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摘要
背景与目的:坏死性小肠结肠炎(NEC)是一种潜在的破坏性疾病的早产儿，但其病因尚不清楚。这些研究的目的是建立新生儿仔猪NEC模型，然后利用该模型研究血小板激活因子(PAF)在其发病机制中的作用。
方法:将麻醉的新生仔猪分为6组:(i)对照组和(ii)缺氧组，(iii)脂多糖(LPS)组，(iv)缺氧+LPS组，(v)缺氧+LPS和PAF拮抗剂WEB 2170组，(vi) PAF组。记录动脉血压(ABP)、肠系膜上动脉血流量(MBF)、肠系膜血管电导(MVC)、动脉血气，并评价肠道组织学。
结果:暴露于LPS、缺氧+LPS或PAF均可引起肠出血性病变，并伴有不同程度的肠损伤。PAF引起MVC和MBF的初始显著降低，而缺氧+LPS引起ABP和MBF的晚期显著降低，并有MVC降低的趋势。低氧+LPS对血流动力学改变和肠道损伤的影响通过WEB 2170得到改善。
结论:在新生仔猪中给予缺氧和LPS或PAF可引起与NEC一致的血流动力学改变和肠道病变。这些影响可以通过先前使用WEB 2170得到改善，这表明PAF在NEC发病机制中起着重要作用。
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- 血小板激活因子
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- PAF，血小板激活因子
- 有限合伙人,脂多糖
- ABP，动脉血压
- PSA，猪血清白蛋白
- MBF，肠系膜血流量
- MVC，肠系膜血管导通
- SMA，肠系膜上动脉
- WBC，白细胞
数据来自Altmetric.com
坏死性小肠结肠炎(NEC)是发生在新生儿中最常见的危及生命的胃肠急症。它可以影响5%的新生儿重症监护住院患者，死亡率为20-40%，1 -3.尽管新生儿重症监护和存活率总体上有所改善，但这一数字并未下降。4 -6除了高死亡率外，NEC还与疾病本身导致的严重长期发病率相关，7还有长期肠外营养的并发症，多次手术，短肠综合征。8尽管有这些令人震惊的统计数据，NEC的发病机制仍然不清楚，也没有具体的治疗方法。
在过去的20年里，许多潜在的病因被假设，随后被反驳。然而，四种临床危险因素中至少有一种几乎是不可避免的:早产;肠内喂养;缺氧/缺血;以及肠道细菌定植。13.9这些因素似乎可能单独或共同起作用，但无论明显的起始因素是什么，NEC的后续病理都是相似的，这表明它们可能触发相同的最终共同通路。210
最近，实验证据表明，炎症介质，特别是血小板激活因子(PAF)在这一最终的共同通路中发挥重要作用，在NEC的发病机制中起着至关重要的作用。11 -14PAF是一种内源性磷脂介质，具有很强的促炎和生物学作用。1516PAF的释放由各种刺激引起，包括缺氧和内毒素血症。17PAF在体内的半衰期很短，16并被PAF特异性酶乙酰水解酶迅速降解。1617然而，PAF的产生可以通过正反馈循环上调，它也可以刺激其他促炎物质的产生。18因此，一旦开始生产PAF，其影响可能是持久和多样的。
在对成年大鼠的研究中，外源性PAF可产生与NEC相当的严重、持续、全身低血压和随后的肠坏死;当与内毒素一起服用时，这种效果会加剧。11对成年大鼠的进一步研究表明，全身缺氧，14内毒素,12两种侮辱的结合13导致内源性PAF的产生增加和肠损伤，而先前给药PAF拮抗剂可以改善这种损伤。1314还开发了新生儿大鼠NEC模型，采用人工喂养、肠道细菌定植和反复窒息相结合的方法。19在该模型中，当PAF拮抗剂与实验损伤同时给予时，肠道病变显著减少。20.
