污点衬底工具包(美国加州向量实验室,伯林盖姆)使用制造的协议。染色呈现了3 3′-diaminobenzidine(民建联衬底设备;矢量实验室)和吉尔的苏木精复染色2号(Polysciences Inc .沃灵顿,宾夕法尼亚州,美国)包括镍惠普染色的解决方案。肽阻断研究anti-Hp1a 1:200 preadsorbed 10−5相同肽(肽的抗血清长大)48小时在4°C,然后使用如上所述。Co-immunolocalisation用鼠标anti-Na+K+atp酶对细胞培养是如上所述。使用尼康E800显微镜检查部分使用现货II数码相机和图像捕获。
结果
主要核上的本地化hephaestin培养细胞
免疫荧光研究亲和纯化惠普的多克隆抗血清培养犬肾(MDCK)和肠(HT29)细胞系表现出主要标准的文化条件下核上的分布(无花果2和3)。共焦的MDCK细胞(图2)表明清楚核上的染色(绿色)抗血清C末端的惠普。同样,核上的染色HT29细胞被认为在标准培养条件与抗血清C终端和N终端区域的惠普。因此,我们得出的结论是,惠普主要是局部在培养细胞的核上的位置。
顶端的核上的位置hephaestin MDCK细胞(Hp)。共聚焦免疫荧光显微镜进行了使用一个亲和纯化抗血清C末端的惠普培养MDCK细胞。惠普在绿色和核染色是红色的。序贯共焦重建从底部(A) (D)细胞的顶部显示主要是惠普的顶端细胞核周围的染色。
顶端的核上的位置hephaestin HT29细胞(Hp)。(一)免疫荧光显微镜使用的亲和纯化抗血清C末端的惠普(Hp1A)培养HT29细胞。(B)免疫荧光显微镜使用的亲和纯化抗血清N末端的一部分惠普(Hp2a)在培养HT29细胞。单个细胞所示左面板和几个细胞板右边所示。惠普染色所示绿色,红肌动蛋白,蓝色细胞核。
Colocalisation研究表明回收内体和/或cis-Golgi惠普的位置
识别包含惠普的亚细胞室,我们进行colocalisation研究一系列的抗血清细胞器特定标记蛋白质,在方法部分详细。Cos7细胞被使用,因为它们表达丰富的惠普和有一个大胞浆/核率。这些研究表明,惠普colocalises回收内体舱被总和生育率(图4)。也有相当大的colocalisation cis-Golgi舱被GM130的标志(图4)。
Colocalisation hephaestin (Hp)与亚细胞标记。Colocalisation亲和纯化抗体的C末端惠普(Hp1A)和各种亚细胞标记抗体在CoS7细胞培养。惠普在绿色和染色表示标记(GM130,总和生育率,TGN38毕普H69, Na, K-ATPase, MGCP,和突触融合蛋白13)红色所示。黄色的覆盖表明colocalisation。呃,内质网;r,粗面内质网;总和生育率,转铁蛋白受体。
基底核上的和hephaestin在肠上皮细胞的位置
我们调查的细胞本地化惠普在C57BL / 6 j小鼠。免疫荧光研究显示十二指肠肠上皮细胞的顶端核上的信号(图5 a, C)被大量的肽或没有血清吸附大量的肽(图5 b)。鉴于惠普在基底外侧出口铁的作用,我们进行了colocalisation研究使用惠普和基底外侧标记抗体Na+K+腺苷三磷酸酶。令人惊讶的是,这些研究表明小重叠两种蛋白质(图5 d)。我们得出结论,大部分惠普蛋白质位于顶端在C57BL / 6 j小鼠核上的隔间。
主要核上的位置hephaestin十二指肠肠上皮细胞(Hp)。Immunofluorescent染色从C57BL / 6 j小鼠十二指肠部分控制饮食使用抗血清的C末端惠普主要核上的染色。(一)惠普(绿色)。(B)预孵化与惠普肽。(C) Propidium碘染色细胞核(红色)和惠普染色(绿色)。(D) Immunolocalisation惠普(绿色)和Na+K+腺苷三磷酸酶(红色)。
虽然免疫荧光研究使用新鲜冷冻和PFA的固定组织提供了一种优秀的方式检测蛋白质的主要位置,次要少丰富蛋白质的数量可能会被忽视。因此我们使用石蜡包埋肠道部分和avidin-biotin复杂的辣根过氧化物酶染色DAB染色紧随其后。如图6 a和B所示,这种方法显示,惠普在场外侧表面的C57BL / 6 j小鼠肠上皮细胞以及丰富的顶端核上的位置。