然而，人类和啮齿动物胃肠道解剖和生理之间缺乏相似性，这意味着在从大鼠中推断数据时应极其谨慎。因此，我们认为在新生仔猪中诱导NEC的模型可能与人类的情况更相关，因为仔猪和人类新生儿之间有许多解剖和生理上的相似性。2122重要的是，当比较新生儿肠道时，仔猪和人类在大小、出生时的成熟程度以及胃肠道的解剖和组织学配置方面非常相似。2122这使得猪被描述为普通实验室物种中为人类婴儿创造生理模型的最佳动物，21尤其是在研究胃肠道的时候。22
因此，本研究的目的是建立新生仔猪NEC模型，并研究PAF在其发病机制中的潜在作用。
方法
动物
选用27头足月新生儿堪培拉白仔猪。在研究时，它们的中位年龄(范围)为3天(2-6天)，体重为1997克(1465-2270)。所有实验都是根据英国内政部1986年颁布的《动物(科学程序)法》进行的。试验开始前2-3小时母猪正常喂养动物。Elnazir和他的同事描述的那样，对每只动物都进行了麻醉诱导和维持。23
有效的协议
简单地说，3-5%的含氧氟烷(Rhodia Organique Fine Ltd, Avonmouth, UK)以3.5 l/min的速度最初注入麻醉箱，然后通过面罩。麻醉诱导后，插管，维持麻醉，O2当颈静脉插管时。然后停止吸入麻醉，静脉输注番沙芬维持麻醉(Pitman-Moore, Uxbridge, UK)。最初，将4 - 8毫克/公斤的藏红花用生理盐水稀释至4毫克/毫升的引物剂量以小剂量给予。然后，术中以16-24 mg/kg/h连续静脉输注相同浓度的番红花，实验期间以7-12 mg/kg/h静脉输注。番红花是一种短效类固醇药物，可以连续输注，以达到稳定的麻醉镇痛水平。之所以选择这种药物，是因为它比其他常用的麻醉剂更有效地保留了心血管系统的中枢神经控制。23一旦麻醉建立，在整个实验过程中，通过动物下方的热垫和上方的热灯，持续监测直肠温度并将其保持在38.5-39.5°C。
通过气管内管末端的呼吸流量头记录呼吸变量，并与肺活量计连接，从而连续记录呼吸频率和潮气量。通过股动脉插管记录动脉搏动血压(ABP)，从而得出心率。股静脉也插管，导管进入下腔静脉，允许中心静脉给药。
然后通过中线切口进行剖腹手术。我们发现了一个颅(上)肠系膜动脉(SMA)分支，并通过仔细的解剖分离出该SMA。然后在SMA周围放置一个周长5或6毫米的袖口型电磁流量探头(Carolina Systems Inc.， King, North Carolina, USA)，用于连续记录肠系膜血流(MBF)。通过暂时堵塞血管，流量探头被调零。将肠道处理保持在最低限度，并将浸泡在温(38°C)生理盐水中的纱布拭子覆盖暴露的肠道。一旦流量探头在原位，肠被送回腹腔和切口关闭。
闭腹后，稳定期为60分钟。
所有生理变量在40 Hz下采样，并通过MacLab/8e系统(AD instruments Ltd, Oxon, UK)在PowerMac 4400/160上采集。通过ABP分割MBF实时计算肠系膜血管导度(MVC)。
试验协议
这些动物被分为六组。实验方案在所有生理记录稳定后开始，包括三个45分钟的周期。
NEC模型的开发
组1(对照组;n = 4)在试验期(T0)开始时，通过中心静脉静脉注射1 ml/kg猪血清白蛋白(PSA)。
组2(缺氧组;n = 3)。这些动物从T0开始的前45分钟呼吸室内空气。接着呼吸45分钟10%的氧气，然后再呼吸45分钟室内空气。
组3(内毒素(脂多糖(LPS))组;n = 4)全身自发呼吸室内空气，T0时经股静脉注射LPS (2 mg/kg)。
组4(缺氧/内毒素组(缺氧+LPS);n = 6)遵循与组2相同的方案，但在T0时也与组3一样接受LPS剂量。
巴空军的作用
组5(缺氧+ LPS + WEB小组;n = 5)与第4组相同，给予LPS和缺氧治疗。然而，该组在T0前10分钟经股静脉注射PAF拮抗剂WEB 2170 10 μg/kg。该剂量是根据先前描述的治疗活性选择的24接下来是初步实验。
组6(组;n = 5)小鼠全程自主呼吸室内空气，T0时静脉注射5 ~ 7.5 μg/kg PAF。所选择的PAF剂量范围与NEC大鼠模型中使用的剂量范围相当。11第一个动物的剂量为5 μg/kg，后四个动物的剂量为7.5 μg/kg。
血液和组织取样
在整个实验过程中，每隔一定时间抽取动脉血样。分析了pH值和动脉PO值2和PCO2(P一个O2和P一个有限公司2分别使用IL1640分析仪(Instrumentation Laboratories, Warrington, Cheshire, UK)和使用MaxM Coulter计数器(Beckman Coulter, USA)进行外周血计数。所有实验在T0后135分钟结束，用致死剂量戊巴比通钠处死动物。胸部和腹部器官立即被切除。用10%中性缓冲福尔马林灌注从食管至直肠的胃肠道管腔，然后将所有器官置于缓冲福尔马林中，直至病理检查。固定后，从外部检查肠道是否有明显病变，特别是点状或直接出血。浆膜病变的识别和测量。由一名病理学家采集组织样本:对浆膜病变进行活检，并在整个小肠和大肠中每隔10 - 15cm进行连续活检。在所有病例中，还从肝脏、肾脏、肺、心脏和胃中采集了样本。切片厚度为4 μm，用苏木精和伊红染色。
切片然后由两名病理学家检查，他们对研究组不知情。对每例最严重的肠道损伤进行组织学评估，评分为0-4分:0 -无明显异常;1-mild异常;2-moderate异常;3 .重度异常(局部);重度异常4例(一般)(见表1)。
药物制备细节
(i) PSA在实验当天上午用生理盐水新鲜配制，浓度为2.5 mg/ml，冷藏保存，待使用。
(ii) PAF (1- o-烷基-2-乙酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱;Sigma-Aldrich, Gillingham, UK)由冻干形式与乙醇的浓度为2毫克/毫升。将该溶液分成100 μg等分液(50 μl)，置于- 70℃Eppendorf管中保存。实验当天，将PAF在氮气中解冻干燥后，用PSA配制新鲜的PAF溶液。使用前，将PAF溶解在PSA中至7.5 μg/ml。
(iii)来自大肠杆菌血清型026:B6 (Sigma-Aldrich)通过溶解在新鲜制备的生理盐水中，使其浓度达到4mg /ml。
(iv) WEB 2170 (Bepafant;(5) - 2-chloro-phenyl 3 4-dihydro-10-methyl-3 - [(4-morpholinyl)羰基]2 h, 7 h -cyclopenta(4、5)thieno [3 2 -f][1、2、4 triazolo - [4 3 -一个[1,4]二氮平])(来自德国勒沃库森拜耳公司的慷慨礼物)在无菌去离子水中稀释至60 μg/ml。所有溶液在使用前存放在冰中，注射前置于室温。
统计分析
所有生理数据随后通过在MacLab上记录的30秒样本的平均值进行分析，并表示为平均值(SEM)。采用Statview计算机软件包(第5版;SAS研究所，Cary, North Carolina, USA)，以分别测试基线和组间的差异。所有情况下，p值<0.05被认为是显著的。
结果
剖腹手术对所有动物均有良好的耐受性。在手术过程中以及随后的60分钟术后稳定期，生理变量保持稳定。
血液动力学的变量
在对照组(组1)中，所有记录的生理变量在实验期间保持稳定(见图1,2)。在其他组中，注意到以下情况。
研究组的生理参数。(A)血压(ABP);(B)肠系膜血流量(MBF);(C)肠系膜血管导度(MVC)。记录值与对照组显著差异:†††p<0.001。该组记录值与基线值之间的显著差异:**p<0.01， ***p<0.001。PAF，血小板激活因子;有限合伙人,脂多糖;Web, Web 2170。
所有研究组动脉pH值的变化。与对照组的数值有显著差异:†††p< 0.01，†††p<0.001。该组记录值与基线值之间的显著差异:*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001。PAF，血小板激活因子;有限合伙人,脂多糖;Web, Web 2170。
血压
在缺氧组(组2)中，整个实验过程中血压没有变化。然而，在LPS暴露组(第3组)中，在45分钟和90分钟的平均ABP显著下降(p<0.01)，但在实验结束时恢复到基线水平。在缺氧+LPS组(组4)中，ABP在实验结束时出现了中度但不显著的下降(见图1)，但在缺氧+LPS+WEB组(组5)中，平均ABP没有显著变化。PAF组(第6组)在给药后立即出现短暂的低血压(仅持续30秒)。在此期间还出现短暂的心动过缓和呼吸暂停。