基底缺乏hephaestin (Hp)在十二指肠肠上皮细胞性贫血有关(sla老鼠)。3、3′-Diaminobenzidine十二指肠部分使用抗血清的免疫组织化学惠普的C末端。(一)100×C57BL / 6 j (WT)十二指肠部分;(B) 3×放大盒装面积(A),箭头表示侧(左)和核上的(SN)染色。(C) 100×sla十二指肠的部分;(D) 3×放大(C)的盒装区域。箭头表示核上的(SN)染色。没有明显的横向染色。
Hephaestin在sla老鼠主要是细胞内
形成鲜明对比,惠普的表情sla老鼠是局限于基底核上的位置没有明显的染色(图6 c, D)。没有惠普基底外侧膜可能有助于减少转移的铁进入循环,导致缺铁sla老鼠。
Ireg1在sla老鼠位于基底膜
地址是否不恰当的本地化的惠普sla导致Ireg1定位的变化,我们immunolocalised Ireg1 C57Bl6 / J类型和肠肠上皮细胞sla老鼠(图7)。我们发现Ireg1基底外侧表面的控制和突变小鼠肠上皮细胞。我们得出这样的结论:不适当的本地化惠普并不影响Ireg1蛋白质的位置。
管基底Ireg1在十二指肠肠上皮细胞sla老鼠。3、3′-Diaminobenzidine Ireg1十二指肠部分使用抗血清的免疫组织化学。(一)100×C57BL / 6 j (WT)十二指肠部分;(B) 3×放大的盒装地区(A),箭头表示横向(L)染色。(C) 100×sla十二指肠的部分;(D) 3×放大的盒装地区(C)。
讨论
我们建议惠普铁氧化酶活动可能是必要的有效释放铁后的运输通过基底外侧膜铁转运蛋白Ireg1。7我们发现惠普的肠肠上皮细胞的基底膜提供了支持这一假说。然而,主要的顶端核上的位置在多个培养细胞系和成熟的肠上皮细胞表明细胞内贩卖惠普,额外的细胞内功能,或两者兼而有之。确切的细胞室仍不确定作为immunolocalised惠普并没有与任何一个完全colocalise细胞器标记。相当大的重叠与转铁蛋白受体(Tfr)表明,循环内体但cis-Golgi仍然是一个可能性,或两个位置。惠普预计是multicopper铁氧化酶基于序列相似性与Cp和保护的结构特点。23铜是高尔基体组装成Cp28它是合理的建议铜也纳入惠普在这一点上。高尔基发现惠普可能反映这个装配过程。本地化在回收核内体更难以解释,表明惠普,总和生育率,可能周期基底外侧膜和回收内体之间,与大量的蛋白质在任何时候在核内体。或者,核上的舱可能不代表回收内体或cis-Golgi但未知函数的不同的隔间。惠普的功能作用,如果有的话,在这个位置是未知的,尤其是Ireg1没有找到在这个位置。
尽管inframe间隙删除删除192个氨基酸,sla老鼠仍然产生截断惠普蛋白质。10在sla只老鼠,惠普位于(我们的检测范围内)在核上的隔间。没有惠普的基底膜sla老鼠,因此其与基底位于Ireg1交互不可用,可能导致观察到的铁运输的缺陷sla。例如,Ireg1可能减弱射流能力没有惠普。惠普的核上的本地化sla可能导致本构不适当的本地化的截断惠普蛋白质。突变蛋白可能不适当折叠导致核上的区域或地区保留删除sla基底可能包含必要的目标信息。相比之下Fet3p / Ftr1p复杂的酵母中适当的本地化Ftr1p (Ireg1功能orthologue)质膜取决于功能Fet3p (hephaestin-like分子),22基底外侧Ireg1的位置sla表明适当的针对Ireg1并不依赖于惠普。
确认
这项工作是NIH 5-R01-DK57800赠款支持,NIH 5-R01-DK56376, K08 DK2823简历和NIH R01 - DK047192詹。詹。霍华德休斯医学研究所的研究员。抗体由托马斯得到8月和詹姆斯·希尔德雷思则表示杂种细胞发育研究银行的赞助下研究所开发和维护由爱荷华大学,生物科学,爱荷华州的城市,是52242年美国。