肠系膜血液流动
在缺氧和LPS组(第2组和第3组)，MBF无明显变化。相比之下，MBF在缺氧+LPS组(第4组)稳步下降，并在90分钟和135分钟显著降低(p<0.01和p<0.001)。而在缺氧+LPS+WEB组(组5)中，MBF无明显变化(图1)。
在PAF组(第6组)，注射PAF后MBF立即下降，并在至少15分钟内显著降低在基线的30%左右(p<0.001)，并在接下来的50分钟内逐渐恢复到基线。MBF的下降可归因于MVC的减少(见图1)。
血气分析
动脉血气分析(P一个O2P一个有限公司2， pH)在整个实验过程中保持稳定。
所有缺氧组(2组、4组和5组)在呼吸10%氧气的45分钟内出现了相似程度的低氧血症。在这些组中，P一个O2从实验开始时的68 (2.0)mm Hg下降到90分钟时的40 (2.0)mm Hg;意味着P一个O2这些组在缺氧期后恢复到68 (6.3)mm Hg。P含量无显著性差异一个O2在实验过程中随时测量这些缺氧组之间的数据。
P一个有限公司2在整个实验过程中，所有组的测量值基本保持稳定，组间在任何时候都没有显著差异。
各组基线pH均为7.40(0.01)。在对照组和缺氧组(第1组和第2组)中，pH值在实验结束时呈上升趋势(图2)。
LPS组(第3组)pH值无显著下降，但缺氧+LPS组(第4组)平均pH值有所下降，90分钟时pH值显著低于对照组(p<0.01)，但在实验结束时略有恢复。缺氧+LPS+WEB组在一定程度上改善了这种影响(组5，图2)。PAF组(组6)在15分钟后出现代殖性酸中毒，平均pH值从7.43(0.01)下降到7.29 (0.04)(p<0.01)，持续到45分钟，但在90分钟后恢复(图2)。
血液学的分析
与对照组相比，在实验期间获得了以下结果:(i)在任何组中血红蛋白都没有显著变化;(ii)接受内毒素治疗的各组(第3、4和5组)白细胞(WBC)计数显著下降;p<0.001)，但缺氧组和PAF组(2组和6组)无显著变化。观察到的白细胞下降是由于中性粒细胞减少所致;(iii)组2、3、4和5的血小板计数有轻微但统计学意义上的下降(p<0.05)，但PAF组(组6)没有。血小板计数从未<350×109/l在任何时间的任何组
病理分析
宏观和微观检验表明,肠道对照组和低氧组(组1和2)是正常的(表2)。有限合伙人的宏观检验,缺氧+有限合伙人,和拥堵的组(组3、4、6)显示与控制相比,小型和大肠的浆膜表面有一个统一的昏暗的变色,且分散出血病变从0.1到10厘米长在场:绝大多数是局部的回肠和盲肠。这些组的肠道显微镜检查显示了表1所述的一系列病理特征。PAF组病变更严重，包括透壁出血性坏死。当比较第3组和第4组的肠损伤时，LPS单独倾向于引起离散的局部出血病变，而缺氧+LPS导致更广泛的出血。在任何标本中都没有血栓形成的证据。
WEB 2170对缺氧+LPS的影响具有强大的保护作用。与缺氧+LPS组明显的宏观和组织学改变相反，缺氧+LPS+WEB组肠道表面表现正常。事实上，在缺氧+LPS+WEB组(组5)中，除1只动物外，其余动物的肠道组织正常。在这只特殊的动物身上，只有一个直径小于1mm的点状出血——肠道的其余部分是正常的。
其他主要器官(心、肺、肝和肾)切片也进行了显微镜检查，各组均未发现异常。
讨论
本研究表明，在新生仔猪中，缺氧和内毒素的联合损伤导致MBF减少，并引起肠道病变，这与早期NEC一致。这些反应通过预防性给药PAF拮抗剂WEB 2170得到改善，强烈暗示PAF是一个因果中介。PAF在NEC起始阶段的作用也与观察到的情况一致，即静脉注射PAF可产生选择性肠膜血管收缩，MBF显著下降，重要的是，肠出血性坏死，与人类新生儿NEC晚期高度相似。
在本研究中，仅全体性缺氧可引起轻微的血流动力学影响，在大体或显微镜水平上均未引起肠道组织学改变，而LPS可引起轻微的低血压和MBF下降，宏观和显微镜下均有肠道病变的证据。然而，缺氧联合LPS显著加重了血流动力学的改变，例如动脉压和MBF逐渐下降，部分原因是肠系膜血管收缩，并且与仅使用LPS相比，出现了更广泛的肠道病变。此外，这种联合侮辱在实验中产生了显著的代谢性酸中毒，这可能是肠道缺血的结果。这种反应模式似乎非常接近于模仿可能发生在人类新生儿早期NEC的病理生理过程。25值得注意的是，严重的全身性低血压不是人类NEC早期阶段的特征。这些发现与临床经验完全一致，当多个常见的NEC危险因素同时发生时，比单独发生时更有可能发生NEC。
此前有报道称，与NEC相似的肠道病变只能通过严重损伤在仔猪中产生:涉及肠系膜动脉结扎或阻塞的严重缺血;26日—28深刻的窒息;29或者腔内注射酸化酪蛋白。30.这些实验损伤都没有反映临床环境中发生的情况。据我们所知，我们的研究首次表明，通过结合临床上更合理的中度缺氧和内毒素血症的损害，可以在新生仔猪中产生nec样病变。
我们的研究发现，PAF受体拮抗剂WEB 2170的预防性给药可以改善缺氧+LPS诱导的血流动力学反应、代谢性酸中毒和NEC样病变，这为PAF与NEC有因果关系提供了强有力的证据。这与在成年大鼠中获得的证据一致，系统性缺氧14或内毒素12或者两者的结合13可导致内源性PAF产生。缺氧和LPS的联合损伤已被证明对大鼠低血压、MBF下降和内源性PAF产生具有协同作用。13这与我们的发现完全一致。
我们的发现支持了PAF是缺氧加LPS影响的因果中介因素的建议，外源性PAF给新生仔猪也产生了类似于NEC的血流动力学变化和肠道病变。事实上，这些血流动力学反应的时间过程不同，更严重，包括更早更剧烈的肠系膜血管收缩，肠道病变比缺氧加LPS引起的病变更严重，这并不出乎意料。将大剂量PAF注入体循环显然与身体组织内源性PAF释放的可能情况有很大不同。然而，观察到外源性PAF引起肠系膜血管强烈收缩，而动脉压没有明显升高，确实表明胃肠道特别容易受到其影响。外源性PAF引起的肠道病变不能归因于肠系膜血管收缩本身，当仔猪SMA完全闭塞60分钟后，在黏膜和粘膜下层可检测到肠道病变，但在肌层和浆膜层未检测到病变，27正如我们对巴空军的反应所观察到的那样。
鉴于PAF在体内的半衰期很短，16很可能是我们使用的外源性PAF通过正反馈循环刺激了内源性PAF的产生31外源性和内源性PAF都刺激了进一步炎症介质的产生。18所有这些介质的联合作用将解释更严重的肠坏死的发展，并具有NEC晚期的特征。我们现在假设，如果缺氧+ LPS诱导的肠道病变是由我们提出的内源性PAF启动的，那么整个过程将受到正反馈和其他细胞因子产生的进一步PAF的影响。根据这一假设，肠道病变的程度和伴随的血流动力学变化的严重程度取决于沉淀损伤的严重程度、产生的PAF增加的程度、损伤间隔的时间和观察的时间，也取决于可用于限制病理级联的天然抑制剂，如PAF乙酰水解酶。
NEC在成人中未见，在较大的婴儿中也很少见:新生儿，特别是早产婴儿，似乎特别容易感染这种疾病。232与成熟仔猪相比，新生仔猪的肠道血管系统在低血压和缺氧/缺血时保存组织氧合的能力较差。33 -36事实上，如果出生后肠道的高氧需求和内脏循环应对损伤能力的相对“不成熟”可能会使新生儿肠道更容易出现低氧血症或低灌流，这并不令人惊讶。我们现在已经证明，当同时出现时，两种可能发生在人类新生儿身上的损伤可以诱导新生儿仔猪发生与早期NEC非常相似的病理变化。此外，我们发现PAF与这些病理变化有关:PAF及其血管收缩剂和炎症作用可能进一步损害敏感的肠道血管，导致组织氧合降低，黏膜损伤，随后细菌入侵。
因此，我们提出一个非常相似的事件链发生在新生儿NEC。我们相信，在新生仔猪中使用这些实验性侮辱，为NEC的研究提供了一个模型，优于那些对新生大鼠或仔猪使用更严重的侮辱。1920.2829我们的证据表明，PAF与新生仔猪缺氧和LPS诱导的病理变化密切相关，这为进一步研究PAF在NEC中的作用提供了依据。PAF受体拮抗剂已用于成人胰腺炎的临床试验。37 -39目前还没有针对NEC的具体治疗方法，它仍然是新生儿发病和死亡的主要原因。现在需要进行研究，以确定当病理的早期临床症状刚刚显现时，PAF拮抗剂是否可以阻止新生仔猪的致病过程。
致谢
我们感谢Asif Ahmed教授的帮助，David Westwood先生，Steven Johnson先生和Karen Willis女士出色的技术支持，以及Anthony Lander先生对手稿的有益评论。